響應面法優化藜麥秸稈飼料發酵工藝的研究

余肖飛 ，郭曉農 ，2，3*，張妍 ，劉子威 ，張喜聞 ，徐可新 ，吳治勇

（1. 西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2. 西北民族大學生物醫學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3. 西北民族大學生物醫學研究中心中國?馬來西亞國家聯合實驗室，甘肅 蘭州 730030）

藜麥（Chenopodium quinoa）隸屬藜科藜屬，原產于南美洲安第斯山脈地區［1?2］。藜麥適應性強［3］，其秸稈含大量纖維素和木質素［4］，具有多種開發利用價值，逐漸成為植物飼料領域的研究熱點。藜麥種植地區包括歐洲的英國、法國、意大利，非洲的馬里和肯尼亞以及北美洲的美國和加拿大等國家和地區［5］。我國藜麥種植最早地區為西藏地區可追溯到20 世紀90 年代［6］。2019 年數據顯示，中國藜麥種植面積和總產量已躍居世界第三，主要種植區域覆蓋河西走廊、伊犁河谷、蒙古高原?烏蘭察布、柴達木盆地、四川盆地和云貴高原等地區。其中甘肅省種植面積最廣，達 3333 hm2。其次為內蒙古 2333 hm2、青海 1667 hm2、云南 1667 hm2、山西 1333 hm2、河北 1000 hm2［7］。我國對藜麥的研究仍處于育種、種植和初加工階段，對其秸稈營養價值及應用的研究相對較少［8］，主要涉及多糖、黃酮、皂苷等化學成分［9?10］。侯召華等［11］研究表明，藜麥皂苷具備抗氧化、抗腫瘤、抑菌、免疫調節等藥理活性，胡一晨等［12］研究表明，藜麥還富含維生素、必需氨基酸、礦物質（K、P、Mg、Ca、Zn、Fe）等養分。而其秸稈中亦含有有益于動物健康的天然抑菌成分。藜麥具有突出的飼用價值［13］。藜麥秸稈相對于其他作物秸稈含有較高的纖維素、木質素、蛋白質及脂肪等成分。而動物對纖維素和木質素的消化吸收利用的效率低。目前有關藜麥秸稈的開發應用研究較少，藜麥秸稈除了焚燒取暖之外，一般被棄置。本試驗利用微生物發酵技術改善藜麥秸稈飼料品質，同時通過響應面法（response surface methodology，RSM）優化處理。試驗選用產自甘肅省蘭州市紅古區的隴藜1 號，10 月刈割獲取藜麥秸稈作為試驗材料，試驗采用乳酸菌、釀酒酵母兩種微生物發酵藜麥秸稈，乳酸發酵可降低飼料pH 值，增加乳酸含量，降低丁酸含量，可抑制飼料中的致病菌和腐敗菌生長，改善動物腸道功能［14］；酵母是兼性微生物，厭氧發酵能夠獲得酒精、甘油、酶等代謝產物，耗氧發酵可以獲得酵母細胞或細胞組成成分［15］，在協同發酵［16］中可提供利于乳酸發酵的條件，開展不同微生物對藜麥秸稈飼料營養成分含量影響及差異分析，一方面變廢為寶，合理利用作物秸稈，另一方面通過不同菌種的合理搭配，進行協同發酵，提高發酵效率甚至可改善其養分結構。在發酵過程中，添加酶制劑黑曲霉（Aspergillus niger），其可產生纖維素酶、α?半乳糖苷酶和淀粉酶，在有效降低藜麥秸稈中纖維素及木質素的同時，也提高了飼料中淀粉、脂肪等養分的含量。纖維素和木質素含量明顯降低的發酵飼料對胃蛋白酶及胰蛋白酶的酶解抗性作用減弱，使藜麥秸稈更加蓬松柔軟，適口性更好，而有利于動物主動采食，更有利于生物降解和動物消化吸收［17］。目前，種植藜麥的農戶直接利用藜麥秸稈飼養綿羊等家畜，其飼用價值和經濟效益沒有得到很好的開發，本研究為藜麥秸稈的進一步開發利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用蘭州市紅古區種植的隴藜1 號藜麥秸稈，自然晾曬至表面枯黃，無霉變及腐敗跡象；發酵劑選用酵母菌（安琪酵母股份有限公司，2018-11-25）、乳酸桿菌（成都臻植生物科技有限公司，2019-02-13）與黑曲霉（濟寧玉園生物科技，2019-09-15）。

1.2 試驗設計

試驗始于2018 年5 月中旬，包括乳酸菌發酵、混合菌發酵以及黑曲霉對比發酵3 部分。乳酸菌發酵、混合菌發酵中均采用L（934）正交原理設計試驗，設定發酵時間、含水量和菌劑添加量（混合比例）3 個因素，每個因素下設 3 個水平（表 1?2）。李鳳玲等［18］研究表明，黑曲霉產酶豐富，可用于發酵飼料，其最佳發酵條件在70%含水量，25 ℃下培養42 h 以上，故在乳酸菌發酵的基礎上做關于黑曲霉對藜麥秸稈飼料的簡單對比試驗，以試驗組別4 作為空白對照，發酵時間為72 h，設計見表 3。

1.3 秸稈發酵

將藜麥秸稈經晾曬、風干后，利用秸稈粉碎機粉碎至粉末狀，每試樣取100 g。在無菌條件下按照試驗要求調節水分與菌劑含量，充分攪拌混勻，裝入密封袋內壓實密封，置于24.5 ℃下發酵3～7 d 后，進行營養成分測定分析。

表1 乳酸菌發酵藜麥秸稈飼料正交試驗因素水平Table 1 Levels of factors in orthogonal experiment of lactic acid bacteria fermenting quinoa straw feed

表2 混合菌發酵藜麥秸稈飼料正交試驗因素水平Table 2 Factors of orthogonal experiment on fermentation of quinoa straw feed by mixed bacteria

表 3 1～19 組試驗處理Table 3 Pilot group 1-19 test treatment

1.4 測定指標

1.4.1 粗蛋白（crude protein，CP）含量的測定 精確稱取1.0 g 試樣（凱氏定氮法），置于消化管中，加硫酸銅0.4 g，無水硫酸鉀6.0 g，混合均勻，加入濃硫酸20 mL 與瓷片兩小片，于電熱爐上加熱，待內容物全部炭化，至泡沫停止后，加強火力，至溶液呈透明的深藍色，加熱2 h，冷卻后使用海能K9842 自動凱氏定氮儀（濟南）進行測定。

1.4.2 粗脂肪（ether extract，EE）含量測定 精確稱取3.0 g 試樣（索氏抽提法），置于濾紙筒內，放入濾紙架，用磁鐵吸住濾紙架。干燥恒重抽提杯，記錄抽提杯質量，加入60 mL 石油醚。使用海能SOX406 脂肪測定儀（濟南）進行抽提。將抽提杯取下，置于干燥箱內，烘干水分及剩余有機溶劑，移入干燥器中冷卻后稱量，計算脂肪含量。

1.4.3 粗纖維（crude fiber，CF）含量測定 精確稱取2.0 g 試樣（酸堿法），將樣品放入已稱量過的干燥過濾坩堝。使用海能F800 纖維測定儀（濟南）測定。烘箱干燥后稱重，計算粗纖維含量。

1.4.4 可溶性糖（soluble sugar，SS）含量測定 配制蔗糖標準溶液（紫外可見分光光度法），使用島津UV-1800紫外分光光度計（上海）測定相對應的吸光度，繪制蔗糖標準曲線。精確稱取1.0 g 試樣，加入6～10 mL 蒸餾水，沸水浴30 min，3500 r·min?1離心10 min 取上清液，重提兩次。定容至50 mL，用島津UV-1800 紫外分光光度計測定吸光度。

1.5 數據分析

采用Excel 2010 整理數據繪圖，采用Design-Expert V8.0.6 進行響應面作圖，各項指標測定重復3 次。

2 結果與分析

2.1 感官品質測定

參照相關標準［19］制定適用于本試驗的感官質量評定標準（表4）。

表4 感官質量評定標準Table 4 Criteria for sensory quality assessment

根據表4 感官質量評定標準對19 組（3 個平行）共計57 個樣本進行測評（圖1）。其中試驗組1～9 為乳酸菌發酵，10～18 為混合菌劑發酵，19 為黑曲霉發酵。試驗組10 評分最高，為8.2 分。而組3 有輕微霉味；組4 臭味較重；組6 有輕微臭味；組13 和19 出現發粘和輕微板結現象；黑曲霉發酵中也出現較重霉味，以上組別飼料感官品質均不理想（圖1）。其余飼料則質地松軟，有適宜的酸香味。隨著含水量的升高和發酵時間的延長，會加大霉變的概率。當含水量為55%左右，發酵時間在3～5 d 時，飼料具有良好的感官品質。

圖1 藜麥秸稈發酵飼料感官品質測評Fig.1 Sensory evaluation of fermented feed from quinoa straw

2.2 營養性指標三維響應曲面線

乳酸菌單獨發酵藜麥秸稈粗纖維變化范圍為20.7%～23.1%；乳酸菌與酵母菌混合制劑發酵下藜麥秸稈粗纖維變化范圍為20.03%～20.71%。在相同含水量及發酵時間下混合發酵要比乳酸菌單菌降解纖維素作用更為明顯。而兩種不同的發酵劑作用下，纖維素最低含量出現在含水量為60%左右，發酵時間在72～100 h 的條件下，此時單菌發酵乳酸菌添加量為0.95 g左右，而混合發酵時混合比例為1.25，即非等比混合（圖2）。

圖2 藜麥秸稈飼料粗纖維三維響應面曲線Fig.2 Three-dimensional response surface curve of crude fiber of quinoa straw feed

未發酵的藜麥秸稈粗蛋白含量在10.14%～13.14%，單菌發酵后的藜麥秸稈粗蛋白含量在13.45%～15.26%，混合發酵粗蛋白變化范圍為13.72%～15.03%，粗蛋白平均含量提高了約2.70%（圖3）。從圖中可以明顯看出，含水量對粗蛋白含量有較大的制約，含水量過高或者過低都會使粗蛋白含量下降，最佳的含水量在58%左右。而在168 h 內粗蛋白含量與發酵時間呈正相關。

圖3 藜麥秸稈飼料粗蛋白三維響應面曲線Fig.3 Three-dimensional response surface curve of feed crude protein of quinoa straw

粗脂肪含量在發酵過程中波動范圍較小，未發酵的藜麥秸稈粗脂肪含量2.50%～2.60%，發酵后藜麥秸稈飼料粗脂肪含量可提高0.24%～0.31%。無論單一菌劑發酵還是混合菌劑發酵，對藜麥秸稈飼料中粗脂肪含量的提高有輕微的促進作用（圖4）。

圖4 藜麥秸稈飼料粗脂肪三維響應面曲線Fig.4 Three-dimensional response surface curve of ether extract in quinoa straw feed

乳酸菌發酵藜麥秸稈可溶性糖含量在21.54%～24.10%，混合菌發酵后的可溶性糖含量變化范圍為24.50%～27.10%，混合制劑對可溶性糖含量的提高要優于單一菌劑，平均提高了3%左右，可溶性糖含量的變化隨發酵時間的延長呈現先下降后升高的趨勢，峰值出現在發酵末期。出現這種情況的原因可能為發酵初期乳酸菌與酵母菌的新陳代謝會消耗部分糖分作為能源物質（圖5）。

圖5 藜麥秸稈飼料可溶性糖三維響應面曲線Fig.5 Three-dimensional response surface curve of soluble sugar in quinoa straw feed

2.3 黑曲霉對藜麥秸稈發酵飼料品質的影響

黑曲霉有助于降解纖維素與可溶性糖含量的提高，藜麥秸稈經黑曲霉發酵后粗纖維含量降低了1.88%，粗脂肪下降了0.02%，粗蛋白含量減少了0.04%，可溶性糖含量上升了1.30%（圖6）。圖中標出標準誤差線。黑曲霉發酵中營養指標含量分別為CF（20.47±1.41）%，EE（2.49±0.01）%，CP（13.80±1.16）%，SS（24.80±1.42）%；空白對照（乳酸發酵）組中營養指標含量分別為CF（22.35±1.52）%，EE（2.51±0.03）%，CP（14.20±1.56）%，SS（23.50±1.12）%；但在感官品質上，黑曲霉發酵的藜麥秸稈飼料與對照組的藜麥秸稈發酵飼料的感官品質均不佳，具有較濃的霉味與惡臭味。

圖6 黑曲霉發酵對各營養指標的影響Fig. 6 The effect of Aspergillus Niger fermentation on the nu?tritional indexes

3 討論

粗纖維是飼料中質地堅硬粗糙、適口性差、且牲畜飼用后不易消化的部分，它遍及植物莖葉和秕殼之中［20］。粗纖維中不僅富含纖維素，還包括一些半纖維素與木質素等，木質素是完全不被家畜消化的物質。粗纖維雖然消化利用率及營養價值低，但在家畜日糧中是不可缺少的成分。因為它體積大［21］，對家畜胃腸容積有一定擴充作用，家畜食后有飽腹感［22］，對家畜育肥有利。粗纖維有刺激胃腸蠕動的機械作用，有利于消化和排糞正常［23］。若飼料中含粗纖維量過多，不僅影響飼料品質，而且家畜不能直接利用粗纖維中的能量，進而影響家畜健康和畜產品品質。藜麥秸稈作為優質飼料的原料之一，其粗纖維含量低于玉米（Zea mays）秸稈，麥秸等，經乳酸菌、酵母菌發酵后粗纖維含量明顯降低。試驗結果表明乳酸發酵中纖維素最低含量為20.7%，波動范圍為2.40%；混合發酵纖維素含量最低為20.03%，波動范圍為0.68%；可見乳酸菌與酵母菌協同發酵處理藜麥秸稈中粗纖維含量明顯優于單菌發酵，而且混合發酵波動范圍小，纖維素降解效果更穩定。同時混合發酵組中最優發酵群出現在混合比例1.25（非等比混合）處，前期酵母發酵占主導地位為乳酸發酵創造有利條件，后期進行協同發酵，這也體現出混合發酵的優勢。酵母菌的添加為乳酸菌提供了良好的厭氧環境，保障了發酵過程中乳酸菌的新陳代謝。

粗蛋白質包含真蛋白質和非蛋白質含氮物（non-protein nitrogen，NPN）兩部分［24］，是家畜生長、發育、繁殖及生命活動所必需的基礎養分。在家畜飼養中，蛋白質應保障供給，特別是處在生長期的幼畜和產奶母畜。黃開武［25］研究表明，家畜日糧中如果粗蛋白質含量缺乏，會使家畜的健康、生長、發育、繁殖、生產水平及畜產品品質受到不同程度的影響。嚴重時，還會使家畜發生貧血、瘦弱、抗逆能力減退，乃至發病、死亡。基于這種狀況，在家畜飼養過程中必須使日糧粗蛋白質的含量達到一定的水平并保持。本試驗乳酸菌發酵中粗蛋白含量為13.45%～15.26%，變化范圍為1.81%，混合發酵中粗蛋白含量為13.72%～15.03%，變化范圍為1.31%。雖然乳酸發酵中粗蛋白含量出現了最高水平，但相比之下混合發酵波動范圍小，效果穩定，結果更具代表性，且混合發酵最低粗蛋白含量高出乳酸發酵0.27%，這也表明混合發酵對粗蛋白的保留能力強。出現混合發酵峰值低于乳酸發酵的可能原因有：1）混合發酵中酵母菌的新陳代謝會消耗部分蛋白質；2）酵母菌的厭氧反應不產蛋白及相關酶類。此外各種飼料蛋白質含量及品質差異較大［26］，而藜麥秸稈作為植物性秸稈飼料在蛋白質含量和品質上明顯劣于動物性飼料，也不及油餅類飼料、豆科植物及禾本科植物，故在后續實際生產中需補充其他蛋白質飼料。

粗脂肪包括真脂和類脂（如固醇、磷脂等）。脂肪在家畜飼養中用以維持體溫與供給體內各器官運動時所需要的能量，同時也是脂溶性維生素的攜帶者，若日糧中脂肪缺乏則影響這一類維生素的吸收和利用，容易導致家畜的脂溶性維生素缺乏癥。而日糧中脂肪酸的不足會妨礙家畜生長或引起死亡。飼料中添加適量的脂肪不僅能夠改善適口性，還能產生“額外的熱能效應”的有益作用。飼料中粗脂肪含量逾越5%，容易引起腹瀉或過肥，對于反芻畜還會抑制瘤胃微生物的繁殖，從而降低其消化功能［27］。本試驗乳酸發酵中粗脂肪峰值為2.67%，混合發酵中峰值為2.91%，經發酵后粗脂肪含量可提高0.24%～0.31%，首先藜麥秸稈作為植物性秸稈飼料，其含脂量是非常低的，但經微生物發酵后其脂含量小幅提高，出現這種結果與本試驗所選用的酵母菌種具產脂作用有必然的關系。

可溶性糖作為貯存在植物體組織中的營養物質，也是家畜所必需的養分。可溶性糖含量高低可衡量某一植物性飼料的實際應用價值，除提供家畜所需主要的能量外，也參與維持體內細胞滲透壓平衡。本試驗研究結果顯示乳酸菌發酵可溶性糖含量在21.54%～24.10%，峰值為24.10%；混合發酵可溶性糖含量為24.50%～27.10%，峰值為27.10%，相比之下混合發酵提高可溶性糖含量的作用更顯著。在發酵過程中，乳酸對糖的理論轉化率為50%［28］，乳酸菌和酵母菌雖消耗部分可溶性糖以供自身正常生理代謝，發酵后可溶性糖含量提高是罕見的，以后可做進一步探究。

此外，試驗過程中發現乳酸菌發酵藜麥秸稈飼料受含水量影響極為明顯，在含水量為65%以上時，極易受到雜菌感染，飼料顏色發黑且有霉味，原因可能是在含水量過高時，會影響乳酸菌糖化效果，導致發酵飼料溫度提升快而高，不利于乳酸菌生長，導致優勢菌種群發生變化，而協同發酵有利于對這種局面的調控。以后的試驗進程中可對菌株的選擇、搭配與使用做更細致的考慮。我國于2014 年才開始大面積種植藜麥，但是對于藜麥收獲后的副產品藜麥秸稈的利用率卻極低，研究表明藜麥有較高的開發利用價值，藜麥秸稈作為發酵飼料的利用也許是未來發展藜麥副產品生產的一個關鍵點。

4 結論

藜麥秸稈相對于玉米、小麥（Triticum aestivuml）秸稈，其具有蛋白含量高、粗纖維含量低，更接近于家畜日糧需要量的優點。藜麥秸稈生物量積累和品質表現均表明，藜麥秸稈是一種很有潛力的飼草原料。發酵后：1）混合發酵降解纖維素效果明顯，發酵后最低纖維素含量為20.03%；2）藜麥秸稈飼料較未發酵的藜麥秸稈粗蛋白平均含量提高了約2.70%；3）粗脂肪含量提升0.24%～0.31%；4）發酵后藜麥秸稈飼料平均可溶性糖含量提高了約3%。最佳發酵組為含水量為55%～60%，發酵時間為（120±10）h，混合比例為1～1.25。本試驗通過微生物發酵改善了藜麥秸稈的營養成分，達到了可飼用標準；同時也使藜麥秸稈飼料的品質得以提高。結果表明適當乳酸菌發酵藜麥秸稈增加了其粗蛋白與可溶性糖含量，這與乳酸菌能夠提高原料中蛋白的消化利用率的作用相符［29］，同時降解粗纖維作用明顯。協同發酵對發酵過程中霉變也起到一定的抑制作用。本研究為后續藜麥秸稈發酵飼料的進一步開發利用奠定了一定的基礎。