黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的累加細胞毒性研究

王曉敏， 常 娟， 王 平， 尹清強*， 劉超齊， 朱 群， 彭 峰， 楊小進

（1.河南農業大學動物科技學院，河南鄭州450046；2.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉453000；3.河南省正陽種豬場，河南正陽463612；4.洛陽歐科拜克生物技術股份有限公司，河南宜陽471611）

霉菌毒素廣泛存在于糧食和動物飼料中，其是由真菌產生的有毒次級代謝產物（Cimbalo 等，2020），目前大約有100 多種真菌產生300 多種霉菌毒素（Wei 等，2019）。 我國2018 年飼料和原料中霉菌毒素污染情況調查報告顯示，全國約99%的飼料和原料不同程度受到霉菌毒素污染， 其中85%以上的飼料和原料被2 種或2 種以上的霉菌毒素污染（雷元培等，2020）。 分析其原因主要如下：（1）一種霉菌可能會產生多種毒素，例如黃曲霉菌會產生黃曲霉毒素、赭曲霉毒素和桔霉素，禾谷鐮孢菌會產生玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素等；（2）不同地區、不同環境、不同飼料受霉菌毒素污染的種類和嚴重程度不同， 當用來自不同地區和不同飼料原料來配制畜禽飼糧時， 導致多種霉菌毒素的污染不可避免。 在動物飼料中常見且危害較大的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、嘔吐毒素（DON）。這三種霉菌毒素能夠降低畜禽生產性能和機體免疫力， 對機體具有致癌性、基因毒性和生殖毒性，可嚴重危害機體健康 （黃珂等，2019；Meissommier 等，2006；Wang和Groopman，1999）。 據報道，多種霉菌毒素協同或累加作用對動物健康和生產性能的危害要比單一霉菌毒素作用的危害更大（Chang 等2020；李彥伸等，2020；Huang 等，2019）。 為了探索多種霉菌毒素的互作及累加細胞毒性， 本研究通過體外培養仔豬腸上皮細胞（IPEC-J2）試驗，探究AFB1、ZEA 和DON 不同配比對IPEC-J2 細胞活力的聯合損傷作用， 為后續研究多種霉菌毒素的同步降解奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 DON 購自上海源葉生物科技有限公司，ZEA 和AFB1購自Sigma 公司；DON 定量檢測試劑盒購自江蘇省蘇微微生物研究有限公司，AFB1和ZEA 定量檢測試劑盒購自德國RBiopHarm 公司；仔豬腸上皮細胞（IPEC-J2）由河南農業大學動物營養與飼料生物技術實驗室保存。

1.2 培養基的配制及細胞活力的測定（MTT 法）細胞培養基：10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液和89%高糖培養液充分混合均勻，4 ℃保存備用。取對數生長期細胞，常規消化計數后接種至96 孔板，100 μL/孔，每孔細胞數為1×104個，然后將細胞培養板置CO2培養箱培養24 h，吸棄掉原培養液，加入PBS 緩沖液清洗一遍，分別加入不同濃度的用細胞培養基稀釋的霉菌毒素， 對照組加入與試驗組相同體積的培養基， 每個處理組6 個重復。 24 h 后每孔加入10 μL 的MTT （終濃度為0.5 mg/mL），37 ℃、5% CO2培養箱中共同孵化4 h后，小心吸走培養液，加入150 μL 的DMSO，在低速振蕩器上振蕩10 min 使得甲瓚充分溶解，在酶標儀下測其490 nm 和630 nm 處的吸光度值（OD值），根據OD 值計算細胞活率公式為：細胞活力/%=（試驗組OD490nm值-試驗組OD630nm值）/（對照組OD490nm值-對照組OD630nm值）×100。

1.3 AFB1、ZEA、DON 對IPEC-J2 細胞毒性試驗的響應面設計 利用Design-Expert 8.0.6 軟件，將AFB1、ZEA 和DON 作為響應面Box-Behnke 設計的三個因素， 以AFB1：10、20、30 μg/L，ZEA：150、300、450 μg/L，DON：500、1000、1500 μg/L 分別作為Box-Behnke 設計三因素的三個編碼水平。 設計因素與編碼水平見表1。 將試驗結果輸入Design-Expert 軟件進行分析，得出回歸方程。根據線性回歸方程， 得出霉菌毒素導致細胞高損傷和低損傷的組合比例。 為了體現自變量和因變量的關系，采用二次多項方程進行擬合，預測二次多項方程式如下：Y=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β11X12+β22X22+β33X32+β12X1X2+β13X1X3+β23X2X3+β112X12X2+β113X12X3+β122X1X22；式中：Y 為細胞活力，%；X1、X2、X3為自變量， 分別對應AFB1、ZEA 和DON；β0為截距；β1、β2、β3為線性系數；β11、β22、β33為平方系數；β12、β13、β23、β112、β113、β122為交叉系數。

表1 Box-Behnke 設計因素及編碼水平 μg/L

1.4 統計分析 試驗數據經Excel 初步整理后，采用SPSS 25.0 軟件進行One way ANOVA 方差統計分析，利用Duncan’s 法進行多重比較。 所有結果均以“平均值±標準差”表示，以P < 0.05 表示差異顯著，P > 0.05 表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 不 同AFB1、ZEA 和DON 配 比 對IPEC-J2細胞活力的影響 由表2 可知， 試驗1 組細胞活力最高，為50.05%，與試驗6 組差異不顯著（P ＞0.05），顯著高于其余各組（P ＜0.05）；試驗17 組細胞活力最低，為39.02%，與試驗1、6 組差異顯著（P ＜0.05），與其余各組差異不顯著（P ＞0.05）。

表2 Box-Behnken 設計參數與細胞活力

2.2 響應面模型構建及方差分析 把17 組霉菌毒素組合對IPEC-J2 細胞活力作為響應值Y，利用Design-Expert 8.0.6 軟件對模型進行二次回歸分析， 可得出回歸方程：Y=39.67+0.83X1-0.11X2-1.31X3+2.28X1X2-0.83X1X3-0.13X2X3+2.72X12+1.78X22-0.85X32-0.50X12X2-0.99X12X3-3.81X1X22。對回歸方程進行方差分析，結果見表3，該回歸模型P ＜0.05，決定系數R2=0.97，表明該模型擬合度較好。從方程方差分析表P 值可得出各因素對 響 應 值 的 影 響 程 度，X1、X2、X3、X1X3、X2X3、X32、X12X2和X12X3對響應值的影響均不顯著 （P ＞0.05），X1X2和X22對 響 應 值 的 影 響 顯 著 （P ＜0.05），X12、X1X22的影響極顯著（P ＜0.01），說明AFB1和ZEA 及其交互作用對細胞活力有顯著影響（P ＜0.05）。經方程預測后，得到細胞活力最低（霉菌毒素毒性最高）的AFB1、ZEA 和DON 組合為30、150 μg/L 和1500 μg/L， 經測定細胞活力為32.32%；得到細胞活力最高（霉菌毒素毒性最低）的AFB1、ZEA 和DON 組合為10、150 μg/L 和600 μg/L，經測定細胞活力為53.01%。

表3 細胞活力作為響應值時回歸方程的方差分析

3 討論

動物腸道是抵抗霉菌毒素侵入的第一道防線，動物攝入被霉菌毒素污染的飼料后，會引起腸道上皮細胞受損，以及嚴重腸道炎性反應，降低營養物質的吸收和消化功能以及腸道免疫力， 增加傳染病的感染系數（潘佳雯等，2018）。在嚴重情況下，還可導致動物死亡，并通過食物鏈在人和動物體內積聚，從而危及人類和動物的健康。有研究表明，AFB1會損傷動物腸道正常的組織形態， 破壞腸道黏膜的物理屏障功能， 同時對腸道化學屏障和免疫屏障產生影響（齊燦燦等，2017）。 ZEA 是一種雌激素類似物， 其與雌激素受體結合會造成動物體內生殖激素紊亂， 破壞生殖系統、 免疫系統，還具有遺傳毒性和細胞毒性（Gao 等，2018）。DON 對細胞的毒性主要是改變細胞形態和分化。促進炎性因子的升高和細胞凋亡， 抑制蛋白合成來影響腸上皮細胞完整性 （Pinton 和Oswald，2014）。 多種霉菌毒素累加危害的研究表明，AFB1分別與ZEA 或赭曲霉毒素A（OTA）兩兩聯合或3種毒素的聯合均能影響奶山羊腸道微生物區系的結構，其中3 種毒素聯合毒性更強，對腸道微生物區系結構影響也越大 （范彩云等，2017）。 武晨清（2020） 用AFM1、OTA 和ZEA 處理Caco-2/HT29-MTX 細胞后，腸上皮細胞的通透性增強，緊密連接蛋白（TJ 蛋白）的形態改變，TJ 蛋白的結構被破壞；并證明AFM1與OTA、ZEA 共存時， 對腸道屏障功能的影響更為嚴重， 這與TJ 蛋白定位的改變和黏蛋白分泌的減少有關。 本研究結果表明，不同種類和不同劑量的霉菌毒素配伍，對IPEC-J2 細胞的損傷程度不同，得到了多種霉菌毒素導致豬腸道細胞高損傷和低損傷的組合模型，為研究多種霉菌毒素的累加細胞毒性及同步降解提供了依據。

4 結論

本研究利用響應面回歸設計， 得到了導致IPEC-J2 細 胞 高 損 傷 和 低 損 傷 的AFB1、ZEA 和ZON 配伍比例，為研究多種霉菌毒素的累加細胞毒性奠定了基礎。