多組學(xué)分析揭示拉格酵母應(yīng)答高濃度麥汁機(jī)制

吳卓凡,呼子暄,王金晶,劉春鳳,鈕成拓,鄭飛云,李崎*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

在全球變暖和化石燃料走向枯竭的背景下,節(jié)能減排一直是食品與發(fā)酵工業(yè)關(guān)注的主要問(wèn)題。在啤酒生產(chǎn)中,高濃釀造作為一種有效的方式,可以減少水資源消耗、廢棄物排放、發(fā)酵罐數(shù)量和人工成本[1]。高濃釀造技術(shù)主要應(yīng)用于拉格啤酒生產(chǎn),拉格啤酒占全球產(chǎn)量的90%以上[2]。在高濃釀造過(guò)程中,酵母細(xì)胞暴露于高濃度麥汁的環(huán)境中,與常濃釀造相比,酵母的遲滯期延長(zhǎng)、發(fā)酵周期延長(zhǎng)并且殘余麥芽三糖顯著增多[3]。

自高濃釀造技術(shù)出現(xiàn)以來(lái),許多研究者試圖從多方面提高酵母發(fā)酵性能：提升酵母抗氧化能力以改善發(fā)酵[4];篩選抗葡萄糖阻遏菌株來(lái)縮短發(fā)酵遲滯期[5];通過(guò)增強(qiáng)麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)提高發(fā)酵末期的糖利用[6];通過(guò)添加外源氨基酸來(lái)提高酵母活性等[7]。提升酵母對(duì)高濃度麥汁的耐受是其中一個(gè)重要方向,高濃度麥汁是一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境,高濃度的葡萄糖、麥芽糖與α-氨基氮都會(huì)影響酵母細(xì)胞的基因調(diào)控方向。然而目前對(duì)高濃度麥汁脅迫酵母細(xì)胞的機(jī)制沒(méi)有完善的研究。因此,揭示拉格酵母應(yīng)對(duì)高濃麥汁的應(yīng)答機(jī)制,可以為提升高濃釀造技術(shù)水平奠定基礎(chǔ)。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和生物信息學(xué)分析方法的優(yōu)化[8],轉(zhuǎn)錄組和代謝組的交叉分析可以很好地揭示不同條件下菌株的表達(dá)與代謝差異[9]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析可以篩選不同條件下的顯著差異基因與代謝通路[10]。代謝組學(xué)分析可以驗(yàn)證基因表達(dá)調(diào)整后的代謝物變化,并找到核心代謝物。

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析了拉格酵母M14對(duì)常濃與高濃麥汁的應(yīng)答機(jī)制。通過(guò)組學(xué)關(guān)聯(lián)分析篩選出13個(gè)具有顯著差異的重要基因。初步分析拉格酵母對(duì)高濃麥汁的應(yīng)答機(jī)制,為后續(xù)高濃釀造優(yōu)良酵母的選育提供方向。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

工業(yè)拉格酵母(SaccharomycespastorianusM14)保藏于本實(shí)驗(yàn)室,經(jīng)過(guò)全基因組測(cè)序[11](NCBI ID:MVPU00000000)。

活化培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、瓊脂粉20 g/L(用于斜面培養(yǎng)基配制)。

麥汁培養(yǎng)基：加拿大麥芽3.2 kg、美國(guó)卡斯卡特啤酒花4 g、水9 L、瓊脂粉20 g/L(用于平板培養(yǎng)基配制),參照《釀造酒工藝學(xué)》[12]中的方法，制備成24 °P麥汁,其他濃度麥汁使用純凈水稀釋。

1.2 試劑與儀器

PBS緩沖液,Biosharp公司；標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖、果糖、麥芽糖,國(guó)藥試劑有限公司；RNA提取試劑盒(UNIQ-10 column Trizol total RNA extraction kit),生工生物工程(上海)股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit),Illumina公司。

SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化有限公司；Compass CX電子天平，Ohaus公司；UV11II紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美公司；HYL-X恒溫?fù)u床，強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；Research移液器，德國(guó)Eppendorf公司；Hve-50全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，日本平山制作所株式會(huì)社；R5408冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Nanodrop2000核酸定量?jī)x，美國(guó)Thermo Fisher公司；DMA4500啤酒分析儀，Anton-Paar公司。

1.3 濃度梯度麥汁平板脅迫測(cè)定

挑取1環(huán)M14細(xì)胞于YPD 培養(yǎng)基中,28 ℃,180 r/min,活化12 h。以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量進(jìn)行翻接,28 ℃,180 r/min,培養(yǎng)12 h至穩(wěn)定期(OD600 nm> 1.2)。7 000 r/min下4 ℃冷凍離心3 min,PBS緩沖液洗滌1次后使用無(wú)菌水梯度稀釋至10-5,取10 μL菌液在8、12、16、20、24 °P麥汁平板上點(diǎn)板,倒置于11 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h。

1.4 發(fā)酵性能驗(yàn)證及指標(biāo)測(cè)定

使用12 °P麥汁分三級(jí)對(duì)拉格酵母M14進(jìn)行擴(kuò)培。第一級(jí)25 ℃,180 r/min,擴(kuò)培18 h；第二級(jí)18 ℃,120 r/min,擴(kuò)培24 h；第三級(jí)11 ℃,靜置,擴(kuò)培24 h。取酵母細(xì)胞在7 000 r/min下4 ℃冷凍離心3 min,接種于300 mL 12 °P與24 °P麥汁培養(yǎng)基中,接種量為106個(gè)/(mL·Brix)。置于11 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵,每天記錄失重并取1 mL樣本分析糖譜。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

發(fā)酵度、殘留浸出物與酒精度測(cè)定采用DMA4500啤酒分析儀,每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定2次。

糖譜分析使用高效液相色譜測(cè)定,參考ASBC分析方法[13],每個(gè)樣本測(cè)定1次。

1.5 RNA提取與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

使用1.4小節(jié)中方法制備種子液,取酵母細(xì)胞在7 000 r/min下4 ℃冷凍離心3 min后迅速接種于預(yù)冷至11 ℃的1 000 mL 12 °P與24 °P麥汁培養(yǎng)基中,接種量為106個(gè)/(mL·Brix)。11 ℃靜置2 h后取酵母細(xì)胞,7 000 r/min下4 ℃冷凍離心3 min,使用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗3次,去除麥汁雜質(zhì)后存儲(chǔ)細(xì)胞于1.5 mL EP管內(nèi)。使用液氮速凍,存于-80 ℃冰箱備用。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)酵母總RNA進(jìn)行提取,提取后的RNA使用Nanodrop 2000進(jìn)行核酸定量并進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè),檢測(cè)合格的RNA交于北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行Illumina測(cè)序。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

高通量測(cè)序儀測(cè)得的圖像數(shù)據(jù)經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù),然后對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾,去除接頭與低質(zhì)量數(shù)據(jù)得到clean data。同時(shí),對(duì)clean data進(jìn)行Q20、Q30和GC含量計(jì)算。后續(xù)所有分析均是基于clean data進(jìn)行的高質(zhì)量分析。使用HISAT2構(gòu)建參考基因組的索引并將配對(duì)末端clean reads與M14基因組比對(duì)。featureCounts(1.5.0-p3)用于計(jì)算映射到每個(gè)基因的讀數(shù)。然后根據(jù)基因的長(zhǎng)度計(jì)算每個(gè)基因的FPKM,并計(jì)算映射到該基因的讀數(shù)。使用DESeq2軟件進(jìn)行2個(gè)比較組合之間的差異表達(dá)分析[14](每個(gè)組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)),設(shè)置校正后的P<0.05以及|log2fold change|≥1作為顯著差異表達(dá)的閾值。通過(guò)clusterProfiler(3.4.4)軟件實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因的GO(gene ontology)富集分析與KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路中差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)富集,其中修正了基因長(zhǎng)度偏差。

1.6 胞內(nèi)代謝物提取與代謝組檢測(cè)

代謝組學(xué)樣本與轉(zhuǎn)錄組學(xué)樣本取樣方法相同,采用正離子與負(fù)離子模式分別檢測(cè)[15],在本文的結(jié)果與分析中合并分析,設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

取100 mg液氮研磨的組織樣本,置于EP管中,加入500 μL含1 L/m3甲酸的800 L/m3甲醇水溶液,渦旋振蕩,冰浴5 min,4 ℃、15 000 r/min離心10 min,取一定量的上清液使用超純水稀釋至甲醇含量為600 L/m3,并置于帶有0.22 μm濾膜的離心管中4 ℃、15 000 r/min離心10 min,收集濾液,進(jìn)樣LC-MS進(jìn)行分析。從每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本中取等體積樣本混勻作為QC樣本。空白樣本為含1 L/m3甲酸的600 L/m3甲醇水溶液代替實(shí)驗(yàn)樣本,前處理過(guò)程與實(shí)驗(yàn)樣本相同。

表1 色譜梯度洗脫程序Table 1 Chromatographic gradient elution program

超高效液相色譜使用Hyperil Gold column(C18)色譜柱,色譜條件：柱溫40 ℃、流速0.2 mL/min；正模式：流動(dòng)相A,1 L/m3甲酸、流動(dòng)相B,甲醇；負(fù)模式：流動(dòng)相A,5 mmol/L醋酸銨,pH 9.0、流動(dòng)相B,甲醇。

質(zhì)譜掃描范圍選擇m/z100～1 500；ESI源的設(shè)置如下：Spray Voltage:3.2 kV;Sheath gas flow rate:35 arb;Aux Gasflow rate:10 arb;Capillary Temp:320 ℃。MS/MS二級(jí)掃描為data-dependent scans。

將下機(jī)數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Compound Discoverer 3.0軟件中,進(jìn)行保留時(shí)間、質(zhì)荷比等參數(shù)的簡(jiǎn)單篩選,然后對(duì)不同樣品根據(jù)保留時(shí)間偏差0.2 min和質(zhì)量偏差5 mg/L進(jìn)行峰對(duì)齊,使鑒定更準(zhǔn)確,隨后根據(jù)設(shè)置的質(zhì)量偏差5 mg/L、信號(hào)強(qiáng)度偏差30%、信噪比3、最小信號(hào)強(qiáng)度100 000、加和離子等信息進(jìn)行峰提取,同時(shí)對(duì)峰面積進(jìn)行定量,再整合目標(biāo)離子,然后通過(guò)分子離子峰和碎片離子進(jìn)行分子式的預(yù)測(cè)并與mzCloud和Chemspider數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),用blank樣本去除背景離子,并對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行歸一化,最后得到數(shù)據(jù)的鑒定和定量結(jié)果。采用PLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(variable importance in the projection,VIP)值,VIP值表示不同分組中代謝物差異的貢獻(xiàn)率；并結(jié)合T-test的P值來(lái)尋找差異性表達(dá)代謝物,設(shè)置VIP>1.0、校正后的P<0.05以及|log2foldchange|≥1作為顯著差異代謝物的閾值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析。P<0.05視為顯著差異。使用GraphPad Prism 8進(jìn)行圖片繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃度梯度麥汁平板脅迫測(cè)定及發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

為了研究高濃度麥汁對(duì)拉格酵母的脅迫水平,通過(guò)濃度梯度麥汁平板進(jìn)行了簡(jiǎn)單的酵母生長(zhǎng)情況與耐受性測(cè)定。如圖1所示,拉格酵母M14在8 °P與12 °P麥汁平板上基本沒(méi)有生長(zhǎng)抑制,在16 °P麥汁平板上10-5濃度的細(xì)胞生長(zhǎng)量顯著降低,而在20 °P與24 °P麥汁平板上10-5濃度的酵母基本無(wú)法生長(zhǎng)。表明高濃度麥汁給酵母細(xì)胞生長(zhǎng)帶來(lái)了較大的壓力。

圖1 M14菌株的高濃度麥汁脅迫平板實(shí)驗(yàn)Fig.1 Plate experiment of strain M14 under high gravity wort stress

通過(guò)小瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)比較常濃與高濃釀造發(fā)酵指標(biāo),并跟蹤發(fā)酵過(guò)程的失重與糖降,有助于了解常濃度與高濃度麥汁造成的發(fā)酵性能與糖利用差異。由圖2可知,M14的發(fā)酵度由12 °P中的58.56%下降到24 °P中的56.01%(圖2-a)；12 °P麥汁中酵母起酵較快,同時(shí)發(fā)酵5 d主酵接近結(jié)束,麥芽糖被完全利用(圖2-c)；24 °P麥汁中酵母起酵較慢,同時(shí)7 d未能完全消耗麥芽糖(圖2-d)；實(shí)驗(yàn)使用的麥汁糖譜符合ASBC中相關(guān)比例標(biāo)準(zhǔn)[13](圖2-b)。

a-12 °P與24 °P麥汁的發(fā)酵度；b-麥汁的糖譜；c-12 °P下葡萄糖、果糖、麥芽糖與失重變化；d-24 °P下葡萄糖、果糖、麥芽糖與失重變化圖2 M14菌株的常濃與高濃發(fā)酵比較Fig.2 Comparison of normal and high gravity fermentation of strain M14

綜上所述,高濃度麥汁對(duì)拉格酵母有著較強(qiáng)脅迫,酵母在高濃釀造下遲滯期延長(zhǎng)、生長(zhǎng)速度下降并且糖分利用不完全,導(dǎo)致發(fā)酵周期延長(zhǎng)和發(fā)酵度下降。因此本研究采用轉(zhuǎn)錄組與代謝組手段,進(jìn)一步分析發(fā)酵早期代謝物與表達(dá)情況,從分子水平解釋高濃度麥汁脅迫下的拉格酵母應(yīng)答機(jī)制。

2.2 轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1 樣本設(shè)置、主成分分析與基因表達(dá)熱圖

起酵階段的應(yīng)答對(duì)拉格酵母發(fā)酵性能至關(guān)重要。為了探究發(fā)酵早期拉格酵母對(duì)高濃麥汁的應(yīng)答機(jī)制,轉(zhuǎn)錄組與代謝組樣本的取樣時(shí)機(jī)設(shè)置在起酵階段。接種前的酵母參照工業(yè)釀造工藝流程進(jìn)行逐級(jí)降溫、擴(kuò)培,確保其接入高濃與常濃發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)的狀態(tài)一致、活力良好,并于接種后2 h取樣。

轉(zhuǎn)錄組樣本上機(jī)測(cè)序后,經(jīng)過(guò)原始數(shù)據(jù)過(guò)濾、測(cè)序錯(cuò)誤率檢查、GC含量分布檢查,獲得后續(xù)分析使用的clean data。使用經(jīng)過(guò)注釋的自身參考基因組進(jìn)行比對(duì),共注釋到6 598個(gè)基因,然后進(jìn)行定量分析。采用主成分分析評(píng)估組間差異及組內(nèi)樣本重復(fù)情況,主成分分析采用線性代數(shù)的計(jì)算方法,對(duì)所有基因變量進(jìn)行降維處理及主成分提取。對(duì)6個(gè)樣本的基因表達(dá)值(FPKM)進(jìn)行主成分分析(圖3-b),組間樣本分散,組內(nèi)樣本聚集,表明兩組間具有顯著差異且測(cè)序情況良好,說(shuō)明拉格酵母M14對(duì)高濃麥汁產(chǎn)生了顯著的應(yīng)答調(diào)控。

同時(shí)繪制了表達(dá)基因聚類熱圖(圖3-a)。通過(guò)主流的層次聚類對(duì)基因的FPKM值進(jìn)行聚類分析,熱圖中的基因越靠近其表達(dá)模式越相近。因?yàn)榻?jīng)過(guò)歸一化處理,熱圖中的顏色只能橫向比較(同一基因在不同樣本中的表達(dá)情況),不能縱向比較(同一樣本不同基因的表達(dá)情況)。由圖可知M14在應(yīng)答12 °P與24 °P麥汁的情況下,組內(nèi)的表達(dá)模式完全一致,組間的總體表達(dá)模式接近,但是存在局部的差異(圖3-a中紅框),有上調(diào)的差異區(qū)域也有下調(diào)的差異區(qū)域。這些顯著差異的區(qū)域是拉格酵母應(yīng)答高濃麥汁處理的重要基因與途徑。

a-表達(dá)熱圖；b-主成分分析；c-差異基因火山圖圖3 M14菌株應(yīng)答常濃與高濃麥汁的表達(dá)情況Fig.3 Gene expression of strain M14 response to normal and high gravity wort

通過(guò)宏觀分析,驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)正確和平行性良好,且說(shuō)明了常濃度與高濃度麥汁處理的拉格酵母差異顯著,需要進(jìn)一步進(jìn)行顯著基因差異分析與通路富集分析。

2.2.2 差異表達(dá)基因分析

經(jīng)過(guò)測(cè)序結(jié)果質(zhì)檢與宏觀分析,樣本平行性良好,故在差異表達(dá)基因與顯著差異表達(dá)基因的篩選中設(shè)置padj閾值為0.05與0.01。如表2所示,經(jīng)過(guò)2組樣本間差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)與篩選,一共獲得了2 312個(gè)差異表達(dá)基因,占總基因數(shù)的35.04%,其中1 137個(gè)上調(diào),1 175個(gè)下調(diào),下調(diào)基因略多于上調(diào)基因(圖3-c)。設(shè)置|log2fold change| ≥ 1作為顯著差異基因篩選的閾值,得到191個(gè)顯著差異基因,占總差異表達(dá)基因的8.26%,其中38個(gè)基因顯著上調(diào),153個(gè)基因顯著下調(diào),下調(diào)基因多于上調(diào)基因。顯著差異基因中最大上調(diào)倍數(shù)為7.15倍,最大下調(diào)倍數(shù)為11.53倍。

表2 轉(zhuǎn)錄組基因統(tǒng)計(jì)Table 2 Transcriptomic gene statistics

大量基因顯著下調(diào)可能是高濃度麥汁的脅迫造成的,但也有一定量的基因上調(diào),這可能是拉格酵母M14為了應(yīng)對(duì)麥汁脅迫做出的應(yīng)答。通過(guò)顯著差異基因分析,目標(biāo)基因被鎖定到191個(gè)以內(nèi),后續(xù)將通過(guò)GO、KEGG富集分析與代謝組數(shù)據(jù)支撐找到重要差異基因。

2.2.3 差異表達(dá)基因的GO富集分析

GO是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫(kù),基因被分為生物過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3個(gè)部分。在3個(gè)部分中各選擇10個(gè)以內(nèi)富集到的顯著差異通路進(jìn)行柱狀圖繪制,各部分從左往右顯著性從高到低如圖4所示。高濃度與常濃度的差異基因主要富集到生物過(guò)程(BP)的碳水化合物代謝過(guò)程(GO:0005975)與氧化還原過(guò)程(GO:0055114)；富集到細(xì)胞組成(CC)的膜的固有成分(GO:0031224)、膜的組成部分(GO:0016021)、蛋白酶體核心復(fù)合物(GO:0005839)與蛋白酶體復(fù)合體(GO:0000502)；富集到細(xì)分子功能(MF)的作用于供體的氧化還原酶活性(GO:0016614)、維生素結(jié)合(GO:0019842)、作用于受體氧化還原酶活性 (GO:0016616)與輔因子結(jié)合(GO:0048037)。

圖4 差異基因的GO富集Fig.4 GO enrichment of DEGs

3個(gè)部分富集到的基因功能高度相關(guān),可以將富集到的基因功能概括為碳代謝、氧化還原平衡、膜組成與蛋白酶體4個(gè)類別。其中碳代謝與氧化還原平衡與高濃脅迫直接相關(guān),高濃麥汁中的高糖脅迫會(huì)直接影響能量代謝；細(xì)胞膜和酵母抗逆一直息息相關(guān)[16],膜功能的狀態(tài)決定了酵母生理活性的水平；蛋白酶體功能涉及細(xì)胞周期控制、應(yīng)激反應(yīng)、基因轉(zhuǎn)錄與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)多方面[17],可能參與高濃脅迫下的細(xì)胞宏觀調(diào)控。上述結(jié)果能夠進(jìn)一步縮小基因范圍,加快基因挖掘進(jìn)程。

2.2.4 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

KEGG綜合性數(shù)據(jù)庫(kù)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息。選取最顯著的18個(gè)通路繪制散點(diǎn)圖(圖5),點(diǎn)的大小代表了富集到的基因數(shù)量,展示在下方的通路顯著性較高。

圖5 差異基因的KEGG富集Fig.5 KEGG enrichment of DEGs

具有顯著差異且注釋到基因數(shù)量較多的通路為：碳代謝、氨基酸代謝與蛋白酶體。其中氨基酸代謝普遍上調(diào)(40/66),可能由于脅迫刺激細(xì)胞內(nèi)蛋白合成。碳代謝普遍下調(diào)(43/69),可能由于高濃脅迫壓力,導(dǎo)致糖轉(zhuǎn)運(yùn)與EMP途徑無(wú)法快速響應(yīng),相比常濃度麥汁更晚進(jìn)入穩(wěn)定耗糖階段,也可能是由于細(xì)胞資源被用于應(yīng)對(duì)脅迫壓力,影響能量代謝表達(dá)水平。KEGG富集與GO富集分析結(jié)果基本一致。

2.3 代謝組分析

2.3.1 差異代謝物分析

本研究采用了與轉(zhuǎn)錄組一致的樣本進(jìn)行代謝組檢測(cè),設(shè)置6個(gè)生物學(xué)平行。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)圖譜處理與數(shù)據(jù)庫(kù)搜索,對(duì)代謝物進(jìn)行定性與定量,總共分辨到326種代謝物。質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)顯示代謝組數(shù)據(jù)可靠、準(zhǔn)確。主成分分析顯示2組間樣本分散且組內(nèi)樣本聚集,表明2組間存在顯著差異代謝物且代謝物含量穩(wěn)定。

設(shè)置顯著差異代謝物篩選的閾值為VIP>1.0,|log2fold change|≥1且P<0.05,最終篩選到30個(gè)顯著差異代謝物,占總代謝物數(shù)量的9.20%,其中18個(gè)代謝物顯著上調(diào),12個(gè)代謝物顯著下調(diào)。顯著差異代謝物中最大上調(diào)倍數(shù)為2.75倍,最大下調(diào)倍數(shù)為2.31倍。代謝物調(diào)整具有滯后性,作為對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的支撐,篩選到的顯著代謝物可以論證相關(guān)基因通路的表達(dá)差異,但是未能表現(xiàn)出顯著差異的代謝物不能說(shuō)明相關(guān)基因通路無(wú)意義。上述數(shù)據(jù)表明酵母在短時(shí)間內(nèi)便對(duì)高濃麥汁應(yīng)答,基因表達(dá)差異引起了部分代謝物含量變化。

2.3.2 差異代謝物的KEGG富集分析

通過(guò)相同的方法對(duì)差異代謝物進(jìn)行KEGG富集分析,選取最顯著的18個(gè)通路繪制散點(diǎn)圖(圖6)。其中有10個(gè)通路與氨基酸代謝或能量代謝相關(guān),其中最顯著的5個(gè)通路內(nèi)有3個(gè)為氨基酸代謝。如表3所示,天冬氨酸、絲氨酸、精氨酸與蛋氨酸含量顯著上調(diào)。說(shuō)明胞內(nèi)氨基酸和氨酰化合物在高濃度麥汁刺激下合成加速,與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。而細(xì)胞內(nèi)糖類化合物還沒(méi)有顯著變化,說(shuō)明了碳代謝普遍下調(diào)不是因?yàn)榘麅?nèi)糖分過(guò)量酵解使得ATP積累導(dǎo)致的反饋抑制,而可能與麥汁脅迫壓力相關(guān)。

2.4 重要差異基因篩選與分析

轉(zhuǎn)錄組分析篩選到顯著差異基因并富集到能量代謝、氨基酸代謝與蛋白酶體,代謝組分析驗(yàn)證了氨基酸代謝途徑的基因上調(diào),并揭示了碳代謝途徑下調(diào)的原因。對(duì)代謝物和差異基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,并結(jié)合酵母SGD數(shù)據(jù)庫(kù)(saccharomyces genome database)與

圖6 差異代謝物的KEGG富集Fig.6 KEGG enrichment of differential metabolites

表3 顯著差異氨基酸Table 3 Amino acids with significantly different content

現(xiàn)有研究文獻(xiàn)[18-20],篩選獲得了13個(gè)重要差異基因。如表4所示,共確定了13個(gè)重要差異基因,其中8個(gè)基因與碳代謝相關(guān),2個(gè)基因與己糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān),3個(gè)基因與氨基酸的生物合成相關(guān)。

表4 重要差異基因Table 4 Important DEGs

代謝組中顯著上調(diào)的氨基酸與轉(zhuǎn)錄組中顯著上調(diào)的氨基酸相關(guān)基因(AAT1、SER2與ARG4)完全一致,除顯著差異基因之外,氨基酸生物合成途徑普遍上調(diào),表明拉格酵母在應(yīng)答高濃度麥汁時(shí)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與酶合成活躍。氨基酸的積累對(duì)細(xì)胞抗逆性能有著積極作用[21],比如帶電氨基酸如精氨酸對(duì)細(xì)胞耐低溫有著明顯效果[22]。氨基酸的加速合成與積累是拉格酵母細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境的應(yīng)答策略,有助于細(xì)胞維持生長(zhǎng)代謝平衡。

高濃度麥汁對(duì)拉格酵母細(xì)胞最明顯的壓力是高濃度的葡萄糖與麥芽糖。EMP途徑的基因全線下調(diào),包括關(guān)鍵的HXK1與PGK1,同一代謝通路上下游的PGM2、GPM1與GPM2也顯著下調(diào)。EMP途徑的顯著下調(diào)可能是拉格酵母在高濃麥汁中起酵緩慢的主要原因。受到高濃度麥汁脅迫,己糖激酶HXK1與磷酸甘油酸激酶PGK1等關(guān)鍵基因表達(dá)下調(diào),糖酵解速度放緩導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP生產(chǎn)減少,不利于細(xì)胞其他代謝活動(dòng)開(kāi)展。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)海藻糖合成相關(guān)基因顯著上調(diào)(TSL1、TPS3與TPS2),海藻糖積累對(duì)細(xì)胞代謝平衡有重要作用[23]。

同時(shí)在重要通路之外觀測(cè)到了HXT家族基因的顯著變化(HXT1與HXT2),HXT家族編碼己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。已有研究表明HXT1的表達(dá)和發(fā)酵初期的極端高糖相關(guān)[24],所以HXT1可能是拉格酵母應(yīng)答高濃葡萄糖的主要基因。HXT2同時(shí)具有低濃與高濃的底物特異性親和力[25],與HXT1的誘導(dǎo)系統(tǒng)不同,HXT2可能受到環(huán)境因素如滲透壓、ATP缺乏等調(diào)控。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)濃度梯度麥汁平板脅迫測(cè)定及發(fā)酵實(shí)驗(yàn),比較了常濃度與高濃度下的酵母特性。通過(guò)對(duì)拉格酵母M14在12 °P與24 °P麥汁處理2 h后的樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、代謝組檢測(cè)與關(guān)聯(lián)分析,共獲得191個(gè)顯著差異基因,其中38個(gè)上調(diào),153個(gè)下調(diào)；共獲得30個(gè)顯著差異代謝物,其中18個(gè)上調(diào),12個(gè)下調(diào)。通過(guò)GO富集與KEGG富集分析,結(jié)合SGD數(shù)據(jù)庫(kù),篩選獲得13個(gè)重要差異基因(HXT1、HXT2、HXK1、PGM2、PGK1、GPM1、GPM2、TSL1、TPS3、TPS2、AAT1、SER2與ARG4),差異基因主要與糖酵解、海藻糖合成、氨基酸合成和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。本研究初步揭示了拉格酵母應(yīng)對(duì)高濃度麥汁的應(yīng)答機(jī)制,為高濃釀造優(yōu)良酵母的選育提供技術(shù)參考。