乳酸菌或有機酸鹽與尿素復配添加對紫花苜蓿混合青貯的影響

謝展 ，穆麟 ，張志飛 *，陳桂華 ，劉洋 ，高帥 ，魏仲珊

（1. 湖南農業大學農學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南德人牧業科技有限公司，湖南 常德 415921）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界上廣泛種植的多年生優質豆科牧草，營養價值高，適口性好，有“牧草之王”的美譽。隨著畜牧業的快速發展，近年來紫花苜蓿在我國南方也被廣泛推廣［1］，而南方氣候多變，苜蓿收獲期常遇雨季，干草曬制較為困難。羅穎潔等［2］表明利用新鮮紫花苜蓿與不同比例的水稻秸稈和麥麩進行混合青貯，可解決紫花苜蓿雨季安全貯藏的問題，同時可促進水稻秸稈飼料化，提高秸稈利用率，但水稻秸稈粗纖維含量較高，隨著水稻秸稈添加量增加，混合青貯的營養品質下降。而青貯添加劑的使用是提高青貯發酵品質和營養品質的有效途徑［3］。

青貯促進型添加劑乳酸菌有利于青貯料快速進入乳酸菌發酵階段，降低青貯料pH 值，抑制有氧發酵菌的生長，達到保存青貯料營養物質的目的［3］；青貯抑制型添加劑有機酸（鹽）能夠快速降低青貯料的pH 值，抑制青貯初期有害微生物的繁殖，減少青貯料發酵初期營養物質的損失，從而保證有更多的營養物質供乳酸菌繁殖利用產生有機酸，達到保存更多青綠飼草營養物質的目的［3?4］；青貯營養型添加劑尿素作為一種非蛋白氮，可增加青貯飼料中的粗蛋白質含量［5］，還可使青貯料的有氧穩定性延長［6］。全株玉米（Zea mays）青貯中復合添加乳酸菌和尿素能提高青貯料的乳酸和氨態氮含量，防止pH 值過分降低，提高粗蛋白質含量［7］；玉米青貯中添加丙酸和尿素效果也優于單獨添加效果［8］；皇竹草（Pennisetum sinese）青貯中復合添加乙酸和尿素亦有利于提高青貯的營養品質［9］。基于此可知，乳酸菌、有機酸與適量的尿素在青貯過程中可起到復配增效的作用。本研究以80%新鮮紫花苜蓿+10%水稻秸稈+10%麥麩（質量比）為青貯原料，探討乳酸菌或有機酸與不同比例尿素復配添加對混合青貯料發酵品質、營養品質和有氧穩定性的影響，比較紫花苜蓿混合青貯料中乳酸菌與有機酸和尿素復配的青貯效果，篩選適宜的添加劑組合。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫花苜蓿種植于湖南省常德市西湖管理區試驗地（海拔 32 m，112°03′46″E，29°07′04″N），2018 年 9 月 26 日第5 茬現蕾期刈割，粉碎至1～2 cm 待用。收獲當年的風干水稻秸稈粉碎至2～3 cm 待用。麥麩購自邯鄲市銳馬面業有限公司。青貯材料化學成分見表1。

表1 青貯原料化學成分Table 1 Chemical composition of ensilage materials

乳酸菌劑購自臺灣亞芯生物科技有限公司，含植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）及其他乳酸菌類，活菌數為1.0×1011cfu·g?1。有機酸鹽購自四川愛客信生物科技股份有限公司，含丙酸≥20%，丙酸銨≥15%，鉛≤10 mg·kg?1，砷≤2 mg·kg?1。尿素購自湖北省三寧化工股份有限公司，總氮＞46.5%。

1.2 試驗設計

本試驗采用雙因素試驗設計，因素A 為菌酸添加劑，設2 個水平：乳酸菌（lactic acid，LA）劑組，添加量2 g·t?1FW 和有機酸鹽（organic acid salt，AS）組添加量 1 g·kg?1FW；因素 B 為尿素添加量，設 4 個水平，添加量分別為 0（U0）、1.5（U1）、3.0（U2）和 4.5（U3）g·kg?1FW。共 8 個處理組，每處理組 6 次重復。

新鮮紫花苜蓿、水稻秸稈和麥麩的質量比例為8∶1∶1。首先將不同添加比例的尿素溶解于少量水中分別均勻噴灑在水稻秸稈上，再將乳酸菌或有機酸鹽均勻噴灑新鮮紫花苜蓿，然后二者與麥麩混合均勻；使用聚乙烯包裝袋真空包裝，每袋600 g。避光室溫（25 ℃）保存45 d 后，開包取樣測定各項指標。

1.3 指標與測定方法

開包后取20 g 青貯料裝入榨汁機（九陽JYL-C012 型多功能攪拌機），加入180 mL 去離子水，運行2 min，用2層無菌紗布過濾，再用定性濾紙進行過濾，得到青貯飼料浸提液，用于pH 值、乳酸（LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）、丁酸（butyric acid，BA）和氨態氮（ammonia-N，NH3-N）含量的測定，各指標3 次重復。pH 值采用Spectrum 公司SI400 型pH 計測定；乳酸含量使用高效液相色譜儀（Agilent 1260，美國）測定；乙酸、丙酸和丁酸含量使用氣相色譜儀（Agilent 7890A，美國）測定［10］；NH3-N 測定方法參照T/CAAA 003-2018 中的苯酚?次氯酸鈉比色法測定［11］。

其余青貯飼料四分法取150 g，65 ℃烘干48 h，測定干物質含量（dry matter，DM）；干樣用于粗蛋白（crude pro?tein，CP）、可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量的測定，各指標 3 次重復。CP 含量采用凱氏定氮法測定［12］，NDF 和ADF 含量采用范氏法測定［12］，WSC 含量采用蒽酮比色法測定［13］。根據 NDF 和 ADF 含量計算相對飼料價值（rel?ative feed value，RFV）［14］。

1.4 青貯飼料發酵品質的評分

參照日本草地畜產協會制定的青貯飼料發酵品質V-score 評分標準［15］，根據NH3-N/TN、AA、PA 及BA 含量計算V-score 評分，滿分為100 分，得分越高，發酵品質越好。

1.5 青貯飼料有氧穩定性分析

采用天賀MDL-1048A 高精度溫度記錄儀說（上海）進行采集開包后青貯料暴露在空氣中的實時溫度，每隔30 min 記錄一次溫度［16］。每個處理3 次重復，有氧暴露7 d 終止試驗。

1.6 統計分析

采用Excel 2007 和DPS 7.05 軟件進行數據處理以及雙因素方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 菌酸添加劑及尿素添加量對紫花苜蓿混合青貯營養品質和發酵品質的影響

雙因素方差分析結果表明（表2），菌酸添加劑種類對紫花苜蓿混合青貯pH 值和NH3-N/TN 均有顯著影響（P＜0.05），對AA 含量有極顯著影響（P＜0.01），對其他指標無顯著性影響（P＞0.05）；尿素添加量對紫花苜蓿混合青貯DM 含量有顯著影響（P＜0.05），對AA 含量和NH3-N/TN 有極顯著影響（P＜0.01），對其他指標無顯著性影響（P＞0.05）；菌酸添加劑和尿素添加量的交互作用對紫花苜蓿混合青貯AA 含量有顯著影響（P＜0.05），對 CP、NDF、ADF、RFV、pH 值、PA、BA 含量均有極顯著影響（P＜0.01）；對其他指標均無顯著影響（P＞0.05）。

2.2 菌酸添加劑對紫花苜蓿混合青貯發酵品質和營養品質的影響

菌酸添加劑多重比較表明（表 3），LA 組的 pH 值為 4.44，顯著低于 AS 組（4.75）（P＜0.05）；LA 組的 AA、PA、BA 含量和 NH3-N/TN 顯著低于 AS 組（P＜0.05）；LA 組的 LA 含量比 AS 組高，但不存在顯著差異（P＞0.05）。LA 組的 CP、RFV 指標顯著優于 AS 組（P＜0.05）；LA 組的 NDF、ADF、WSC 含量顯著低于 AS 組（P＜0.05）；LA 組的干物質含量高于AS 組，但無顯著差異（P＞0.05）。綜合來看，乳酸菌處理組的青貯效果好于有機酸鹽處理組。

2.3 尿素添加量對紫花苜蓿混合青貯發酵品質和營養品質的影響

尿素添加量多重比較表明（表4），U1組的pH 值最低（4.38），顯著低于其他處理組（P＜0.05），U3組的pH 值最高；各處理組的LA 含量不存在顯著性差異（P＞0.05），但隨著尿素添加量的增加，LA 含量有減少的趨勢；U3組的AA、PA 和 BA 含量和 NH3-N/TN 顯著高于其他 3 組（P＜0.05）；NH3-N/TN 隨尿素添加量的增加而顯著升高。U1組的 DM 含量顯著高于其他組（P＜0.05）；U0組的 CP 含量顯著低于 U1、U2和 U3組（P＜0.05），其中 U2組的 CP含量最高，為 17.52%；U1、U2和 U3組的 NDF 和 ADF 含量顯著低于 U0組（P＜0.05），其中 U1組最低，分別為37.40% 和 21.10%；U1、U2和 U3組的 RFV 顯著高于 U0組（P＜0.05），其中 U1組的 RFV 最高，為 180.56。綜合來看，U1和U2組的青貯效果優于U3和U0組。

表2 添加劑種類和尿素添加量對紫花苜蓿混合青貯的影響Table 2 Effects of additive types and different urea addition on alfalfa mixed silage

表3 菌酸添加劑對紫花苜蓿混合青貯營養品質和發酵品質的影響Table 3 Effects of different additives on fermentation quality and nutrient quality of the alfalfa mixed silage

2.4 尿素添加量對菌酸添加劑組紫花苜蓿混合青貯料pH 值、干物質和氨態氮/總氮的影響

分別對菌酸添加劑和不同尿素添加量混合青貯的pH、DM 和NH3-N/TN 進行單因素方差分析（表5），結果發現：乳酸菌作為添加劑時，U1組的干物質含量為41.77%，顯著高于其他3 組（P＜0.05），pH 值為4.27，顯著低于其他3 組（P＜0.05），其中U3組的pH 值最高。有機酸鹽作為添加劑時，U1組的干物質含量為40.77%，顯著高于U2和 U3組（P＜0.05），U1組的 pH 值為 4.48，顯著低于 U2、U3和 U0組（P＜0.05）。菌酸添加劑的氨態氮/總氮值均隨尿素添加量的增加而顯著上升（P＜0.05）。

表4 不同尿素添加量對紫花苜蓿混合青貯發酵品質和營養品質的影響Table 4 Effects of different urea dosage on fermentation quality and nutrient quality of the alfalfa mixed silage

表5 尿素對不同添加劑組紫花苜蓿混合青貯pH、干物質和氨態氮/總氮的影響Table 5 Effects of additives and urea on fermentation quality of the alfalfa mixed silage

2.5 尿素添加量對菌酸添加劑組紫花苜蓿混合青貯料有機酸含量的影響

乳酸菌作為添加劑時，各尿素添加組的LA、AA 和PA 含量不存在顯著差異（P＞0.05），僅U3組檢測出BA；V-score 值隨尿素添加量的增加呈下降趨勢，其中U3組最低，為69.29，其他各組均高于90.00。有機酸鹽作為添加劑時，各處理組的 LA 含量無顯著差異（P＞0.05）；U3組的 AA、PA 和 BA 含量顯著高于其他 3 組（P＜0.05）；U3組的V-score 值在同組中為最低，其他組評分均在87.67 分以上，屬于青貯發酵品質良好（表6）。

2.6 尿素添加量對菌酸添加劑組紫花苜蓿混合青貯料營養品質的影響

乳酸菌作為添加劑時，各尿素添加組的WSC 含量無顯著差異（P＞0.05）；CP 含量隨尿素添加量的增加呈顯著上升（P＜0.05）；U0組的ADF 顯著高于其他組（P＜0.05），其中U3組的ADF 最低（18.91%）；同時U0組的NDF含量最高（39.41%），顯著高于 U1和 U3組（P＜0.05），其中 U2組的 NDF 最低（35.94%）；各組的 RFV 均高于 U0組，U1和U3組的RFV 顯著高于U0組（P＜0.05）。有機酸鹽作為添加劑時，各試驗組的CP 含量顯著高于U0組（P＜0.05），其中 U2組的 CP 含量最高（17.79%），顯著高于其他組（P＜0.05）；U1和U2組的 ADF 和 NDF 的含量顯著低于U3和 U0組（P＜0.05），U1和 U2組的 RFV 顯著優于 U3和 U0組（P＜0.05）（表 7）。

表6 添加劑和尿素對紫花苜蓿混合青貯有機酸的影響Table 6 Effects of additives and urea on organic acid of the alfalfa mixed silage

表7 添加劑和尿素對紫花苜蓿混合青貯營養品質的影響Table 7 Effects of additives and urea on nutritional quality of the alfalfa mixed silage

2.7 添加劑和尿素對紫花苜蓿混合青貯料有氧穩定性的影響

各處理組在有氧暴露7 d 的過程中，溫度均沒有超過室溫2 ℃以上，無霉變發生，可見各處理組的有氧穩定性較好。

2.8 混合青貯效果的秩和比排序

對8 個酸菌+尿素添加量處理組合進行秩和比排序，以pH 為低優指標，乳酸含量、粗蛋白含量、RFV 和V-score 值為高優指標，計算秩和比RSR 值，RSR 值越高表示青貯效果越好，以RSR 值進行排序。結果表明，乳酸菌處理組的青貯效果普遍好于有機酸鹽處理組，其中LAU1和LAU2處理組的青貯效果最好，其次是LAU3處理組，LAU1和LAU2處理組的效果相似，ASU3處理組的青貯效果最差（表8）。

表8 混合青貯各項指標值及其RSR 排序Table 8 The index values of mixed silage and RSR sequence

3 討論

3.1 乳酸菌或有機酸鹽與尿素復配對混合青貯發酵品質的影響

pH 值、有機酸含量和氨態氮/總氮值是衡量青貯飼料發酵品質的重要指標。品質優良的苜蓿青貯飼料pH≤4.4，NH3-N/TN＜10%［17］。本試驗中乳酸菌各處理組的pH 值均低于有機酸鹽處理組，這可能是由于紫花苜蓿表面乳酸菌數量有限，添加外源乳酸菌能迅速幫助乳酸菌建立菌群優勢，利用青貯中的底物產生有機酸，降低青貯的pH 值；而有機酸鹽中主要成分是丙酸，丙酸能在青貯前期快速的降低青貯pH 值，但也會影響乳酸菌的繁殖，使青貯后期pH 值下降速度減慢；張增欣等［18］在多花黑麥草（Lolium multiflorum）青貯中添加丙酸，亦發現添加丙酸會在發酵初期抑制乳酸菌的增殖，降低了乳酸含量和青貯后期pH 值。

本研究中隨尿素添加量增加，紫花苜蓿混合青貯的pH 值和NH3-N/TN 值均顯著上升，這與榮輝等［19］在象草（Pennisetum purpureum）青貯中的研究結果相似；覃方銼等［20］也發現，燕麥（Avena sativa）捆裹青貯中添加0.4%的尿素較未添加對照組的NH3-N 顯著增加。常規青貯中的NH3-N 主要是來源于青貯初期牧草蛋白酶分解蛋白質產生的氨和胺，這也是青貯原料蛋白質損失的主要原因［21］。但添加尿素后，尿素釋放的NH4+可增加 NH3-N 和TN 含量，并升高pH 值。因此，青貯中尿素添加量不可過高，否則尿素中NH4+的堿性作用對乳酸菌的抑制會影響青貯正常發酵。

乳酸和揮發性有機酸的產生與發酵過程中同型乳酸菌、異型乳酸菌以及其他產酸微生物組成以及發酵底物、發酵環境密切相關［22］。琚澤亮等［23］發現，燕麥和箭筈豌豆（Vicia sativa）混播捆裹青貯40 d 時，添加0.4%尿素處理的乳酸和丙酸含量顯著低于未添加對照組，乙酸含量顯著升高。隨著青貯時間的延長，乳酸含量顯著增多，乙酸含量逐漸增多，而丙酸在青貯80 d 后檢測不到。Yunus 等［24］在象草（Pennisetum purpureum）青貯時添加糖蜜同時添加尿素較僅添加尿素的處理組的乳酸含量顯著增加，而乙酸含量顯著降低，但丁酸含量均較低，差異不大。Dos Santos 等［25］研究在高粱（Sorghum bicolor）青貯時分別加入 0.5%、1.0%、2.0% 和 4.0%DM 的尿素，青貯飼料的乳酸含量變化不大，且沒有規律性；尿素添加量≤1.0%DM 含量時，乙酸含量隨著尿素添加量增加而顯著增加，但尿素添加量為2.0%DM 和4.0%DM 時，乙酸含量與1.0%DM 尿素添加處理組相差不大；添加尿素處理組的丁酸含量相差不大，但比未添加的對照組高。本研究中乳酸菌作為添加劑時，不同尿素添加量各組間乳酸、乙酸和丙酸含量均無顯著性差異，而添加有機酸鹽時，U3組的乳酸含量低于U1、U2和U0組，而U3組的乙酸和丙酸含量顯著高于U1、U2和U0組。可見，尿素與乳酸菌、有機酸或糖蜜等添加劑進行復配使用時，對青貯發酵品質的影響不盡相同，需對青貯發酵過程中微生物構成、乳酸菌類型以及發酵底物等進行深入研究才可明確尿素在青貯發酵過程中的作用機理。

3.2 乳酸菌或有機酸鹽與尿素復配對混合青貯營養品質的影響

CP 含量是評價青貯飼料營養品質最重要的指標之一。添加尿素可以增加青貯飼料中CP 含量，這在很多研究中得到證實［5，9，25］。Dos Santos 等［25］在高粱青貯中添加尿素發現，青貯飼料的 CP 含量隨尿素添加呈線性極顯著增加（P＜0.01）。本研究中乳酸菌添加組CP 含量隨著尿素添加量的增加顯著升高，但有機酸添加組的CP 含量在尿素添加量為 0、1.5、3.0 g·kg?1FW 時，隨著尿素添加量顯著增加，但當尿素添加量為 4.5 g·kg?1FW（ASU3）時，CP 含量顯著低于ASU2處理組，但顯著高于ASU1和U0處理組，這可能是因為青貯過程中過量尿素會使青貯發酵環境pH 上升，使喜中性偏堿性環境（pH 7.0～7.4）的梭菌（Clostridiumspp.）滋生，而梭菌可降解青貯飼料中有機氮化物，產生氨態氮、丁酸和胺等腐敗物質，使得青貯飼料CP 含量低于其他處理組。本研究中ASU3處理組的氨態氮和丁酸含量高于其他處理組，也間接說明有機酸鹽與過量尿素添加可能會促進梭菌滋生。

高粱青貯中添加尿素會使青貯飼料的NDF 含量與尿素添加量呈線性負相關（P＜0.05），尿素添加量為1.0%DM、2.0%DM 和4.0%DM 時，ADF 含量較未添加對照低［25］。本研究中乳酸菌組添加尿素的青貯料中NDF、ADF 含量均低于未添加處理組，這可能是因為尿素水解后產生的OH?作用于細胞壁，破壞木質素分子間的鍵，同時NH4+的親水性促進了細胞壁的膨脹，導致青貯飼料中非結構性碳水化合物成分含量下降，導致NDF含量和ADF 含量下降；有機酸組添加尿素的青貯料中NDF 含量均低于未添加對照組，U3處理組的ADF 高于U0處理組，但沒有顯著性差異，U1和U2處理組的ADF 顯著低于U0組。可見，尿素在青貯過程中并不能像氨化反應一樣，完全發揮氨解反應，這可能與青貯的酸性環境與尿素的有限用量有關。

4 結論

乳酸菌添加劑處理組的紫花苜蓿混合青貯飼料的pH、氨態氮/總氮和營養品質均顯著優于有機酸鹽處理組（P＜0.05）；紫花苜蓿混合青貯中氨態氮/總氮值含量隨尿素添加量增加呈上升趨勢；添加乳酸菌的同時添加1.5或3.0 g·kg?1FW 的尿素，紫花苜蓿、稻秸和麥麩混合青貯效果最佳。