吳門調(diào)脂顆粒方對非酒精性脂肪肝大鼠肝組織NF-κBp65/P38MAPK蛋白表達(dá)的影響

梁國強，葛惠男，章一凡，歐陽八四，郭金偉，孫 柳，杰 輝，龔 誠，沈賢敏，朱 慧，沈為濂，朱惠萍*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州；2.江蘇省名老中醫(yī)藥專家葛惠男傳承工作室；3.蘇州市吳門醫(yī)派研究院，江蘇 蘇州 215009)

非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是目前全人類的一大頑疾，通常指除酒精原因以外，具有其他明確的損肝因素所致的脂肪過度沉積于肝細(xì)胞內(nèi)為主要特征的臨床病理綜合征。其易脂肪性病變轉(zhuǎn)歸為非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化以及肝癌的風(fēng)險非常大。普通和代謝綜合征的人群患病率分別高達(dá)6.0%和25.0%[1]。現(xiàn)代中醫(yī)根據(jù)其臨床癥狀認(rèn)為NAFLD、NASH屬于傳統(tǒng)中醫(yī)疾病脅痛、積聚、鼓脹等范疇[2]。當(dāng)前證實廣泛存在于全身多種細(xì)胞之中的轉(zhuǎn)錄核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和Kupffer細(xì)胞免疫相關(guān)信號通路絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)，與NAFLD和NASH發(fā)生發(fā)展中的炎癥、肝纖維化、肝功能衰竭等均存在密切的關(guān)系且發(fā)揮著重要作用[3]。本研究采用吳門醫(yī)派已故中醫(yī)消化內(nèi)科傳人全國名老中醫(yī)汪達(dá)成治療高脂血癥創(chuàng)制的驗方“吳門調(diào)脂顆粒”方，觀察其干預(yù)高脂飲食誘導(dǎo)的經(jīng)典NAFLD大鼠的效應(yīng)，并探討對肝組織中NF-κBp65和P38MAPK蛋白調(diào)控的初步機制，為該方對NAFLD防治作用的深入研究積累更多的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購自蘇州昭衍新藥研究中心有限公司，許可證號：SCXK(蘇)2017-0043。飼養(yǎng)條件：室溫(24±2)℃，明暗各半，自由攝食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d用于實驗。

1.2 實驗藥物

吳門調(diào)脂顆粒方：水提取物制成的棕黃色浸膏，1g浸膏相當(dāng)于含量為3.0 g生藥，由蘇州市吳門醫(yī)派研究院中心實驗室提供(批號：20191003)；多烯磷脂酰膽堿膠囊(易善復(fù))，賽諾菲(北京)制藥有限公司產(chǎn)品(批號：F733845)；戊巴比妥鈉(Sigma公司生產(chǎn)，批號：20120304)。

1.3 實驗試劑

單試劑GPO-PAP法TG、TC測定試劑盒；雙試劑直接法HDL-C、LDL-C測定試劑盒；紫外比色法ALT、AST測定試劑盒，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；ELISA法GSH、IL-1β、TTNF-α、IL-6測定試劑盒，上海邦奕生物公司產(chǎn)品；蘇木素、伊紅染色試劑盒，為鴻泉生物科技有限公司產(chǎn)品；NF-κBp65(ab16502，1∶200)、P38MAPK抗體(ab32142，1∶250)，abcam公司產(chǎn)品；廣譜二抗，上海長島生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為市售分析純。

1.4 實驗儀器

Infinite F50酶標(biāo)儀(瑞士Tecan 公司)；全自動生化分析儀(美國杜邦公司)；HI1210水浴鍋(Leica公司)；D5100數(shù)碼相機(NIKON公司)；CX41正置顯微鏡(OLYMPUS公司)；恒溫烘箱(恒一科學(xué)儀器有限公司)；石蠟切片機、攤片機(徠克公司)。

1.5 造模與分組

取53只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分成空白組(n=10)，普通飼料喂養(yǎng)，余43只進(jìn)行造模，參考文獻(xiàn)[4]予以高脂飼料(88%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+2%膽固醇)喂養(yǎng)，于第8周末隨機選取3只大鼠處死，驗證造模成功后改普通飼料喂養(yǎng)，并根據(jù)體質(zhì)量隨機分為：模型組，西藥組(多烯磷脂酰膽堿：80 mg/kg)[5]，中藥低、高劑量組(調(diào)脂顆粒方：相當(dāng)于4 g生藥/kg、8 g生藥/kg，根據(jù)人45 g生藥/d與大鼠體表面換算等效劑量為低劑量，高劑量放大1倍)[6]4組(n=10)，空白組及模型組同步予以同體積生理鹽水，各組以10 mL/kg灌胃給予4W。

1.6 標(biāo)本制作

各組對應(yīng)藥物干預(yù)4周后，末次干預(yù)給藥1 h后(禁食16 h)，以戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，腹主動脈采血后分離血清(3 000 r/min，10 min)，-80 ℃冰箱凍存待測相關(guān)指標(biāo)。行安樂處死后，每組隨機取5個樣本，解剖腹腔，取肝臟組織統(tǒng)一留取右葉，距邊緣5 mm，大小約0.5 mm3，多聚甲醛固定，待病理切片觀察及免疫組化檢測相關(guān)指標(biāo)，殘余肝臟組織儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.7 檢測指標(biāo)及方法

1.7.1 血脂相關(guān)指標(biāo)檢測 分別采用單試劑GPO-PAP法和雙試劑直接法檢測血清TG、TC和HDL-C、LDL-C。

1.7.2 肝酶譜相關(guān)指標(biāo)檢測 分別采用紫外比色法和ELISA法檢測血清ALT、AST和GSH。

1.7.3 血清炎性相關(guān)指標(biāo)檢測 采用ELISA法檢測血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平。

1.7.4 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取各組經(jīng)甲醛固定的肝組織，采用蘇木素、伊紅染色試劑盒進(jìn)行染色觀察，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)及脂滴分布狀況等。

1.7.5 肝臟NF-κBp65、P38MAPK蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化法(IHC)檢測肝組織NF-κBp65、P38MAPK蛋白的表達(dá)，包埋各組大鼠肝組織后切片脫蠟制片。PBS漂洗，再于3%甲醇-H2O2、檸檬酸緩沖液及加熱來進(jìn)行抗原修復(fù)。抗原修復(fù)后冷卻，以血清封閉，室溫37 ℃、30 min。按要求加入稀釋的一抗置于4 ℃冷庫搖床過夜，一抗解育后漂洗，并加入二抗室溫37 ℃孵育30 min后加入顯色劑，顯色并清洗后浸泡于蘇木精中2 min，進(jìn)行復(fù)染。復(fù)染后按常規(guī)脫水方法脫水。脫水后用中性樹膠封片晾干。完成的免疫組化片于顯微鏡下觀察、拍攝。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)運用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所得數(shù)據(jù)表示為均值加減標(biāo)準(zhǔn)差，多組間比較采用ANOVA分析，兩兩比較采用t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血脂相關(guān)指標(biāo)比較

見表1，與空白組比較，模型組TG有所上升但無統(tǒng)計學(xué)差異，TC和LDL-C顯著性上升(P<0.001)，HDL-C明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，給藥各組TG明顯下降(P<0.05)、HDL-C升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，西藥組和中藥高劑量組TC、LDL-C顯著性下降(P<0.01或P<0.001)，中藥低劑量組TC、LDL-C明顯下降(P<0.05)。

表1 各組大鼠血清TG、TC和HDL-C、LDL-C水平比較

2.2 各組肝酶譜相關(guān)指標(biāo)比較

見表2，與空白組比較，模型組AST明顯升高(P<0.05)、ALT顯著性升高(P<0.01)、GSH顯著性下降(P<0.001)；與模型組比較，給藥各組AST明顯下降(P<0.05)，西藥組和中藥低劑量組ALT明顯下降(P<0.05)，中藥高劑量組ALT顯著性下降(P<0.01)，西藥組GSH顯著性升高(P<0.001)，中藥高劑量組GSH明顯升高(P<0.05)，中藥低劑量組GSH升高差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 各組大鼠血清AST、ALT和GSH活性比較

2.3 各組血清炎性相關(guān)指標(biāo)比較

見表3，與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α、IL-6水平均顯著性升高(P均<0.001)；與模型組比較，西藥組和中藥高劑量組給藥IL-1β顯著性下降(P<0.001或P<0.01)，中藥低劑量組IL-1β明顯下降(P<0.05)，西藥組TNF-α明顯下降(P<0.05)，中藥低、高劑量組TNF-α下降但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；西藥組IL-6顯著性下降(P<0.01)，中藥高劑量組IL-6明顯下降(P<0.05)，中藥低劑量組IL-6下降但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平比較

2.4 各組肝組織病理形態(tài)學(xué)比較

切片顯示：空白組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)未見明顯病變，肝小葉、肝竇結(jié)構(gòu)清晰，多邊形的肝細(xì)胞排列致密整齊，中央見圓形的細(xì)胞核且胞質(zhì)內(nèi)無空泡；與空白組比較，模型組大鼠肝組織可見肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞膨脹性氣球樣變，大泡性、小泡性脂滴同時存在于胞質(zhì)內(nèi)，胞核被擠壓至細(xì)胞邊緣，可見散在壞死的肝細(xì)胞、小葉內(nèi)炎癥浸潤等明顯的病理性改變。與模型組比較，西藥組和中藥低、高劑量組肝組織脂肪變性及炎癥浸潤情況有不同程度的改善；中藥高劑量總體改善略有優(yōu)于低劑量組，脂肪變性改善與西藥組相當(dāng)，但炎癥浸潤改善不及西藥組。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)比較(HE×200)

2.5 各組肝組織NF-κBp65、P38MAPK蛋白表達(dá)比較

見圖2、表4。每組隨機取5個樣本進(jìn)行相關(guān)蛋白的IHC進(jìn)行分析，與空白組比較，模型組大鼠肝組織NF-κBp65顯著性上調(diào)(P<0.001)、P38MAPK明顯上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，西藥組和中藥高劑量組NF-κBp65明顯下調(diào)(P<0.05)，西藥組P38MAPK顯著性下調(diào)(P<0.01)，中藥高劑量組P38MAPK下調(diào)但無統(tǒng)計學(xué)差異，中藥低劑量組NF-κBp65下調(diào)、P38MAPK上調(diào)但均無統(tǒng)計學(xué)差異。中藥兩組NF-κBp65、P38MAPK蛋白表達(dá)仍然顯著性高于空白組。

圖2 各組大鼠肝組織NF-κBp65、P38MAPK蛋白表達(dá)比較(IHC×200)

表4 各組大鼠肝組織NF-κBp65、P38MAPK蛋白表達(dá)比較

3 討論

隨著人們生活水平的提高及生活方式的改變，目前我國NAFLD的發(fā)病率已接近20.0%，且呈日益升高趨勢。其發(fā)病機理目前比較認(rèn)同的為“二次打擊學(xué)說”，即第一次為高胰島素血癥及胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)導(dǎo)致的單純肝細(xì)胞脂肪變性，第二次為氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化、炎性細(xì)胞因子的釋放、線粒體功能障礙而導(dǎo)致的肝細(xì)胞炎性反應(yīng)、滑絲及纖維化，甚至導(dǎo)致肝硬化[7]。雖然隨著醫(yī)患防控意識的不斷提高，提倡飲食上少吃高脂高糖、提高有氧運動以及戒煙、戒酒和保持良好生活作息習(xí)慣等，但是由于現(xiàn)代社會生活節(jié)奏快、工作壓力等因素，關(guān)鍵的問題是“持之以恒”很難做到。西醫(yī)治療主要從胰島素增敏劑、抗氧化劑、改善脂代謝、肝細(xì)胞保護(hù)劑等幾個方面，雖然效果“立竿見影”，但也伴隨著損傷肝細(xì)胞以及反復(fù)發(fā)作的風(fēng)險，而且大多數(shù)藥物價格昂貴，目前尚未出現(xiàn)特效藥[8]。隨著中醫(yī)藥的深入研究和發(fā)展，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥治療 NAFLD 具有一定的療效和優(yōu)勢，臨床準(zhǔn)確辨證施藥是關(guān)鍵，體現(xiàn)出副作用少、療效穩(wěn)定，尤其適用于慢性患者長期服用[9，10]。

吳門調(diào)脂顆粒方的創(chuàng)制依據(jù)吳門醫(yī)派倡導(dǎo)的絡(luò)病學(xué)術(shù)思想“經(jīng)年宿疾，病必在絡(luò)”的中醫(yī)理論，組方為：蒲黃、姜黃、澤瀉和萊菔子。NAFLD雖發(fā)病于微，但病變時間長，其主要病理基礎(chǔ)以痰、瘀痹阻脈絡(luò)為主。其中蒲黃甘、平，歸肝、心包經(jīng)，具有活血化瘀通絡(luò)為君藥；姜黃辛、苦、溫，歸肝、脾經(jīng)，行氣活血、痛經(jīng)止痛，澤瀉甘、淡、寒，歸腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕瀉熱，通腎之開合，兩者為臣藥；再佐以辛、甘、平，歸脾、胃、肺經(jīng)的萊菔子，發(fā)揮其消食除脹、降氣化痰的作用。四藥共同體現(xiàn)化痰祛瘀通絡(luò)的療效，在多年的臨床治療NAFLD等疾病的實踐中每獲良效[11-15]。在前期的實驗研究中初步亦表明了吳門調(diào)脂顆粒方具有對NAFLD小鼠加速對脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運和代謝，抑制慢性炎癥、調(diào)控細(xì)胞過度自噬等，保護(hù)肝臟的作用[16-19]。

基于以上基礎(chǔ)，本研究中以經(jīng)典NAFLD大鼠模型為工具，經(jīng)吳門調(diào)脂顆粒方干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，血脂相關(guān)指標(biāo)、肝酶譜相關(guān)指標(biāo)和血清炎癥因子相關(guān)指標(biāo)以及病理形態(tài)學(xué)分析結(jié)果表明：吳門調(diào)脂顆粒方高劑量干預(yù)可明顯改善NAFLD大鼠的指征和病理特征，這些結(jié)果都與吳門調(diào)脂顆粒方臨床療效和前期實驗基礎(chǔ)類同。MAPKs是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié)，并與炎癥、腫瘤及其他多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而p38MAPK是MAPKs家族控制炎癥反應(yīng)主要成員，其參與NF-κB、TNF-α等眾多炎癥因子的調(diào)控，并與這些炎癥因子形成正反饋調(diào)節(jié)作用[20-21]。本次實驗結(jié)果顯示：吳門調(diào)脂顆粒方高劑量具有下調(diào)和上調(diào)脂肪肝組織P38MAPK和NF-κBp65蛋白表達(dá)作用。

綜上所述，本實驗通過高脂飼料誘導(dǎo)的方法成功制備NAFLD大鼠模型，且病變肝組織中NF-κBp65和p38MAPK蛋白表達(dá)較正常組顯著上調(diào)表達(dá)，在吳門調(diào)脂顆粒方的干預(yù)下，血脂、肝酶譜和炎癥相關(guān)指標(biāo)得到調(diào)控性改善，病理學(xué)改變減輕，顯著降低了NF-κBp65蛋白的表達(dá)，但對p38MAPK蛋白過表達(dá)影響相對較弱。提示吳門調(diào)脂顆粒方通過化痰祛瘀通絡(luò)功用抑制NAFLD引起的肝臟脂質(zhì)沉積，推斷其主要與調(diào)控肝組織中NF-κBp65過表達(dá)存在一定關(guān)系。在進(jìn)一步研究中，應(yīng)該借鑒代謝組學(xué)、生物信息學(xué)分析以及構(gòu)建目標(biāo)蛋白病毒等現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對吳門調(diào)脂顆粒方干預(yù)炎癥因子、氧化應(yīng)激因子所介導(dǎo)的NF-κB/MAPK通路的整體效應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)性研究，多維多息地表征中醫(yī)藥治療NAFLD的療效機制。