被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39對比格犬血清免疫指標及腸道菌群結構的影響

陳則東 郭書玉 朱建平 李子晗 盧 煒* 劉 蕾*

(1.江蘇農牧科技職業學院寵物科技學院，泰州 2225300；2.西華大學食品與生物工程學院，成都 2610039)

益生菌是一類在適當劑量下可以對機體健康產生有利作用的活的微生物。益生菌產品的使用在提高動物生產性能及預防、治療動物疾病方面發揮了重要作用。在實踐中，益生菌主要通過口服方式進入動物的胃腸道，在進入動物胃腸道過程中常常受到包括低pH、膽鹽、共生菌、致病菌競爭等不利因素的影響，導致有效活菌數量下降[1]。進一步提高益生菌的口服利用度、提升腸道定植成功率是益生菌利用研究的關鍵。被多糖蛋白復合物包裹的生物被膜態細菌，顯示出比浮游態細菌更好的腸上皮細胞黏附性能[2]及對酸、膽鹽等不利環境因素的耐受能力[3]，通過胃腸道后的存活率與荷載量大大提高[4]，為益生菌開發提供了新的思路。生物被膜成分包括細胞外DNA、蛋白質、多糖和脂類等物質[5]，與機體免疫、細菌黏附、定植、群體行為等密切相關，具有浮游狀態不可比擬的優勢[6]。研究表明，用黏附在生物相容性葡聚糖微球上的被膜態羅伊氏乳桿菌預防壞死性結腸炎，單次預防劑量給藥可使疾病的發生率降低50%，顯示出生物被膜態益生菌開發利用的光明前景[7]。此外，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)被膜成分的胞外多糖可以拮抗致病菌對細胞的黏附，抑制致病菌生物被膜形成，發揮調節宿主免疫及腸道菌群結構的功能[8]。然而，目前關于被膜態益生菌對宿主免疫功能及腸道菌群結構的研究尚極其匱乏，亟待深化研究。因此，本研究旨在比較被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39的耐酸和耐膽鹽能力及其對比格犬血清免疫指標及腸道菌群結構影響的差異，并進一步通過相關性分析揭示腸道菌群結構與免疫因子之間的關聯，為揭示被膜態益生菌的調節作用研究提供參考，并為動物用新型益生菌制劑的研發提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

15只比格犬，3.5月齡，由揚州四方實驗動物科技有限公司提供，籠養于江蘇農牧科技職業學院實驗動物房，自由飲水，早晚各采食比瑞吉品牌全價小型犬幼年期犬糧1次。

1.1.2 試驗菌種

植物乳桿菌LR-39，保存在中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)，保藏編號為CICC No.24811，其全基因組序列已提交至GenBank，登錄號為VRKS00000000。

1.1.3 試驗試劑

酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒均購自武漢默沙克生物科技有限公司，具體貨號如下：免疫球蛋白G(IgG)ELISA Kit(No.69-58623)、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA Kit(No.69-71642)、白細胞介素-6(IL-6)ELISA Kit(No.69-52361)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA Kit(No.69-22538)。Qiagen糞便腸道微生物DNA提取試劑盒購自杭州沃森生物技術有限公司，貨號：QlAamp DNA Stool Mini Kit(No.51604)。

1.1.4 試驗儀器

多功能酶標儀(Thermo公司，型號：VARIOSKAN LUX)、超低溫冰箱(Thermo公司，型號：905)、純水系統(Millipore公司，型號：Milli-Q Direct 8)、低溫離心機(湘儀離心機有限公司，型號：H1650R)、超低溫冷凍干燥機(上海田楓實業有限公司，型號：TF-FD-1L壓蓋型)。

1.2 試驗方法

1.2.1 被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39制備

被膜態植物乳桿菌LR-39制備：將活化的植物乳桿菌LR-39按1∶100比例接種于MRS液體培養基，置于細胞培養板中，37 ℃靜置培養36 h，5 000 r/min離心10 min收集菌體，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌3次，凍干保護劑重懸菌體至終濃度1×109CFU/mL，分裝至西林瓶。-80 ℃冰箱內預凍10 h后，置于真空冷凍干燥機中，-40 ℃、40 MPa冷凍干燥24 h，制備得凍干菌粉，以備后續試驗使用。

浮游態植物乳桿菌LR-39制備：將活化的植物乳桿菌LR-39按1∶100比例接種于MRS液體培養基，37 ℃、200 r/min培養36 h，5 000 r/min離心10 min收集菌體，PBS洗滌3次，凍干保護劑重懸菌體至終濃度1×109CFU/mL，分裝至西林瓶。-80 ℃冰箱內預凍10 h后，置于真空冷凍干燥機中，-40 ℃、40 MPa冷凍干燥24 h，制備得凍干菌粉，以備后續試驗使用。

1.2.2 被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39耐酸及耐膽鹽能力評價

制備浮游態和被膜態植物乳桿菌LR-39，將收集到的菌體分別重懸于pH為2.5的MRS培養基中，處理1 h，以測定被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39的耐酸能力；將被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39菌體分別重懸于膽鹽含量為0.2%(質量體積比)的MRS培養基中，處理0.5 h，以測定菌株的耐膽鹽能力。處理結束后通過平板計數法計算活菌數。試驗每組3個平行，且進行5次生物學重復。存活率計算公式如下：

存活率(%)=100×處理后活菌數/初始活菌數。

1.2.3 動物分組與處理

15只比格犬隨機分為被膜組、浮游組和對照組3個組，每組5只。被膜組、浮游組于每日早上采食犬糧后分別灌飼被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39菌液1 mL(1×109CFU/mL)，對照組灌飼等體積PBS，連續灌飼28 d。

1.2.4 血清免疫指標檢測

試驗進行28 d后，經前肢靜脈采集各組試驗犬的血液制備血清。依據ELISA試劑盒說明書測定血清IgG、sIgA、IL-6、TNF-α含量。

1.3 腸道菌群微生物多樣性分析

1.3.1 腸道菌群16S rDNA測序

試驗結束后，無菌采集犬新鮮糞便，按照Qiagen糞便腸道微生物DNA提取試劑盒說明書進行總DNA提取。取質量合格的基因組DNA樣品30 ng及對應的融合引物配制PCR反應體系，設置PCR反應參數進行PCR擴增，使用Agencourt AMPure XP磁珠對PCR擴增產物進行純化并溶于洗脫緩沖液，貼上標簽，完成建庫。

使用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫的片段范圍及濃度進行檢測。檢測合格的文庫根據插入片段大小，選擇HiSeq平臺進行測序，得到原始數據。

1.3.2 生物信息學分析

對測序原始數據進行數據過濾、Tags拼接、操作分類單元(OTUs)聚類，并與GreenGene數據庫比對、物種注釋；基于OTUs和注釋結果進行樣品物種復雜度分析、組間物種差異分析以及關聯分析等。

1.4 數據分析

運用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，試驗數據采用平均值±標準差表示。血清免疫指標的比較進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法檢驗；耐酸、耐鹽能力比較進行獨立樣本t檢驗；腸道菌群指標的比較采用Mann-Whitney檢驗；腸道菌群指標與血清免疫指標的相關性用Spearman相關系數表示。0.05≤P<0.10表示有顯著趨勢，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39的耐酸及耐膽鹽能力

菌株經口服攝入會通過消化道環境，胃腸道中的酸性及膽鹽環境會對菌株形成壓力。因此，菌株耐受胃腸道不良環境的拮抗能力對于菌株保持活性非常重要。本研究對植物乳桿菌LR-39在被膜態及浮游態2種狀態下的耐酸和耐膽鹽能力進行了比較分析。如圖1所示，被膜態植物乳桿菌LR-39經酸性和膽鹽環境處理后，其存活率顯著或極顯著高于浮游態植物乳桿菌LR-39(P<0.05或P<0.01)。以上結果表明，被膜態植物乳桿菌LR-39具有更強的抗環境脅迫能力。

PT：浮游組；BF：被膜組。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2 被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39對犬血清免疫指標的影響

由表1可知，與對照組相比，被膜組血清IgG和sIgA含量極顯著提高(P<0.01)；與浮游組相比，被膜組血清sIgA含量極顯著提高(P<0.01)，血清IL-6含量有下降趨勢(0.05≤P<0.10)；與對照組相比，浮游組血清IgG、sIgA、IL-6、TNF-α含量無顯著差異(P>0.05)。以上結果表明，被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39對犬的免疫激活效果不同，被膜態植物乳桿菌LR-39能夠提高犬血清IgG、sIgA含量，并降低炎性因子IL-6含量；而浮游態植物乳桿菌LR-39對犬的血清免疫指標則無顯著影響。

表1 各組血清免疫指標的比較

2.3 被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39對犬腸道菌群的影響

2.3.1 被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39對犬腸道菌群總體結構的影響

通過Illumina HiSeq平臺進行測序后以相似度在97%的以上的Tags聚類劃分OTUs，結果見圖2-A。由圖可知，各組OTUs數量從高到低依次為浮游組(256個)、被膜組(252個)、對照組(249個)，3組共有OTUs數量為227個。稀釋曲線如圖2-B所示，隨著測序深度增加，各樣本物種數量趨于飽和。

CL：對照組；PT：浮游組；BF：被膜組。下圖同。

α多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析，包括Observed species指數、Chao指數、Ace指數、Shannon指數、Simpson指數等[9]。Observed species指數、Chao指數、Ace指數反映樣品中菌群的豐富度(species richness)，即簡單指菌群中物種的數量。與對照組相比，灌飼浮游態與被膜態植物乳桿菌LR-39，均能提高樣本物種數量(圖3-A、圖3-B、圖3-C)。Shannon指數與Simpson指數反映菌群的多樣性(species diversity)，Shannon指數越大說明菌群的多樣性越高，Simpson指數越大說明菌群的多樣性越低。灌飼被膜態植物乳桿菌LR-39能夠提高菌群的多樣性，而灌飼浮游態植物乳桿菌LR-39則降低菌群多樣性(圖3-D、圖3-E)。覆蓋度反映了樣品文庫的覆蓋率，該數值越高，樣品中序列沒有被測出來的概率越低。各組測序覆蓋度均達到99%以上(圖3-F)，表明本試驗16S rDNA測序量可以滿足后續生物信息學分析。

圖3 被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39對犬腸道菌群α多樣性的影響

β多樣性分析是用來比較樣品間多樣性方面存在的差異大小[10-12]。主坐標分析(PCoA)可用來研究樣本菌群組成的相似性或相異性。PCo1和PCo2的主要貢獻率分別為43.71%、16.71%，3組樣本在PCo1有明顯聚類現象(圖4)。以上結果表明，被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39均能夠改變宿主腸道菌群結構，且2種生物狀態的益生菌對菌群結構的影響也明顯不同。

圖4 被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39

2.3.2 被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39對犬腸道菌群相對豐度的影響

主要菌門相對豐度比較見圖5，列代表分組，行代表菌門，顏色塊代表細菌相對豐度，顏色越紫代表細菌的相對豐度越高，顏色越紅代表細菌的相對豐度越低。在門水平，3組樣本都包含5個門，分別是變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)。被膜組腸道Firmicutes相對豐度較浮游組、對照組提高；浮游組腸道Bacteroidetes、Fusobacteria相對豐度較被膜組、對照組提高。

Other：其他；Proteobacteria：變形菌門；Actinobacteria：放線菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Fusobacteria：梭桿菌；Firmicutes：厚壁菌門。

由圖6可見，各組樣本菌群共鑒定出37個屬，與對照組相比，浮游組乳桿菌屬(Lactobacillus)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、普雷沃菌屬(Prevotella)、薩特氏菌屬(Sutterella)相對豐度提高，其他菌屬相對豐度降低或無明顯變化；被膜組Lactobacillus、Allobaculum、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、韋榮氏球菌屬(Veillonella)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、丁酸球菌屬(Butyricicoccus)、戴阿利斯特桿菌屬(dialiste)等相對豐度提高。以上結果表明，浮游態與被膜態植物乳桿菌LR-39對犬腸道菌群結構的影響存在差異。

Faecalibacterium：糞桿菌屬；Adlercreutzia：安德克氏菌屬；Coprococcus：糞球菌屬；Eubacterium：真桿菌屬；Bulleidia：布雷德菌屬；Cetobacterium：醋酸桿菌屬；Clostridium：芽胞梭菌屬；Slackia：斯萊克氏菌屬；Blautia：勞特氏菌屬；Catenibacterium：鏈型桿菌屬；Collinsella：柯林斯氏菌屬；Turicibacter：彎曲菌屬；Streptococcus：鏈球菌屬；Butyricicoccus：丁酸球菌屬；Peptococcus：消化球菌屬；Dialister：戴阿利斯特桿菌屬；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Gemmiger：吉米菌屬；Escherichia：埃希氏桿菌屬；Enterococcus：腸球菌屬；Megamonas：巨單胞菌屬；Ruminococcus：瘤胃球菌屬；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Other：未分類；Lactobacillus：乳桿菌屬；Peptostreptococcus：消化鏈球菌屬；Vellonella：韋榮球菌屬；Fusobacterium：梭桿菌屬；Sutterella：薩特氏菌屬；Anaerovibrio：厭氧弧菌屬；Prevotella：普雷沃菌屬；Parabacteroides：副擬桿菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Oscillospira：顫螺菌屬；Anaerobiospirillum：厭氧螺菌屬。

2.4 不同組別腸道菌群特征微生物分析

為了找出各組間具有差異的生物標志物(biomarker)，通過非參數因子Kruskal-Wallis秩和檢驗進行LEfSe分析，結果見圖7。由圖可以看出，被膜組顯著作用微生物類群包括桿菌綱(Bacilli)、乳桿菌目(Lactobacillales)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、Lactobacillus、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)；浮游組顯著作用微生物類群包括Fusobacterium；對照組顯著作用微生物類群包括α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、柯林斯氏菌屬(Collinsella)、鏈型桿菌屬(Catenibacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)。以上結果表明，與浮游態植物乳桿菌LR-39相比，被膜態植物乳桿菌LR-39能夠增加犬腸道的Lactobacillus相對豐度。

Fusobacterium：梭桿菌屬；Alphaproteobacteria：α-變形菌綱；Collinsella：柯林斯氏菌屬；Catenibacterium：鏈型桿菌屬；Eubacterium：真桿菌屬；Bacilli：桿菌綱；Lactobacillales：乳桿菌目；Lactobacillaceae：乳桿菌科；Lactobacillus：乳桿菌屬；Ruminococcaceae：瘤胃菌科。

2.5 腸道菌屬與血清免疫指標的相關性分析

為進一步分析犬血清免疫指標的變化是否與腸道菌群結構變化相關，根據LEfSE分析結果，開展差異菌屬與血清免疫指標之間的Spearman相關性分析。由表2可知，血清IgG、sIgA、IL-6、TNF-α含量與腸道富集菌群相對豐度不存在顯著的相關性(P>0.05)。以上結果提示，被膜組血清IgG、sIgA、IL-6含量變化可能與植物乳桿菌LR-39的生物被膜成分有關。

表2 腸道菌屬與血清免疫指標的Spearman秩相關系數

3 討 論

益生菌經口服進入宿主體內，會遭遇胃腸道不良環境的脅迫，例如胃酸和膽鹽。酸脅迫是指低pH對菌體生長和代謝產生的不利影響，它會引起菌體胞內pH下降，導致碳水化合物代謝途徑中的某些酸敏感酶活性喪失，從而影響能量供給；酸脅迫還會對細胞膜和某些大分子物質的結構造成損傷[13]。膽鹽脅迫對細菌最直接的危害是破壞細胞膜。低濃度的膽鹽能夠改變細胞膜的通透性和流動性，引起某些膜鑲嵌酶類的失活和跨膜轉運子的功能紊亂，還能改變細胞表面疏水性和電勢等表面特性；而高濃度的膽鹽可以迅速解離細胞質膜和膜蛋白，造成細胞質組分外泄，導致菌體死亡[14]。因此，耐酸和膽鹽能力是評價益生菌性能非常重要的參數之一。本研究結果表明，被膜態植物乳桿菌LR-39的耐酸和耐膽鹽能力均顯著強于浮游態植物乳桿菌LR-39。這可能是由于生物被膜中的胞外多聚物將菌體包裹其中，使菌體生存環境與低pH和膽鹽脅迫環境隔離開來，削弱二者對菌體細胞膜的直接破壞作用。此外，生物被膜中菌體形成立體的三維結構，其中的營養物質、滲透壓及pH形成梯度，這可以對低pH和膽鹽環境起到緩沖作用，提高菌體存活率。

本研究表明，不同生物狀態的植物乳桿菌LR-39對犬的免疫影響存在差異。被膜態植物乳桿LR-39能夠提高犬血清IgG、sIgA含量，降低血清IL-6、TNF-α含量，而浮游態植物乳桿LR-39則對上述免疫指標無顯著影響。這種差異可能與腸道菌群結構變化有關，然而通過Spearman相關性分析發現，腸道優勢菌屬與免疫指標并不存在顯著相關性，提示血清IgG、sIgA、IL-6、TNF-α含量變化與腸道菌群結構變化無明顯關聯性。Secor等[15]和Brady等[16]認為在生物膜群落中生長的細菌分泌細胞外基質，被膜態細菌在結構、代謝活性、表型等方面不同于浮游態細菌，推測可能會導致不同的免疫反應。構建雞沙門氏菌生物被膜合成相關基因缺失株導致免疫產生的IgG含量極顯著降低[17]，被膜態嗜水氣單胞菌口服免疫小鼠產生的抗體水平顯著高于浮游態[18]，被膜態金黃色葡萄球菌ATCC 25923及無枝菌酸棒狀桿菌(C.amycolatum)ATCC 700207分別刺激Jurkat細胞產生的促炎因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-12(IL-12)p70、IL-6、TNF-α及抗炎因子白細胞介素-10(IL-10)含量均低于浮游態[19]，以上試驗結果進一步印證了上述觀點。此外，被膜態植物乳桿菌LR-39更強的耐酸、耐膽鹽等抗環境脅迫能力導致其在腸道有效定植率提升，也可能是不同生物狀態植物乳桿菌LR-39對犬產生不同免疫影響的原因。然而，被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39對機體免疫影響差異的具體原因還有待進一步研究。

本試驗結果顯示，植物乳桿菌LR-39的不同生物狀態對犬的腸道菌群結構調整影響不同。灌喂被膜態植物乳桿菌LR-39后，腸道Lactobacillus相對豐度提高，成為腸道顯著作用微生物菌群；而灌喂浮游態植物乳桿菌LR-39卻導致Fusobacterium成為腸道顯著作用微生物菌群。Secor等[15]和Brady等[16]對浮游態的致病菌常導致急性感染而被膜態的致病菌常導致慢性感染的原因進行分析，認為被膜態細菌處于生物被膜的內部并向外部緩慢釋放游離菌，而游離態細菌則不具備此種優勢。此外，本研究團隊在該研究及過往研究[3]中分別比較了被膜態與浮游態植物乳桿菌LR-39和L-ZS9的抗環境脅迫能力、黏附性能，均顯示被膜態抗環境脅迫能力及黏附率顯著高于浮游態。綜上所述，緩慢釋放被膜態內部的游離菌及更高效率在腸道定植可能是導致飼喂被膜態植物乳桿菌LR-39能夠使Lactobacillus成為腸道優勢菌屬的原因。

4 結 論

①被膜態植物乳桿菌LR-39具有更強的耐酸及膽鹽能力，能夠提高血清IgG和sIgA含量，降低血清IL-6含量；而浮游態植物乳桿菌LR-39對血清免疫指標無顯著影響。

②被膜態植物乳桿菌LR-39主要提高腸道Lactobacillus相對豐度，而浮游態植物乳桿菌LR-39則主要提高腸道Fusobacterium相對豐度。

③腸道優勢菌屬與血清免疫指標無顯著相關性。

致謝：

感謝江蘇農牧科技職業學院寵物科技學院陸江教師、動物醫學院胡新崗教授對文稿所提的寶貴意見。