不同產地前胡對氧化應激后支氣管平滑肌細胞增殖影響研究*

周 潔 徐 攀 胡軼娟 樓柯浪 吳曉俊 梁衛青 張宏建 浦錦寶#

1 浙江省中醫藥研究院 浙江 杭州 310007

2 浙江中醫藥大學 浙江 杭州 310053

前胡為傘形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根。主要分布安徽、浙江、貴州、云南、四川等地。《本草匯言》一書[1]中提到，“前胡，散風寒、凈表邪、溫肺氣、消痰嗽之藥也。如傷風之證，咳嗽痰喘，聲重氣盛，此邪在肺經也。”而據《本草綱目》記載，前胡“清肺熱，化痰熱，散風邪”[2]。現代藥理學研究發現其具有降氣化痰，宣散風熱的功效，可用于肺氣不降所致的痰熱喘滿，咯痰黃稠，風熱咳嗽痰多。前胡在臨床上治療氣道炎癥有較好的療效[3]，但其對H2O2處理氧化應激刺激下增殖影響未見文獻報道。

氧化應激與氣道炎癥關系密切，氣道炎癥能促進氣道重塑，而氣道重塑中，氣道平滑肌細胞的增生有著重要的作用[4]。研究表明，氧化應激可刺激支氣管平滑肌細胞（HBSMSCs）增殖，進而導致氣道炎癥的發生和加重[5-6]。H2O2是一種體內氧自由基，屬于活性氧家族成員之一。利用不同濃度H2O2刺激離體HBSMSCs的方法能近似地模擬自然狀態下氣道炎癥的氧化應激狀態[7]。氣道炎癥與氧化應激反應關系密切，氧自由基可激活NF-κB及某些細胞因子(如IL-8)等，對機體組織細胞產生氧化作用，這在氣道炎癥的發病機制中已得到廣泛的認可[8]。

本研究在離體的人源支氣管平滑肌細胞上，予不同濃度H2O2刺激不同時間的方法形成體外氧化應激模型。HBSMC經H2O2刺激后可以使細胞增殖率增加，由此可確定體外氧化應激模型造模成功。觀察H2O2處理氧化應激刺激后，用前胡有效成分及不同產地前胡粗提物干預后支氣管平滑肌細胞增殖影響。

1 儀器與試劑

1.1 試劑：RPMI-1640培養液、胎牛血清（Hyclone公司）；CCK-8、DMSO（Sigma公司）；0.25%胰蛋白酶EDTA、PBS緩沖液、1%青鏈霉素（Gibco公司）；10cm培養皿、96孔培養板（Corning公司）。

1.2 儀器：ELX800酶標儀（BioTek公司）；超凈工作臺（江蘇省蘇州凈化設備公司）；CO2培養箱、-80℃超低溫冰箱（Thermo公司）；倒置顯微鏡及數碼攝像裝置（Nikon公司）；4℃低溫離心機（Eppendorf公司）。

1.3 樣品采集：采集產于浙江（磐安、淳安、臨安）、安徽、湖南、湖北、四川、云南、山東、江西、貴州、重慶等12地的白花前胡栽培新鮮藥材，自然陰干后用于前胡藥材有效成分含量（白花前胡甲素、乙素）的測定，樣品信息見表1。

2 實驗方法

2.1 細胞培養：購買人支氣管平滑肌細胞HBSMCs復蘇傳代培養，2～8代細胞用于實驗。于RPMI-1640培養液（含10%FBS）的10cm皿中正常傳代培養，培養箱溫度為37℃，CO2濃度為5%。

2.2 CCK-8檢測細胞增殖：向96孔板中接種5000個細胞/孔，分別用不同濃度的供試品孵育細胞，再向每孔細胞中加入10μl CCK-8試劑，37℃生化培養箱繼續孵育3h，最后利用酶標儀在450nm波長處測定細胞吸光度值來檢測細胞增殖活力。

2.3 不同產地前胡提取物中白花前胡甲素和乙素含量的測定：稱取不同產地前胡干燥粉末各0.5g，加入25ml甲醇超聲提取30min，減壓揮干后，再用DMSO分別溶解稀釋前胡提取物至125、250、500μg/ml，測定12個產地中前胡提取物中白花前胡甲素和乙素的含量。

3 實驗結果

3.1 不同產地前胡中白花前胡甲素和乙素含量：不同產地中前胡白花前胡甲素和乙素含量測定結果見下表1。從表中可知，各產地之間的白花前胡甲素和乙素含量有較大差異，分別在14.43～22.45mg/g和0.82～6.71mg/g之間。而根據國家藥典規定白花前胡甲素和乙素含量不得低于0.9%和0.24%，所有產地前胡中白花前胡甲素含量均超過藥典標準，部分產地的白花前胡乙素含量達不到藥典標準。其中野生前胡提取物中的白花前胡乙素含量遠大于栽培前胡提取物的含量。

表1 不同產地前胡提取物中白花前胡甲素和白花前胡乙素含量

3.2 不同濃度H2O2作用不同時間下細胞增殖率CCK-8變化：如圖1所示，可觀察到在25、50μM濃度范圍內，作用6h、12h后，0、25、50、100μM濃度H2O2作用組吸光度均無明顯差別；作用24h后，25、50μM濃度H2O2組吸光度較0μM高，在25μM H2O2作用24h時，吸光度值達到最大，增殖率最大。作用48h、72h后，25μM、50μM濃度H2O2組吸光度值仍較0μM濃度H2O2組高，50μM濃度H2O2組吸光度值較25μM濃度H2O2組為低。在200μM濃度H2O2作用6h后，細胞增殖率就開始負增長，且隨著作用時間延長，負增長率逐漸增大。

圖1 不同濃度作用HBSMC不同時間下細胞增殖率檢測

3.3 前胡中白花前胡甲素、白花前胡乙素對H2O2誘導支氣管平滑肌增殖的影響：向96孔板中接種2000個細胞/孔，據圖1中25μM H2O2作用24h細胞增值率最大作為對照，分別用不同濃度白花前胡甲素、白花前胡乙素分別進行干預，24h后每孔加入10μlCCK-8在酶標儀中450nm處檢測吸光值。

如圖2所示，白花前胡甲素在12.5、25、50μM濃度下對H2O2刺激HBSMSCs增殖有較明顯的抑制作用，且與空白對照0μM相比，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.001）。而白花前胡乙素對H2O2刺激HBSMSCs增殖的抑制作用較弱，其中12.5、25μM白花前胡乙素與0μM相比有一定的抑制作用，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 經H2O2刺激后白花前胡甲素、白花前胡乙素對HBSMSCs增殖影響

3.4 不同產地前胡對H2O2誘導支氣管平滑肌增殖的影響：本實驗組選取表1中白花前胡。于96孔板中接種HBSMSCs，加入25μMH2O2后分別用上述不同產地不同濃度白花前胡提取物進行干預后，加入CCK-8試劑孵育后放入酶標儀（450nm）進行檢測。

如圖3所示，與control組相比，1～12不同產地供試品在125μg/mL濃度下對H2O2誘發的HBSMSCs增殖效應均有抑制，且差異均有統計學意義。其中1、2、3、8四個產地來源的白花前胡粗提物在125μg/ml抑制H2O2誘發的HBSMSCs增殖的效果較其他產地更佳（P＜0.001）。其次4、6、7、10在125μg/ml抑制H2O2誘發的HBSMSCs增殖的效果較control組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。而5、9、11、12四個產地的白花前胡提取物在抑制H2O2誘發的HBSMSCs增殖效果上較control組相比，差異有統計學意義（P＜0.01），但較其他8個產地效果稍差。隨濃度增高，1～12白花前胡抑制作用均較125μg/ml濃度減弱，其中1、8與control組相比，差異有統計學意義（P＜0.001）。其次為3與control組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。此外，2、12與control組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 不同產地前胡對H2O2誘導支氣管平滑肌增殖的影響

3.5 不同產地前胡提取物抑制平滑肌細胞增殖活性與其活性成分含量的相關性分析：在測定不同產地前胡提取物中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量及其對平滑肌細胞增殖抑制活性的基礎上，本研究還對兩者進行了Person相關性分析（表2）。從表中相關系數來看，3種給藥濃度下白花前胡甲素與抑制平滑肌細胞增殖活性的相關系數均大于白花前胡乙素與抑制平滑肌細胞增殖活性的相關系數，這也與本研究中白花前胡甲素單體和白花前胡乙素單體對平滑肌細胞增殖活性的抑制作用一致。

表2 不同產地前胡提取物抑制平滑肌細胞增殖活性與活性成分含量相關系數

4 討論

在不同濃度H2O2作用HBSMSCs不同時間考察中，25μM H2O2作用24h時，增殖率最大。白花前胡甲素在12.5、25、50μM濃度下對H2O2刺激HBSMSCs增殖有較明顯的抑制作用。而白花前胡乙素對H2O2刺激HBSMSCs增殖的抑制作用較弱，其中12.5、25μM白花前胡乙素與0μM相比有一定的抑制作用，但差異無統計學意義。由此可得，在HBSMSCs氧化應激引發的增殖過程中，白花前胡甲素相較于白花前胡乙素其抑制作用較為明顯。

本實驗比較不同產地前胡對H2O2刺激HBSMSCs增殖抑制效果，發現來自浙江三個產地和安徽寧國四個產地的抑制作用最強，其次為貴州大方、江西九江、湖北利川和云南騰沖，而湖南華容、山東泰安、重慶巫溪和四川達州效果稍差。這也說明了產自道地產區浙江和安徽的前胡藥材對于支氣管平滑肌細胞增殖有較好的抑制作用，具有較好的消除氣道炎癥的效果。

抑制平滑肌細胞增殖活性與前胡活性成分含量的相關性分析表明，前胡提取物抑制平滑肌細胞增殖活性與其活性成分白花前胡甲素和白花前胡乙素含量均呈正相關，與白花前胡乙素相比，白花前胡甲素與抑制平滑肌細胞增殖活性的相關性更強。

本研究立足本草經典，與現代藥理研究結合，挖掘前胡在氧化應激條件下對氣道炎癥的藥理作用，并通過不同產區前胡抗氣道炎癥活性比較，得出道地產區浙江和安徽兩地的前胡藥材較其他產區效果更佳，且相關性分析得出該生物學效應與其活性成分前胡甲素、乙素含量呈正相關，該研究還為我國中醫理論現代化的發展提供有益的參考。