零陵香總黃酮提取工藝優(yōu)化

唐 森， 楊舒茵， 謝濟(jì)運(yùn)， 吳國(guó)勇， 張 鵬*

（1.廣西科技師范學(xué)院食品與生化工程學(xué)院，廣西來賓546199；2.廣西科技師范學(xué)院特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西來賓546199；3.廣西科技師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，廣西來賓546199）

零陵香為報(bào)春花科植物零香草的干燥全草，又稱為靈香草、香草、排草、佩蘭等。主產(chǎn)于廣西金秀、融水等地，始載于《嘉佑本草》，味屬辛、甘（張智圓等，2013）。水煎液具有祛風(fēng)解表、行氣止痛的功能，多用于頭痛鼻塞、胸悶腹脹、齒痛等癥狀（周博，2011）。由于零陵香具有香氣，以往對(duì)其化學(xué)成分的研究多集中于石油醚、乙酸乙酯、乙醚、甲醇等脂溶性部位，報(bào)道成分種類以脂肪酸、黃酮苷、三萜為主（唐雪陽(yáng)等，2017；閆旭宇等，2017；樓鳳昌等，1989）。 但對(duì)于零陵香總黃酮提取工藝鮮有研究。本研究采用微波輔助提取零陵香總黃酮，以期通過響應(yīng)面分析法將零陵香總黃酮提取工藝得到最大優(yōu)化，提高零陵香原料的利用率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 零陵香，購(gòu)于亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司， 經(jīng)廣西科技師范學(xué)院特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定為零陵香； 蘆?。ǔ儯虾０⒗∩萍脊煞萦邢薰?；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫均為分析純，西隆科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 FW135 型中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；FA2004B 型電子分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；XH-MC-1 型祥鵠微波合成反應(yīng)儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；KQ-300DB 型數(shù)控超聲波清洗器， 昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水多用真空泵，鞏義市科瑞儀器有限責(zé)任公司；C-20 型玻璃儀器氣流烘干器，上海貝侖儀器設(shè)備有限公司；UV-9600型紫外/可見分光光度計(jì)，北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)）公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 參照王宗成等（2016）的方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2—Al（NO3）3—NaOH法測(cè)定蘆丁含量并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=11.966X-0.0096，R2=0.9993，表明線性關(guān)系良好。

1.3.2 零陵香總黃酮的提取及測(cè)定 用電子天平準(zhǔn)確稱取1.00 g 零陵香粉末至于圓底三頸燒瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為溶劑，用篩子塞住瓶口，浸泡30 min。 按照試驗(yàn)方案調(diào)整相應(yīng)的液料比、微波時(shí)間、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行提取，待樣液冷卻至室溫后，進(jìn)行真空抽濾，再移至容量瓶定容， 得到試驗(yàn)待測(cè)溶液。 精密移取2 mL 供試品稀釋溶液至10 mL 具篩比色管中，加入5% NaNO20.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%Al（NO3）30.3 mL，搖 勻，靜 置6 min，加 入10%NaOH 3.0 mL，搖勻，靜置15 min。 用分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)（510 nm）處測(cè)定吸光度值（A）。計(jì)算零陵香黃酮得率。 將吸光度（A）代入，得到蘆丁回歸方程， 可得測(cè)定的供試品稀釋溶液的黃酮濃度（C），再計(jì)算出樣品中黃酮得率：

式中：C為稀釋后提取液中黃酮含量，mg/g；V為提取液體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；M 為植物粉末質(zhì)量，g；B 為吸取測(cè)定體積，mL。

1.3.3 黃酮提取的單因素試驗(yàn) 乙醇體積分?jǐn)?shù)：稱取零陵香粉末1.00 g 于三頸圓底燒瓶中，依次加入50 mL 乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%和90%的乙醇，浸泡30 min。設(shè)定微波溫度為60 ℃，微波時(shí)間為6 min，微波功率為600 W，進(jìn)行微波提取零陵香總黃酮。

微波時(shí)間：稱取零陵香粉末1.00 g 于三頸圓底燒瓶中， 加入50 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，浸泡30 min。 設(shè)定微波溫度為60 ℃，微波時(shí)間分別為6、9、12、15、18、21 min， 微波功率為600 W，進(jìn)行微波提取零陵香總黃酮。

微波功率：稱取零陵香粉末1.00 g 放入250 mL三頸圓底燒瓶中，加入50 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，浸泡30 min。 設(shè)定微波溫度為60 ℃，微波時(shí)間分別為15 min， 微波功率為300、400、500、600、700 W，進(jìn)行微波提取零陵香總黃酮。

液料比：稱取1.00 g 零陵香粉末，分別加入液料比為40：1、50：1、60：1、70：1、80：1（mL/g），體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，浸泡30 min。 設(shè)定微波溫度為60 ℃，微波時(shí)間分別為15 min，微波功率為600 W，進(jìn)行微波提取零陵香總黃酮。

1.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果， 分別選取相應(yīng)的單因素： 乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、微波時(shí)間（B）、微波溫度（C）和液料比（D）為自變量（X），零陵香總黃酮含量為響應(yīng)值（Y），再由Box-Behnken 的原理，設(shè)計(jì)4 因素3 水平的中心響應(yīng)面試驗(yàn)，其中心點(diǎn)為最佳工藝條件，以此得到提取零陵香總黃酮的最優(yōu)得率， 試驗(yàn)的響應(yīng)面因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)零陵香總黃酮得率的影響由圖1 可見，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，黃酮類化合物的得率不斷升高。 乙醇體積分?jǐn)?shù)為60% ～70%時(shí)，趨勢(shì)最陡，黃酮得率變化最快。 但乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%以后，黃酮得率逐漸平緩且呈下降趨勢(shì)。 這是由于高濃度的乙醇造成了蛋白質(zhì)的下降，使黃酮無法浸出，得率下降。另一方面，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)提高時(shí)，溶液的顏色加深，零陵香樣品里的色素也因此被提取出來（楊帆等，2018）。綜合考慮零陵香總黃酮得率、能量資源消耗等因素，以乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的溶液作零陵香總黃酮的最佳提取條件。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響

2.1.2 微波時(shí)間對(duì)零陵香總黃酮得率的影響 由圖2 可知，零陵香總黃酮得率在微波時(shí)間為15 min時(shí)達(dá)最大值。 提取時(shí)間小于15 min 時(shí)，黃酮得率隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，物質(zhì)的熱運(yùn)動(dòng)加快，使零陵香總黃酮能夠更容易被提取出來。 但微波時(shí)間超過15 min 后，黃酮得率逐漸下降。 黃酮在高溫條件下易發(fā)生氧化，提取時(shí)間過長(zhǎng)，使黃酮得率反而降低；加熱時(shí)間過短時(shí)，溫度較低，不利于黃酮的提?。ò钡?，2018）。綜合考慮零陵香總黃酮得率和能量資源消耗等因素，以微波時(shí)間為15 min作零陵香總黃酮的最佳提取條件。

圖2 微波時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

2.1.3 微波功率對(duì)零陵香總黃酮得率的影響 由圖3 可知，微波功率為600 W 時(shí)，零陵香總黃酮得率達(dá)最大值。 微波功率為300～600 W 時(shí)，黃酮得率隨著微波功率的加大而升高，600 W 以后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。 微波功率是微波能量的直接體現(xiàn)，在合適的微波功率范圍內(nèi)， 微波功率越大破壁效果越好。過大的微波功率雖然在初期有利于零陵香總黃酮的溶出，但是隨后會(huì)產(chǎn)生局部過熱現(xiàn)象，破壞黃酮的結(jié)構(gòu)。 故選擇600 W 的微波功率為最佳條件。

圖3 微波功率對(duì)黃酮得率的影響

2.1.4 液料比對(duì)零陵香總黃酮得率的影響 由圖4 可知，料液比為40 ～ 60 mL/g 時(shí)，黃酮得率隨著液料比的增大而增大，60 mL/g 時(shí)黃酮得率最高。液料比小， 零陵香總黃酮在乙醇溶劑中的傳質(zhì)速率慢，得率??；綜合考慮得率和能源消耗等因素，選擇60 mL/g 為最佳液料比。

圖4 液料比對(duì)黃酮得率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 結(jié)合單因素試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、微波時(shí)間（B）、微波功率（C）和液料比（D）4 個(gè)因素，以零陵香總黃酮得率（Y）為指標(biāo)，設(shè)計(jì)5 個(gè)中心點(diǎn)，即A、B、C、D四個(gè)因素的水平均為“0”的重復(fù)試驗(yàn)，具體設(shè)計(jì)如表2。 在Design expert 軟件進(jìn)行回歸分析，計(jì)算得零陵香總黃酮得率（Y）對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、微波時(shí)間（B）、微波功率（C）和液料比（D）的二元多項(xiàng)回歸方程：Y=18.25+0.50A+0.095B+0.16C+0.10D+0.42AB +0.18AC +0.027AD -0.047BC -0.18AC -0.027AD-0.65A2-0.33B2-0.4C2-0.095D2。

由表3 分析結(jié)果可知，R2=0.9720， 表明響應(yīng)值總黃酮得率的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間的擬合度較高， 可以用來預(yù)測(cè)和優(yōu)化零陵香總黃酮提取的工藝條件， 試驗(yàn)方法可信度較大。 而試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜值＜0.0001，表明該模型回歸有極顯著差異；且失擬值P=0.0741（即P ＞0.05），差異不顯著，建立模型數(shù)據(jù)成立。

由響應(yīng)面分析結(jié)果中二次回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)A（F=173.58）、二次項(xiàng)A2（F=158.37）、B2（F=41.30）、C2（F=61.06）和交互項(xiàng)AB（F=40.26）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著性影響。 一次項(xiàng)B、C、D 和交互項(xiàng)AC、BD、CD 有顯著性影響。綜合以上因素分析， 表明考察因素對(duì)零陵香總黃酮的得率存在交互綜合影響作用。 比較F 值大小可反映出各因素對(duì)指標(biāo)的影響規(guī)律， 一次項(xiàng)影響零陵香總黃酮得率的主次因素為：A＞C＞D＞B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波功率＞液料比＞微波時(shí)間；交互項(xiàng)影響零陵香總黃酮得率的主次因素為：AB＞CD＞BD＞AC＞BC＞AD； 二次項(xiàng)影響零陵香總黃酮得率的主次因素為：A2＞C2＞B2＞D2， 即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波功率＞微波時(shí)間＞液料比。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 等高線圖和響應(yīng)面分析 運(yùn)用Design-Expert8.0.6 軟件對(duì)零陵香總黃酮得率響應(yīng)值分析作圖， 得到由響應(yīng)值A(chǔ)、B、C、D 四個(gè)因素所構(gòu)成的三維空間圖及其三維空間在二維平面上的等高線圖。響應(yīng)面坡度相對(duì)平緩，表明可以忍受處理?xiàng)l件的變異， 等高線圖中同一橢圓形區(qū)域內(nèi)表示得率相同，中心越高，越向邊緣擴(kuò)散越低，且橢圓曲線排列越緊密表明該因素對(duì)總黃酮得率影響越大。 同時(shí)，等高線越接近圓形，說明兩因素交互作用越弱，越接近橢圓形，交互作用越顯著。 分析結(jié)果見圖5 ～ 10。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

由圖5 可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波時(shí)間的3D響應(yīng)面圖坡度較為陡峭， 表明響應(yīng)值對(duì)這兩種工藝條件的改變較為敏感， 等高線圖中的等高線接近橢圓形， 說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波時(shí)間交互作用對(duì)零陵香總黃酮得率的作用效果更強(qiáng)。

圖6 中3D 響應(yīng)面圖坡度相較于圖5 更為平緩，等高線圖也更接近圓形。表明在提取零陵香總黃酮的試驗(yàn)中， 乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波功率的交互作用比乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波時(shí)間交互作用的顯著性更弱。

在圖7 的三維響應(yīng)面圖中， 清晰的看到當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定時(shí)， 黃酮含量的趨勢(shì)呈直線型遞增，數(shù)值變化較?。划?dāng)液料比固定時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，黃酮得率變化較大且出現(xiàn)最大值。其等高線圖接近圓形， 因此乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的作用效果不顯著。

圖5 總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波時(shí)間變化的響應(yīng)面與等高線圖

結(jié)合圖8 的兩個(gè)圖可直觀地看出， 隨著微波功率的加大和微波時(shí)間的延長(zhǎng)， 黃酮得率都呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，但兩個(gè)因素的交互作用，使黃酮得率先增大后減小，響應(yīng)面的坡度較為平緩，黃酮得率變化不大。 另這兩個(gè)因素的等高線圖趨近于圓形，所以微波時(shí)間和微波功率的交互作用對(duì)零陵香總黃酮得率的影響不顯著。

從圖9 可知， 液料比和微波時(shí)間的交互作用影響，黃酮得率先增大后減小，等高線圖呈現(xiàn)橢圓狀，表明液料比和微波時(shí)間的作用效果顯著。

圖6 總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波功率變化的響應(yīng)面與等高線圖

從圖10 中的三維響應(yīng)面圖可以看出，微波功率的黃酮含量變化大于液料比； 其等高線圖呈橢圓形，說明微波功率和液料比的交互作用顯著，且微波功率的顯著性大于液料比。

2.3 最佳條件的預(yù)測(cè)以及驗(yàn)證試驗(yàn) 運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件分析，預(yù)測(cè)出的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)74.52%， 微波時(shí)間17.39 min， 微波功率588.66 W，液料比68.41 mL/g，黃酮含量為18.51 mg/g，即黃酮得率為1.851%。 綜合考慮試驗(yàn)結(jié)果、儀器條件和經(jīng)濟(jì)成本， 確定零陵香總黃酮最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%， 微波時(shí)間17 min，微波功率600 W，液料比68 mL/g。 通過3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)， 提取得到的零陵香黃酮含量為18.29 mg/g，即黃酮得率為1.829%。與預(yù)測(cè)值相差1.18%。 實(shí)際值與預(yù)測(cè)值非常接近，說明采用響應(yīng)面方法得到的回歸模型，結(jié)果真實(shí)可信。

圖7 總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比變化的響應(yīng)面與等高線圖

圖8 總黃酮得率隨微波功率和微波時(shí)間變化的響應(yīng)面與等高線圖

圖9 總黃酮得率隨微波時(shí)間和液料比變化的響應(yīng)面與等高線圖

圖10 總黃酮得率隨微波功率和液料比變化的響應(yīng)面與等高線圖

3 結(jié)論

本試驗(yàn)最終優(yōu)化得到零陵香總黃酮提取的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，微波時(shí)間17 min，微波功率600 W，液料比68 mL/g。 并且所得到的工藝條件參數(shù)可行性強(qiáng)，重復(fù)性好。