小麥多蛋白橋梁因子基因 TaMBF1c的克隆與表達分析

曹志琛，吳 嫻，汪德州，柳 珊，楊慧玉，郝小聰，房兆峰，朱文根，王偉偉，王小燕，唐益苗

(1.長江大學農學院，湖北荊州 434025；2.北京市農林科學院雜交小麥工程技術研究中心，北京 100097)

多蛋白橋梁因子1(multiprotein bridging factor 1，MBF1)廣泛存在于植物中，通過橋連轉錄激活因子(如FT2-F1和GCN4)和TATA-box結合蛋白(TBP)介導轉錄激活[1-9]，增強植物在逆境脅迫中的抗性[10-14]。在真核生物(酵母、果蠅、小鼠、人等)中，MBF1僅由單個基因編碼，而在植物中，MBF1由多個基因碥碼。擬南芥基因組包含三個MBF1基因MBF1a、MBF1b和MBF1c，根據其進化關系，MBF1a和MBF1b歸為一類，MBF1c則歸為另一類[7,10]。MBF1蛋白主要由N端‘MBF1’結構域和C端‘helix-turn-helix’結構域組成[4]。Ozaki等[15]研究發現，MBF1轉錄因子互作的核心區域位于N端，N端沒有保守的高級結構，BmMBF1蛋白N端的不同構象使其與不同伴侶的作用能力有所差異。在植物中尚未見N末端結構域報道。體外試驗表明，擬南芥MBF1可通過連接酵母中的GCN4轉錄激活因子和TBP來介導轉錄激活，這表明N末端結構域在真菌和植物之間具有類似的功能[7]。C末端‘helix-turn-helix’結構域是TBP結合結構域，該結構域在所有物種中高度保守[3, 16]。

MBF1在植物生長發育調控和逆境響應過程中發揮重要的調控功能。在擬南芥中，MBF1c在葉和根中表達量較高，在培養14、21和28 d后，各組織中均檢測到pMBF1c::GUS的活性[10]。擬南芥[10,17]、水稻[12]、苔蘚[18]、酵母[12]和紅藻[14]MBF1c在受熱脅迫誘導后均上調表達。MBF1c通過調節水楊酸、海藻糖和乙烯相關蛋白[17]，與TBP互作，激活未知的轉錄因子調節HSP等熱響應基因(HR基因)的表達，從而增強耐熱性[12,19]。Qin等[20]研究發現，擬南芥中過表達葡萄VvMBF1導致氣孔關閉，增強了轉基因擬南芥的抗旱性，在脫落酸(ABA)依賴的干旱響應途徑中發揮作用的干旱響應相關基因顯著上調表達。

小麥作為世界主要糧食作物，干旱和熱脅迫是制約小麥高產穩產的主要逆境因子，探討干旱和熱脅迫響應的分子機制對于開展小麥抗逆分子育種具有重要意義[21-22]。據報道，小麥7B染色體上的MBF1c受熱脅迫誘導表達[12]，但其亞基因組成員功能未知。因此，本研究以中國春小麥品種的轉錄組數據作為參考序列，克隆了小麥TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因，并系統分析其對干旱和熱脅迫的響應，以期為探討TaMBF1c在小麥非生物脅迫響應過程中的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和處理方法

供試材料為苗期旱熱敏感小麥品種小白麥、耐旱小麥品種太原806和耐熱小麥品種京麥8號，均由北京雜交小麥工程技術研究中心分子育種實驗室提供。

選取成熟飽滿大小均勻一致的小白麥、太原806和京麥8號種子，用75%的酒精消毒1 min，無菌水沖洗3次，隨后用5% NaClO消毒10 min，無菌水沖洗4～5次，于滅菌水中浸泡24 h后將種子移種到水培盒中，每1 d更換一次水培液。將水培盒放入光溫培養箱中，培養溫度設置為24 ℃/18 ℃(光照14 h/黑暗10 h)。待小白麥、太原806和京麥8號幼苗長至兩葉一心期時，分成兩組，第一組進行干旱脅迫處理，將小白麥和太原806幼苗置于無水培液的空水培盒中培養，其余培養條件與處理前相同，分別在0、1、2、6、12和24 h后取整株幼苗；第二組進行熱脅迫處理，將小白麥和京麥8號幼苗置于40 ℃條件下，其余培養條件與處理前也相同，分別在熱脅迫0、0.25、0.5、1、2和4 h后取整株幼苗[23]。處理均設3個重復，液氮速凍后，-80 ℃保存備用，用于提取RNA。

利用75%酒精和15%NaClO對小麥種子進行消毒，并于2019年10月5日播種于北京市農林科學院試驗田中，經春化作用(溫度在4 ℃以下，40 d 以上)后移入人工可控溫室，模擬大田自然環境培養至孕穗期，分別取小麥根、莖、葉和穎殼等組織，并在灌漿14 d后取其種子，并迅速置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

采用Trizol法提取小麥不同組織器官及幼苗總RNA[23]，測定OD260/280值，同時利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質量，置于-80 ℃超低溫冰箱備用。用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)合成cDNA第一鏈，-20 ℃保存備用。

1.3 小麥 MBF1c基因的克隆

根據小麥已發表的與耐熱性相關的多蛋白橋梁因子基因MBF1c(TraesCS7B02G259000)，用Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)網站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)進行基因序列同源性檢索，選取相似度達97.35%的序列TraesCS7A02G 369500.1和96.75%的序列TraesCS7D02G 353800.1，設計引物TaMBF1c-A-F/R、TaMBF1c-B-F/R、TaMBF1c-D-F/R(表1)。

以小白麥、太原806和京麥8號幼苗的cDNA作為模板進行TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D的PCR擴增。擴增體系為20 μL，包括2×Easy Taq PCR SuperMix(北京全式金生物技術有限公司)10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，模板cDNA(100 ng·L-1)1 μL，ddH2O 7 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性35 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸為50 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，在室溫條件下(25 ℃)連接pEASY-T1 Zero載體(北京全式金生物技術有限公司)上，反應時間為5～10 min。轉化大腸桿菌感受態細胞TOP10，然后將菌液均勻涂抹到含有卡那霉素(濃度100 ng·L-1)的LB固體培養基上，37 ℃倒置培養13～16 h后，經菌落PCR鑒定后，每個樣品選取3個單克隆送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

1.4 TaMBF1c蛋白的生物信息學分析

用Pfam(http://pfam.xfam.org)預測TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D的蛋白結構，用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取關于基因的cDNA序列和染色體位置的信息。

用Protein Sequence Vs Profile-HMM Database(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)在線程序對TaMBF1c同源蛋白序列保守結構域進行驗證，保留具有MBF1結構域的蛋白序列。用MEGA 7.0的ClustalW程序對普通小麥(T.aestivum)、烏拉爾圖小麥(T.urartu)、大麥(Hordeumvulgare)、粗山羊(Aegilopstauschii)、二粒小麥(T.dicoccum)、水稻(Oryzasativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、番茄(Solanumlycopersicum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)9個物種的全長氨基酸序列進行多序列比對，用鄰接法(Neighbor-joining method)構建系統進化樹，用泊松校正模型，bootstrap值設置為1 000。用DNAMAN V6進行可視化。

1.5 TaMBF1c基因的表達分析

表1 引物名稱及序列

2 結果與分析

2.1 TaMBF1c基因克隆及其編碼蛋白結構分析

以小白麥、太原806和京麥8號幼苗的cDNA為模板，利用引物TaMBF1c-A-F/R、TaMBF1c-B-F/R和TaMBF1c-D-F/R(表1)分別進行PCR擴增，結果發現，三個品種擴增出來的條帶大小完全一致，從圖1可以看出，擴增產物條帶大小為500～600 bp左右。將目的片段純化、克隆并測序后，經Blast比對分析，發現與已經報道的TaMBF1c(TraesCS7B02G259000)的相似率高達95%以上，根據染色體位置將其暫時命名為TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D。通過比較基因組區域(http://plants.ensembl.org/index.html)和全長cDNA序列確定TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因的結構，其中，TaMBF1c-A轉錄物的長度為660 bp，含有579 bp的編碼序列和81 bp的3′非翻譯區(UTR)；TaMBF1c-B轉錄物的長度為631 bp，含有471 bp的編碼序列、76 bp的5′UTR和 84 bp的3′UTR；TaMBF1c-D轉錄物的長度為492 bp，含有465 bp的編碼序列、15 bp的5′UTR和12 bp的3′UTR。預測TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D蛋白長度分別為151、156和154個氨基酸，并通過多序列比對和蛋白保守結構域預測表明，其C端都具有MBF1結構域，且N端都具有helix-turn-helix結構域(圖2)，說明TaMBF1基因屬于MBF1基因家族。

A：TaMBF1c-A擴增產物；B：TaMBF1c-B擴增產物；D：TaMBF1c-D擴增產物；M：DL2000。

A：TaMBF1c同源蛋白多序列比對圖。藍色底紋的氨基酸表示序列完全匹配，青色底紋的氨基酸表示序列匹配有差異，黑色線條表示MBF1結構域，紅色線條表示helix-turn-helix結構域，紅色方框表示helix-turn-helix結構域中4個α螺旋的位置，黃色方框表示第112位氨基酸；B：TaMBF1c同源蛋白三維結構模型。藍色為第一個螺旋，青色為第二個螺旋，橙色為第三個螺旋，紅色為最后一個螺旋，灰線為無規卷曲結構；C：TaMBF1c同源蛋白三維結構擬合模型圖。藍色方塊表示其結構不同；D：TaMBF1c同源蛋白三維結構擬合模型局部圖。

利用在線軟件Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk)預測TaMBF1c蛋白的三級結構，并通過Swiss-PdbViewer軟件進行可視化分析，結果(圖3A)發現，TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D蛋白的三級結構相似，均具有四個互相親和的α螺旋和一段可與轉錄因子結合的無規卷曲結構。對TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D蛋白結構擬合(圖3B-D)發現，結構差異主要表現為C端的無規卷曲，其長度差異表現為TaMBF1c-D>TaMBF1c-A>TaMBF1c-B，結果說明，TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D蛋白可能與轉錄因子的結合能力不同。

2.2 TaMBF1c同源蛋白序列的比對與分析

從圖3可以看出，單子葉和雙子葉植物的MBF1c蛋白分別聚為一類，TaMBF1c-A(TraesCS7A02G369500.1)蛋白序列與二粒小麥(TRIDC7AG051580.2)的親緣關系最近；TaMBF1c-B(TraesCS7B02G259000.1)蛋白序列與二粒小麥(TRIDC7BG0442320.1)的親緣關系最近；TaMBF1c-D(TraesCS7D02G353800.1)蛋白序列與粗山羊草(AET7Gv20881700.1)的親緣關系最近。

At：擬南芥；Os：水稻；Ae：粗山羊草；Ta：小麥；Td：二粒小麥；Tu：烏拉爾圖小麥；Hv：大麥；St：馬鈴薯；Sl：番茄。

2.3 TaMBF1c基因的順式作用元件分析

通過Ensembl Plants網站搜索TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因上游2 000 bp序列，利用DNAMAN V6進行多序列比對，結果發現，TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D都具有干旱響應元件和熱響應元件。

在TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因序列中均只含有1個干旱響應元件(MBS element/MYB element)，但位置和序列組成不同，其中，TaMBF1c-A啟動子區5′端119～124 bp處有干旱響應元件MYB element，序列為CAACAG；TaMBF1c-B和TaMBF1c-D分別在啟動子區3′端1 769～1 774 bp和1 768～ 1 775 bp處有干旱響應元件MBS element，序列均為CAACTG。熱響應元件HSE element(nGAAn/nTTCn)在TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D中的數目、位置和序列組成各不相同，其中，TaMBF1c-A啟動子區5′端有3個熱響應元件，位置分別為1 631～1642 bp、1 775～ 1 790 bp和1 812～1 823 bp，序列分別為 CAGAATTTGAAT、AGAATCTTCCAGAAC和CATGAACCTTCC；TaMBF1c-B啟動子區有4個熱響應元件，位置分別為1 588～1 596 bp、1 643～1 654 bp、1 786～1 800 bp和1 821～ 1 832 bp，序列分別為CGAATTCCA、CAGAATTTGAAT、AGAACCTTCCAGACC和CAGGAACCTTCC；TaMBF1c-D啟動子區5′端有4個熱響應元件，位置分別為1 582～1590 bp、1 642～1 653 bp、1 785～1799 bp和1 820～1831 bp，序列分別為CGAATTCCA、CAGAATTTGAAT、AGAACCTTCCAGACC和CAGGAA-CCTTCC。推測這些啟動子元件的差異可能會導致3個TaMBF1c基因在受到干旱和熱脅迫后的表達量不同。

2.4 TaMBF1c基因的組織特異性表達分析

利用Wheat Exp(https://wheat.pw.usda.gov)網站對不同組織中TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因的表達量進行分析，結果(圖4)發現，TaMBF1c-A和TaMBF1c-B均在葉片中的表達量較高，籽粒次之，而在根、莖和穎殼中的表達量較低。通過熒光定量PCR進一步驗證基因的組織表達特異性，結果發現TaMBF1c-A和TaMBF1c-B基因在根、葉片和籽粒中均有表達，TaMBF1c-A主要在葉片中表達，而TaMBF1c-D僅在根部中特異性表達。

圖4 小麥 TaMBF1c基因在不同器官中的相對表達量

2.5 TaMBF1c基因在干旱脅迫下的表達分析

以小白麥和太原806為試驗材料，待培養至一葉一心期時，進行干旱處理。干旱脅迫24 h后，小白麥幼苗葉片萎蔫，莖稈倒伏，而太原806葉片雖出現萎蔫，但植株大部分直立(圖5A)，表明苗期太原806比小白麥表現出更強的耐 旱性。

為分析TaMBF1c基因在干旱脅迫條件下的表達模式，對小白麥和太原806進行干旱處理，RT-qPCR結果(圖5B)表明，干旱脅迫下，小白麥中的TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因均上調表達，且均在6 h時表達量急劇升高，達到峰值，隨后表達量急劇下降。而太原806中TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因的表達量變化不明顯，遠遠低于小白麥。這些結果說明，抑制TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D的表達可提高小麥的抗旱性。

A：小白麥和太原806干旱脅迫24 h的生長情況；B：小白麥和太原806中TaMBF1c基因在干旱脅迫后的表達情況。

2.6 TaMBF1c基因在熱脅迫下的表達分析

以小白麥和京麥8為試驗材料，待培養至一葉一心期時，進行熱脅迫處理。從圖6A可以看出，熱脅迫24 h后，小白麥幼苗大部分葉片萎蔫，莖稈失水、倒伏，而京麥8號幼苗葉片僅出現輕度萎蔫。結果表明，京麥8號比小白麥表現出更強的耐熱性。

為了分析TaMBF1c基因在熱脅迫條件下的表達模式，對小白麥和京麥8進行熱處理，RT-qPCR分析結果(圖6B)表明，小白麥和京麥8中的TaMBF1c-A基因在受熱脅迫后均上調表達，在0.5 h達到峰值；小白麥和京麥8中的TaMBF1c-B基因受熱脅迫后均上調表達，但在京麥8中的表達量明顯高于小白麥，在4 h達到最大值；小白麥中的TaMBF1c-D基因受熱脅迫后上調表達，但在京麥8中的表達量變化不明顯，且比小白麥表達量低。這些結果表明，TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D在熱脅迫響應信號途徑中發揮不同的作用。

A：小白麥和京麥8號熱脅迫24 h的生長情況；B：小白麥和京麥8號中在熱脅迫后 TaMBF1c基因的表達情況。

3 討 論

MBF1蛋白廣泛存在于各種植物中，在擬南芥[17,24]、水稻[12]、小麥[12]和葡萄[20]等植物中均有報道。小麥基因組內大多數基因都存在序列相似的三個同源拷貝基因[25]，已有研究發現，TaMBF1c-B(TaMBF1c)能夠提高轉基因小麥抗旱能力[12]。本研究通過小麥基因組參考序列，在小麥中同源克隆了該基因的同源基因TaMBF1c-A和TaMBF1c-D。序列比對結果表明，TaMBF1c-A和TaMBF1c-D基因所編碼的氨基酸序列與TaMBF1c-B的氨基酸序列同源性極高，且含有1個MBF1保守結構域和一個helix-turn-helix結構域。三級結構預測表明，TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D三個基因C末端helix-turn-helix結構域中的谷氨酸是TBP結合位點[3,9,15]。Kenichi等[7]研究發現，這三個同源基因N末端存在與轉錄因子互作的結構域，且在N端存在長短不一的loop結構，TaMBF1c-B最短，TaMBF1c-A和TaMBF1c-D間也存在差異，推測其結構變化導致構象變化進而影響相互作用的能力[3, 7]。小麥與水稻、擬南芥等物種的進化分析發現，小麥祖先種烏拉爾圖小麥與擬南芥、番茄和土豆的進化關系較近，說明TaMBF1c基因可能是從雙子葉植物進化而來。

TaMBF1c在植物生長發育調控中發揮著重要作用[12]。Takuto等[26]研究發現，擬南芥AtMBF1在葉片特異表達，不僅影響葉細胞的擴張，而且還影響葉擴張階段葉細胞的倍性水平。在本研究中，TaMBF1c-A和TaMBF1c-B在葉片中高表達，具有葉片表達特異性，推測它們可能與小麥葉片細胞的擴張有關；而TaMBF1c-D在根部特異性表達，推測可能與小麥根部發育有關，這些結果說明，TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D在小麥不同器官中發揮著不同作用，TaMBF1c-D可能在長期進化中出現了新的功能。

TaMBF1c啟動子作用元件預測分析發現，干旱響應元件(MYB element/MBS element)在TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因CDS區近端，在TaMBF1c-A基因CDS區遠端；本研究還發現，TaMBF1c-A在小白麥干旱脅迫誘導表達量高于TaMBF1c-B和TaMBF1c-D，說明干旱響應元件MYB element與基因CDS區的距離遠近可能會影響TaMBF1c的表達量。熱響應元件HSE element在TaMBF1c-A基因啟動子區域有3個，而在TaMBF1c-B和TaMBF1c-D各有4個；且TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D的HSE element元件各不相同。在本研究中，無論在熱敏感或耐熱小麥中，TaMBF1c-A的表達量遠高于TaMBF1c-B和TaMBF1c-D。推測TaMBF1c響應干旱和熱脅迫的表達變化可能與啟動子區域的順式作用元件序列的位置、數目或堿基組成差異有關[27]。

目前，在擬南芥和葡萄中發現MBF1c受到干旱誘導時上調表達[10,20]。本研究發現，在干旱脅迫條件下，TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因在耐旱小麥中的表達量遠遠低于敏感小麥，可能耐旱小麥中啟動子序列與敏感小麥不同，或者感知信號途徑不同而引起表達量的差異。TaMBF1c可能響應干旱脅迫反應機制，是作物抗旱育種優異的候選基因資源。利用Cas9技術抑制TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因的表達，可能增強小麥的耐 旱性。

前人報道，MBF1c參與熱響應相關途徑，高表達可增強植物耐熱性[17-18]。Qin等[12]報道，在熱脅迫下可誘導小麥MBF1c(TaMBF1c-B)基因的表達。本研究發現，TaMBF1c-B基因在熱敏感和耐熱小麥中受熱脅迫誘導表達，但在耐熱小麥中表達量明顯高于熱敏感小麥；且TaMBF1c-A基因在熱敏感或耐熱小麥中受熱誘導表達趨勢一致，說明TaMBF1c-A和TaMBF1c-B正向調控小麥的耐熱性，但TaMBF1c-A的表達量要遠遠高于TaMBF1c-B，因此，TaMBF1c-A在耐熱調控過程中可能起主要作用。在熱脅迫條件下，TaMBF1c-D僅在熱敏感小麥中高表達，而耐熱小麥中TaMBF1c-D低于熱敏感小麥，且TaMBF1c-D在根部特異表達。因此，熱脅迫信號途徑中，精確地調控TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D基因的表達可影響小麥的耐熱性。