CYP2C19基因多態性與急性腦梗死患者中氯吡格雷抗血小板效果的分析

郁金鳳

（南京大學醫學院附屬鼓樓醫院輸血科，江蘇 南京 210008）

研究表明，拜阿司匹林聯合P2Y受體拮抗劑的抗血小板治療對改善急性期腦梗死患者的預后和降低復發率至關重要[1]。氯吡格雷是國內常用的P2Y受體拮抗劑，然而，臨床研究發現部分患者常規服用氯吡格雷后仍有發生血栓事件的風險[2]，分析原因顯示，CYP2C19基因多態性是造成氯吡格雷反應變異性的原因之一，既往研究顯示，攜帶1 種或2 種CYP2C19變異等位基因的患者將氯吡格雷轉化為活性代謝產物的能力降低[3]，因此，CYP2C19基因多態性是在基因層面決定氯吡格雷治療對血小板功能影響的重要原因。目前有多種方法可檢測血小板功能，PFA-200 P2Y法是近年來新興的血小板功能檢測方法，被用于氯吡格雷的藥效檢測。有研究評估了PFA-200 P2Y法與其他常用血小板功能檢測方法對口服氯吡格雷患者血小板功能檢測結果的差異[4-5]，但CYP2C19基因多態性聯合PFA-200 P2Y法評價氯吡格雷臨床療效的相關性研究較少。基于此，本研究探究PAF-200 P2Y和LTA兩種方法檢測氯吡格雷治療后的血小板功能，進而評估CYP2C19基因多態性與氯吡格雷臨床療效的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性研究分析2018 年1 月至2018 年12月就診于本院的72 例急性期腦梗死患者的臨床資料，其中男43 例，女29 例；年齡20～89 歲，平均（64.03±11.34）歲。患者家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會審核批準。納入標準：符合中國急性缺血性腦卒中診療指南中的診斷標準；發?。?4 d；年齡＞18歲；頭顱CT 或MRI 診斷有新發腦梗死。排除標準：存在氯吡格雷或阿司匹林過敏史；NHISS＞18分；近3個月有嚴重的出血性疾病、嚴重外傷、手術患者；服用對血小板功能有影響的藥物；妊娠期或哺乳期患者；嚴重肝腎功能損傷，腎小球濾過率（eGFR）＜20 mL/（min·1.73m2）；血小板計數（PLT）≤100×109/L，紅細胞壓積（HCT）＜30%。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料采集 采集患者基本資料及腦血管疾病相關危險因素，包括性別、年齡、身高、體重指數、個人史、既往病史、用藥情況、實驗室檢查結果、住院時間、有無急性期并發癥等內容。

1.2.2 主要試劑與儀器 小板功能分析儀PFA-200 及配套INNOVANCE PFA P2Y 試劑盒（德國SIEMENS），CRONO-LOG Model 700 血小板聚集儀及ADP 試劑（美國CHRONO-LOG），3.2%枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管。

1.2.3 PFA-200 P2Y檢測血小板閉合時間 嚴格按照產品配套說明書進行操作，首先查看觸發液是否足夠，待儀器加熱至37 ℃，進行自我測試。之后，將800 μL枸櫞酸鈉抗凝全血加入到P2Y試劑盒中，實驗結果記錄為血小板閉合時間CT（單位s）。＞300 s的檢測結果儀器顯示為“non-closure”，為便于統計分析，將“non-closure”結果記錄為300 s。

1.2.4 LTA檢測ADP誘導的最大血小板聚集率（LTA-ADPMAX）取3.2%枸櫞酸鈉抗凝靜脈血，首先1 500 g離心15 min獲得富血小板血漿（platelet rich plasm，PRP），取500 μL加入反應杯中；剩余標本1 500 g離心15 min獲得貧血小板血漿（platelet poor plasm，PPP）。以PPP為參照，在PRP中加入ADP誘導劑（終濃度5 μmol/L）誘導血小板聚集，透光度改變的最大值記錄為最大血小板聚集率（LTA-ADPMAX）。

1.2.5 氯吡格雷抵抗（CR）診斷標準及分組 以傳統血小板功能檢測方法LTA（吸光度比濁法）為檢驗的金標準，根據Agarwal等相關研究結果，將LTA-ADPMAX＞50%定義為CR[6]。

1.2.6 CYP2C19 基因檢測 CYP2C19 基因型檢測由本院病理科完成。根據CYP2C19 基因型結果，將CYP2C19 基因野生純合子*1/*1 定義為為氯吡格雷快代謝型（extensive metabolizers，EM）；野生型和突變基因雜合子*1/*2 或*1/*3為氯吡格雷中間代謝型（intermediate metabolizers，IM），將純合子突變*2/*2、*3/*3、雜合雙突變*2/*3 定義為慢代謝型（poor metabolizers，PM）。

1.3 觀察指標 所有患者均服用氯吡格雷＞3 d 后，采用PFA-200 P2Y、LTA兩種方法測定血小板功能。分析CYP2C19基因多態性與血小板功能檢測結果、CR 發生率及住院時間的關系。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗，計數資料用[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗，采用Pearson 相關系數和簡單線性回歸分析PFA200、LTA檢測結果的相關性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組臨床資料比較 根據CYP2C19 基因型結果分為快代謝組（EM 組，n=27）、中間代謝組（IM 組，n=32）、慢代謝組（PM 組，n=13），占比分別為37.5%、44.4%、18.1%，其中45 例（62.5%）患者攜帶CYP2C19*2 或*3 等位基因突變。3 組患者年齡、性別、BMI、吸煙史、既往史、實驗室檢查等臨床資料比較差異無統計學意義，見表1。

表1 3組臨床資料比較Table1 Comparison of clinical date among three groups

2.2 3 組PFA-200 法與LTA 法檢測CR 發生率比較 EM 組患者PFA200 P2Y 檢測的血小板功能閉合時間為（287.04±46.03）s，長于IM 組（226.66±93.43）s 和PM 組（189.00±117.21）s，差異有統計學意義（P＜0.05）。EM 患者LTA 法檢測ADP 誘導的最大血小板聚集率為（47.74±22.97）%，低于IM組（53.11±26.01）%和PM組（69.00±17.95），差異有統計學意義（P＜0.05）。PFA-200 P2Y 檢測法和LTA 法均顯示EM組、IM 組和PM 組CR 發生率分別為11.1%、15.6%、46.2%和44.1%、50.0%、92.3%，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 PFA-200 P2Y 與LTA 血小板功能檢測相關性分析Pearson 相關性和簡單線性回歸分析顯示，PFA-200 P2Y 與LTA 檢測結果呈負相關性（r=-0.365，P=0.001），回歸方程為PFA（s）=312.65-1.41LTA（%）。

2.4 3組患者住院時間比較 EM組、IM組和PM組患者住院時間分別為（11.04±3.31）、（11.31±3.97）、（10.77±5.24）d，差異無統計學意義。

3 討論

抗血小板治療是急性期腦梗死的特異性治療方法之一，氯吡格雷作為一種抗血小板藥物已廣泛應用于腦梗死的治療。POINT 研究顯示，發病早期（12 h 內）使用阿司匹林聯合氯吡格雷治療90 d可降低缺血性卒中復發風險[7]。然而，氯吡格雷的效果存在個體差異，部分患者對氯吡格雷反應低下，稱為氯吡格雷抵抗。在研究氯吡格雷抵抗的各種機制中發現，細胞色素P450酶同工酶系統中的CYP2C19基因在氯吡格雷的代謝過程中起關鍵作用。氯吡格雷為血小板P2Y12受體拮抗劑，本身是一種無藥理活性的前體藥物，經消化道吸收后，約85%的藥物在腸道被酯酶水解為無活性物質，15%經肝臟CYP450酶介導的兩步氧化過程代謝為活性產物。其活性代謝產物通過與血小板表面受體P2Y12 結合抑制血小板的活化和聚集，從而發揮抗血栓作用。CYP2C19基因在氧化過程中均發揮作用[8]。

CYP2C19基因具有高度多態性。Zhang等[9]研究顯示，亞洲人群中CYP2C19*2、CYP2C19*3 變異等位基因攜帶者比例達60%，明顯高于高加索人群（約30%）。本研究中CYP2C19*2、*3 變異等位基因攜帶者比例為62.5%，與上述報道類似。既往研究顯示攜帶CYP2C19 功能缺失型等位基因的患者口服氯吡格雷治療PCI 術后心肌梗死患者具有更高的心血管事件發生率[10]，而在腦梗死患者中，Jia 等[11]研究發現，CYP2C19 基因多態性對氯吡格雷抵抗的發生和疾病的預后有很大影響，Sun等[12]研究顯示，攜帶CYP2C19功能缺失型等位基因的腦梗死患者具有發生心血管事件的高風險，因此，對于服用氯吡格雷抗血小板的腦梗死患者，檢測CYP2C19基因型顯得尤為必要。本研究發現3 種代謝類型患者CR 發生率比較差異有統計學意義（P＜0.05），與既往報道結果類似[13]。3種代謝類型住院時間比較差異無統計學意義，但由于隨訪時間較短，本研究并未分析不同代謝類型與急性期腦梗死患者再發心腦血管不良事件的關系。

為觀察血小板對氯吡格雷治療的反應性，目前臨床上應用多種檢測方法檢測血小板功能。最常用的血小板功能檢測方法有LTA、VerifyNow、TEG、流式細胞術及PFA-200 P2Y法等[14]。本研究采用LTA、PFA-200 P2Y 兩種方法評估血小板的功能。LTA是最早應用于臨床檢測血小板功能的方法，目前仍被認為是血小板功能檢測的金標準。LTA 通過測量ADP 誘導的富血小板血漿的光學透光度改變評估血小板功能。本研究顯示通過LTA 方法可發現不同代謝類型氯吡格雷藥效比較差異有統計學意義（P＜0.05）。PFA-200 P2Y 是近年來新興的血小板功能檢測方法，具有操作簡便、所需時間短、樣本量少、無需繁瑣分析前樣本準備等優點，PFA-200 P2Y 檢測方法可模擬體內血管損傷時，高剪切力下血小板的粘附和聚集功能，具有廣泛的臨床應用前景。Lim等[15]研究顯示，PFA-200 P2Y檢測的血小板功能閉合時間（Cut-off值=106 s）可以作為急性冠脈綜合征患者再發心臟不良事件的預測指標。而Breet等[16]研究顯示通過PFA-100檢測發現HPR（Cut-off值=236 s）與支架內血栓、缺血性梗死等臨床不良結局之間并無相關性。在急性腦梗的臨床研究中，目前并沒有臨床報道顯示PFA-200 P2Y 檢測結果與腦梗臨床預后的關系。本研究結果顯示，與其他血小板功能檢測方法相比，EM、IM、PM 3種代謝類型PFA-200 P2Y檢測值比較差異有統計學意義（P＜0.05）。通過定義血小板閉合時間Cut-off 值為106 s，本研究發現3種不同代謝類型氯吡格雷抵抗發生率比較差異有統計學意義。此外，PFA-200 P2Y檢測方法與LTA檢測方法具有中等程度的相關性。由于PFA-200 P2Y檢測的最大閉合時間為300 s，超過300 s就顯示為non-closure，對于PFA-200 P2Y檢測的最佳Cut-off值各研究之間報道也存在差異[17],且有可能相關研究樣本量較少，目前僅有少數研究顯示PFA-200 P2Y檢測方法與其他血小板功能檢測方法具有良好的相關性[4，18]，因此，未來需要更多的臨床樣本評估PFA-200 P2Y檢測血小板功能的敏感性和特異性。根據CYP2C19基因多態性，本研究未納入超快代謝型患者，未來需進一步增加研究的樣本量，延長患者的隨訪時間，評估PFA-200 P2Y的檢測的血小板功能與急性期腦梗死患者預后的關系。

綜上所述，約62.5%的接受氯吡格雷治療的急性期腦梗死患者攜帶CYP2C19*2、*3變異等位基因，PFA-200 P2Y檢測血小板功能發現氯吡格雷臨床療效與CYP2C19 基因型之間有明顯相關，可為臨床治療提供依據。