水楊酸對葡萄果實酚類物質(zhì)積累的影響

衛(wèi) 穎，楊 波，李 敏，梁長梅，張鵬飛，溫鵬飛，牛鐵泉

（1.山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學信息科學與工程學院，山西太谷030801）

葡萄（Vitis viniferaL.）中含有豐富的糖、有機酸、及各種氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，而酚類物質(zhì)作為一種功能性物質(zhì)在葡萄的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[1]。前人證實，葡萄果實中存在多種酚類物質(zhì)（如黃酮醇、黃酮[2]、酚酸和黃烷-3- 醇[3]以及白藜蘆醇[4]等）與其采后運輸、儲存、保鮮、抗病性等密切相關(guān)[1]。黃烷-3- 醇是葡萄中重要的多酚類物質(zhì)之一[5-6]，廣泛存在干果實、果皮及種子中。葡萄果實中常見的黃烷-3- 醇單體有兒茶素（Catechin，C）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、表棓兒茶素（Epigallocatechin，EGC）和表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate）[7]。由于黃烷-3- 醇具有較強抗氧化性能[8]，在抗菌、抗病、抗癌、降血壓、防止心臟病變[9]等方面具有重要作用。

水楊酸（Salicylic acid，SA）是一種重要的植物激素[10]，也是一種調(diào)節(jié)植物生長、發(fā)育和應激反應的次生代謝產(chǎn)物[11]，能誘導防御化合物的生物合成，如多酚或抗病相關(guān)蛋白[12]。已有大量研究表明，SA可以提高植物的抗鹽性[13]、抗寒性以及抗熱性[14]等，且誘導效果因SA 的濃度、逆境類型及植物種類而異。KUMARI 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，荔枝果實經(jīng)SA 和殼聚糖的聯(lián)合處理后，減輕了荔枝果皮褐變，提高了抗氧化性和花青素含量。姚軍[16]等研究發(fā)現(xiàn)，采后哈密瓜噴施不同濃度SA，能抑制果實的腐爛，增強苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）活性。代紅軍等[17]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的SA 處理赤霞珠果實，均可提高果皮中總類黃酮和白藜蘆醇含量。龔良建等[18]證實了SA 能有效防止紅地球葡萄細胞膜的過氧化反應，增強保護性酶的相關(guān)活性，從而提高葡萄抗寒性。但遺憾的是，目前有關(guān)SA 在植物的抗逆性方面研究較多，但對果實中多酚類物質(zhì)積累的影響，特別是對黃烷-3- 醇的積累報道較少。

本研究采用常規(guī)生理生化方法和HPLC 方法，測定噴施外源SA 后極早蜜葡萄成熟果實中多酚類物質(zhì)含量，特別是黃烷-3- 醇，探究外源SA 對葡萄多酚類物質(zhì)以及黃烷-3- 醇積累的影響，為后續(xù)研究SA 對黃烷-3- 醇的調(diào)控機理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

供試材料為極早蜜葡萄（Vitis viniferaL.cv.Jizaomi）。水楊酸購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗地概況

試驗材料定植于山西農(nóng)業(yè)大學園藝站葡萄大棚，籬架，株行距1.0 m×2.5 m，肥水條件一般，正常管理。該園地處晉中盆地，東經(jīng)112°55′，北緯37°42′，年平均氣溫10.3 ℃，年平均降雨量458 mm。

1.3 試驗設(shè)計

共設(shè)4 個SA 處理，分別于幼果期（6 月17 日）、轉(zhuǎn)色期（7 月23 日）、成熟期（9 月14 日）噴施100 mg/L SA 或蒸餾水，具體如表1 所示。于成熟期噴前0 h、噴后3、6、12、24 h 進行采樣，采集果穗后去除畸形果、腐爛果，置于冰盒中帶回實驗室，經(jīng)液氮速凍后-50 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ總€處理設(shè)置3 次重復。

表1 SA 噴施處理

1.4 測定項目及方法

1.4.1 多酚類物質(zhì)含量測定 總酚、總類黃酮含量參照邢延富[19]的方法測定；總黃烷醇含量參照WATERHOUSE 等[20]的方法測定；總黃烷-3- 醇含量參照楊麗等[8]方法測定，稍作修改。

1.4.2 黃烷-3- 醇單體含量測定 參照溫鵬飛[7]的方法，稍作修改。準確稱取0.5 g 液氮研磨的葡萄果實去籽，加入3 mL 70%甲醇，搖勻后避光超聲提取20 min，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm 有機濾膜過濾后進樣分析。色譜條件：Themo Fisher Ultimate 3000 色譜儀，Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，280 μm），Dionex Ultimate 300 DiodeArrayDetector 檢測器，檢測波長為280 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。流動相A 為甲醇，流動相B 為1.3%冰乙酸，流速1.0 mL/min。洗脫程序：0～5 min，A 相為0～20%；5～10 min，A 相為20%～25%；10～25 min，A 相為25%～30%；25～30 min，A相為30%～20%；30～35 min，A 相為20%～0。4 種黃烷-3- 醇單體的分離色譜如圖1 所示。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2019 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并繪圖，利用SAS 8.0 軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸對極早蜜葡萄果實總酚含量的影響

從圖2 可以看出，在葡萄果實發(fā)育不同時期噴施SA，對成熟期葡萄果實總酚積累的影響不同。處理1 和處理3 的總酚含量在3 h 時達到最高，此時處理1 顯著高于處理2，處理3 極顯著高于處理2。而處理2 在12、24 h時總酚含量較高但低于對照，且在12 h 極顯著高于其他處理，在24 h時處理2與對照、其他處理無顯著性差異。

2.2 水楊酸對極早蜜葡萄果實總類黃酮含量的影響

不同水楊酸處理對極早蜜葡萄果實總類黃酮積累的影響如圖3 所示。處理3 的總類黃酮含量在0 h 時出現(xiàn)最高值，且顯著高于處理1；在3 h 時極顯著高于處理1 和處理2，但低于對照。除3 h 之外的其他時間，處理2 的總類黃酮含量均高于對照和其他處理，且在12 h 差異達到顯著水平，在24 h時極顯著高于處理1 和處理3。因此，在葡萄果實發(fā)育不同時期噴施不同次數(shù)的SA，對成熟期葡萄果實的總類黃酮積累的影響不同。

2.3 水楊酸對極早蜜葡萄果實總黃烷醇含量的影響

不同水楊酸處理對極早蜜葡萄果實總黃烷醇積累的影響如圖4 所示。處理3 在6 h 時總黃烷醇含量出現(xiàn)最高值，且極顯著高于處理1。處理2 在24 h之內(nèi)的總黃烷醇含量基本保持不變，且在6 h時極顯著高于處理1，在12、24 h時均極顯著高于其他處理。而處理1 在3 h 時總黃烷醇含量達到最高且顯著高于對照。在0 h 時3 個處理的總黃烷醇含量均顯著高于對照。因此，在葡萄果實發(fā)育不同時期噴施不同次數(shù)的SA，對成熟期葡萄果實總黃烷醇積累的作用不同。

2.4 水楊酸對極早蜜葡萄果實總黃烷-3-醇含量的影響

從圖5 可以看出，在葡萄果實發(fā)育不同時期噴施SA，對成熟期葡萄果實的總黃烷-3- 醇積累作用有所不同。處理3 的總黃烷-3- 醇含量在6 h 時出現(xiàn)最高值且顯著高于處理1，在3 h 時極顯著高于處理2 和對照。而處理2 的總黃烷-3- 醇含量在24 h時出現(xiàn)最高值且極顯著高于處理3，在12 h時極顯著高于對照和其他處理。處理1 在3 h 時總黃烷-3- 醇含量極顯著高于對照和其他處理。在0 h 時3 個處理的總黃烷-3- 醇含量均顯著高于對照。

2.5 水楊酸對極早蜜葡萄果實兒茶素含量的影響

從圖6 可以看出，不同水楊酸處理對極早蜜成熟葡萄果實兒茶素積累的影響有所不同。在0 h 時處理2 和處理3 的兒茶素含量顯著高于對照和處理1。而處理3 在3 h 時兒茶素含量出現(xiàn)最高值，均高于對照和其他處理且差異不顯著。處理2 在6 h時兒茶素含量均顯著高于對照和處理3。3 個處理在12、24 h時的兒茶素含量均低于對照。

2.6 水楊酸對極早蜜葡萄果實表兒茶素含量的影響

由圖7 可以看出，在葡萄果實發(fā)育不同時期噴施SA，對成熟期葡萄果實的表兒茶素積累作用有所不同。在0 h 時處理2 和處理3 的表兒茶素含量顯著高于對照和處理1。處理3 在3 h 時表兒茶素含量出現(xiàn)最高值，且極顯著高于對照和其他處理。而處理1 的表兒茶素含量在12 h 時出現(xiàn)最高值且顯著高于處理3，在6 h 時顯著高于其他處理。

2.7 水楊酸對極早蜜葡萄果實表棓兒茶素含量的影響

不同水楊酸處理對極早蜜葡萄果實表棓兒茶素積累的影響如圖8 所示。處理3 的表棓兒茶素含量在3 h 時出現(xiàn)最高值且極顯著高于對照，在0 h時顯著高于處理1 和對照。而處理2 在24 h之內(nèi)表棓兒茶素含量基本保持不變，在12、24 h時表棓兒茶素含量均極顯著高于對照和其他處理。除12 h以外的其余時間，處理1 的表棓兒茶素含量要高于對照但低于處理2 或處理3。因而，在葡萄果實發(fā)育不同時期噴施不同次數(shù)的SA，對成熟期葡萄果實表棓兒茶素積累的作用不同。

2.8 水楊酸對極早蜜葡萄果實表兒茶素沒食子酸酯含量的影響

由圖9 可以看出，在葡萄果實發(fā)育不同時期噴施SA，對成熟期葡萄果實的表兒茶素沒食子酸酯積累作用有所不同。在0 h 時3 個處理的表兒茶素沒食子酸酯含量均顯著高于對照。處理3 在6 h 時表兒茶素沒食子酸酯含量要顯著高于處理1 和對照，而在3 h 時差異不顯著。而處理2 的表兒茶素沒食子酸酯含量在24 h時出現(xiàn)最高值且極顯著高于其他處理，在6 h 時顯著高于處理1 和對照，在12 h 時差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

本試驗發(fā)現(xiàn)，極早蜜葡萄果實發(fā)育時期噴施不同次數(shù)的100 mg/L SA，在24 h內(nèi)對成熟期果實的酚類物質(zhì)積累會有不同程度的影響。噴施SA 后某個時間的成熟果實中總酚、總類黃酮、總黃烷醇、總黃烷-3- 醇含量高于對照，說明SA 可以促進葡萄多酚類物質(zhì)積累，這與前人結(jié)果[17，21]一致。不同的是，3 個處理之間比較發(fā)現(xiàn)，幼果期、轉(zhuǎn)色期和成熟期3 次噴施SA 后，其成熟果實在0～6 h 酚類物質(zhì)的積累有明顯提高；而幼果期、轉(zhuǎn)色期2 次噴施SA后，在6～24 h 葡萄成熟果實酚類物質(zhì)的積累作用較為明顯；幼果期噴施SA 對酚類物質(zhì)積累的影響不明顯。

葡萄果實中黃烷-3- 醇類物質(zhì)的積累主要是在葡萄進入轉(zhuǎn)色期前，尤其是在葡萄果實發(fā)育的早期階段，而后伴隨著葡萄果實的成熟，其呈現(xiàn)下降趨勢[22-23]。本試驗在葡萄成熟期果實中檢測到了兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯4 種黃烷-3- 醇單體，這4 種單體在成熟期葡萄中含量較少，這與前人研究結(jié)果一致，其中表棓兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯含量較高，兒茶素、表兒茶素含量較少。

牛艷麗[24]研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施SA 不會改變葡萄果實黃烷醇類多酚的積累規(guī)律，但可不同程度誘導黃烷醇類多酚的積累，其結(jié)果與本試驗相符。對于兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素而言，幼果期、轉(zhuǎn)色期和成熟期3 次噴施SA 后3 h 的含量最高；而幼果期、轉(zhuǎn)色期2 次噴施SA 后24 h 的表兒茶沒食子酸酯含量最高。其含量升高的原因可能是SA 激活了葡萄酚類物質(zhì)相關(guān)代謝酶活性，從而提高了葡萄中兒茶素、表棓兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯含量。前人已經(jīng)證實，花青素還原酶（Anthocyanidin reductase，ANR）和無色花青素還原酶（Leucoanthocyanidin reductase，LAR）參與黃烷-3-醇的合成，LAR 催化無色花青素轉(zhuǎn)化為兒茶素，而ANR 催化花青素合成表兒茶素[25]。因此，SA 可能是通過激活ANR、LAR 酶活性，從而提高了葡萄中黃烷-3- 醇含量[26]。

從整體上看，與對照相比，噴施水楊酸后24 h內(nèi)成熟果實的酚類物質(zhì)含量無明顯提高。其結(jié)果可能因為受到葡萄品種、SA 濃度、果實取樣部位等的影響。目前，前人在釀酒葡萄品種如赤霞珠、梅鹿輒、蛇龍珠上的研究較多，而對鮮食葡萄品種的研究較少。前人研究發(fā)現(xiàn)，SA 對赤霞珠、梅鹿輒、蛇龍珠果實的酚類物質(zhì)積累的最佳質(zhì)量濃度分別是100、50、100 mg/L[27-28]。趙旗峰等[29]研究發(fā)現(xiàn)，不同品種、不同營養(yǎng)系間葡萄果實的多酚類物質(zhì)含量存在顯著差異。由此表明，SA 對酚類物質(zhì)的積累會受到葡萄品種的影響。而葡萄果實取樣部位的不同，也會導致SA 對酚類物質(zhì)的影響不同。例如，蛇龍珠葡萄的果皮、果籽中白藜蘆醇含量分別以50、25 mg/L SA 處理的效果最好[30]，且果皮和果籽中酚類物質(zhì)含量要遠高于果肉。不同濃度的SA 對酚類物質(zhì)的影響也不同，其中，赤霞珠果皮的總類黃酮含量以50 mg/LSA 處理效果最好，白藜蘆醇含量以25 mg/L SA 處理效果最好[17]。另外，酚類物質(zhì)也會因SA 處理時期的不同而產(chǎn)生影響。目前，大多數(shù)報道均是在果實采前、采后施用SA[31]，而在果實生長期進行處理的報道較少。因而，本試驗在極早蜜葡萄的生長發(fā)育時期噴施100 mg/L SA，具有一定的研究意義。