開封市某場雞源大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

史秀玲

（河南省飼草飼料站，河南 鄭州 450008）

近年來，（埃希氏）大腸桿菌的耐藥性一直在逐漸上升，且已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)引起重視。大腸桿菌是一類需氧或微厭氧、革蘭氏染色呈陰性、中等大小的桿狀菌，在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上會形成黑色金屬光澤的菌落（菌落明顯）。大腸桿菌是一種條件性病原菌（在正常情況下，不會引起機體發(fā)病，在機體的抵抗力變?nèi)鯐r，此微生物會大量地繁殖和改變寄生的部位，進而導致機體發(fā)病），常寄生在人和動物的腸道內(nèi)，是一類人畜共患病原菌，其大多數(shù)是腸道內(nèi)的正常菌群，只有少部分是引起病癥的致病性菌群。

大腸桿菌病是一種細菌性疾病，大腸桿菌是目前使養(yǎng)殖業(yè)受危害最大的致病菌之一。近些年來，由于養(yǎng)殖戶們對抗菌藥物不合理的使用和濫用，使得雞體內(nèi)的大腸桿菌耐藥菌株呈現(xiàn)遞增的趨勢，這將會危害我們的公共衛(wèi)生環(huán)境，這種普遍存在的大腸桿菌的耐藥性問題與使用抗菌藥物的選擇壓力有關。

耐藥性的大腸桿菌有兩種：一種是天然存在的耐藥菌，另一種是獲得性耐藥菌。獲得性耐藥菌的穩(wěn)定性及耐藥的種類，因不同的區(qū)域及用藥的使用情況的不同而異，并且其耐藥性可以遺傳給下一代。當極少量的耐藥性菌株存在于大量的敏感性菌株中，其危害并不嚴重，但如果在生產(chǎn)過程中頻繁使用抗菌藥物，敏感菌的生長將受到抑制，而耐藥菌株繼續(xù)生長繁殖，并最終形成耐藥菌體系。

該研究對開封的某規(guī)模化養(yǎng)雞場抽取樣品進行大腸桿菌分離、鑒定，隨后進行耐藥性試驗，對此場雞源大腸桿菌的耐藥情況有了初步認識，為進一步防控雞源大腸桿菌病提供了臨床試驗資料和理論依據(jù)，同時也為在臨床上指導養(yǎng)殖戶合理用藥提供了參考。該次耐藥性測定選用的抗生素涉及10 類16 種，分別是青霉素類（氨芐西林、復方阿莫西林）、頭孢菌素類（頭孢噻呋、頭孢他啶）、氨基糖苷類（慶大霉素、大觀霉素）、四環(huán)素類（四環(huán)素、多西環(huán)素）、酰胺醇類（氟苯尼考）、磺胺類（磺胺異惡唑、復方新諾明）、氟喹諾酮類（恩諾沙星、氧氟沙星）、碳青霉烯類（美羅培南）、喹噁啉類（乙酰甲喹）、多粘菌素類（粘桿菌素）。其中乙酰甲喹無折點值，耐藥率不判定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 2018 年3 月抽取開封某雞場肛門拭子樣品40個。

1.1.2 標準菌株 大腸埃希氏菌（大腸桿菌）標準菌株ATCC 25922 購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 使用培養(yǎng)基與試劑 革蘭氏陰性細菌鑒定板（購自BD 公司）；一次性無菌采樣棒（BPW）（購自鄭州君越科萊特健康科技有限公司）；伊紅美藍瓊脂和營養(yǎng)瓊脂（購自北京路橋技術有限公司）。

1.1.4 儀器設備 細菌濁度儀，購自北京中西遠大科技公司；全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)（BD PhoenixTM-100），購自BD 公司；低溫可疊放搖床（Thermo MaxQ600），購自Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 采集菌的處理 將一次性無菌采樣棒（預增菌）采集的樣品盡快送到實驗室，進行36℃±1℃培養(yǎng)16～20 h，設陽性和陰性對照。

1.2.2 樣品的分離純化及鑒定 選取預增菌液1～2環(huán)，劃線于伊紅美蘭瓊脂上，36℃±1℃培養(yǎng)16～20 h，選取單個菌落（黑色金屬光澤明顯且典型）進行劃線純化培養(yǎng)，最后將純化過的菌落接種于普通的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，同樣條件下進行培養(yǎng)，最后采用全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進行鑒定。

1.2.3 藥敏試驗 選取經(jīng)過BD鑒定為大腸希埃氏菌的營養(yǎng)瓊脂上的菌落，用生理鹽水調(diào)到0.5 MCF，吸取10 μl加入肉湯中混勻，然后分別取100 μl 加入96 孔藥敏板中，36℃±1℃培養(yǎng)16～20 h，最后讀取藥敏試驗結果。

2 結果與分析

2.1 菌株分離結果

經(jīng)過預增菌，大腸埃希氏菌的選擇性培養(yǎng)基的分離純化，以在伊紅美藍培養(yǎng)基呈黑金屬光澤的為初篩的大腸桿菌，最后經(jīng)全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)鑒定（BD 鑒定儀），開封此規(guī)模化雞場共分離大腸埃希氏菌25 株，總體分離率為62.50%（25/40）。

2.2 藥敏試驗結果

分離的25 株大腸桿菌，對四環(huán)素、氨芐西林、磺胺異惡唑、恩諾沙星、復方新諾明、氧氟沙星的耐藥率較高，分別為84.00%、84.00%、100.00%、84.00%、88.00%、88.00%；對強力霉素（多西環(huán)素）、大觀霉素、氟苯尼考、頭孢噻呋中度耐藥，耐藥率在40.00%～80.00%之間；對多黏菌素E、頭孢他啶、美羅培南較為敏感，耐藥率均在20.00%以下。具體結果見表1、圖1。

2.3 多重耐藥結果

總體來說，分離得到的25株雞源大腸桿菌的多重耐藥嚴重，多重耐藥率高達92.00%，主要集中在5耐和7耐，占64.00%，其中7 耐最多，占40.00%。分離到的25 株菌株，對抗生素的耐藥情況結果見圖2。

3 討論

該試驗從開封某雞場抽取40 個樣品，分離雞源大腸桿菌25 株，分離菌株的耐藥性結果比方杰等對青島地區(qū)雞源大腸桿菌耐藥性檢測中的氨芐西林（80.90%）要高；比艾偉昌等對河南省雞源大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析研究中鄭州地區(qū)的恩諾沙星（63.30%）和氨芐西林（73.30%）要高；比曲志娜等研究不同省區(qū)雞源大腸桿菌耐藥性調(diào)查中河南地區(qū)的慶大霉素（1.00%）、大觀霉素（44.00%）、氨芐西林（46.00%）、四環(huán)素（42.00%）、恩諾沙星（80.00%）和復方阿莫西林（14.00%）要高。且多重耐藥率已高達92.00%。由此來看，開封此場雞源大腸桿菌的耐藥現(xiàn)象較為嚴重。

在我國養(yǎng)殖業(yè)的逐步發(fā)展中，抗生素的濫用和無限制使用，使得雞場的大腸桿菌的發(fā)病率不斷增加，死亡率也是居高不下，大腸桿菌感染已經(jīng)成為目前雞的細菌性感染的疾病之首。研究表明，不同菌株對抗菌藥物的敏感性存在差異，在使用抗菌藥物治療時，需加強對病原菌耐藥性的檢測，并對病原菌進行藥敏試驗，篩選出使病原菌敏感的抗菌藥物，實現(xiàn)在臨床上的合理規(guī)范用藥，有效減緩細菌耐藥性的產(chǎn)生。在生產(chǎn)過程中著手搞好衛(wèi)生環(huán)境；加大對所用器具及禽舍的消毒頻率；注意育雛期的飼養(yǎng)密度及保溫處理；飼料應無糞便污染；營養(yǎng)要合理與全面，從而降低菌種的耐藥性。目前，世界上就針對動物源性大腸桿菌對人用抗菌藥物耐藥性研究的報道寥寥無幾，這可能是治療動物源性大腸桿菌病的一個突破口。□

表1 分離的25株菌對16種抗生素的具體耐藥情況

圖1 25株雞源大腸桿菌的耐藥結果

圖2 25株雞源大腸桿菌的多重耐藥結果