適用于轉錄組測序的大麥胚芽鞘保衛細胞分離方法優化

張子軒，郭融融，次而甲瑪，王宏鵬，王俊斌，曹高燚，包曙光，謝曉東，陳小強

(天津農學院農學與資源環境學院，天津300384)

大麥(HordeumvulgareL.)是世界上第四大糧食作物，是啤酒工業的基礎原料和優良的牲畜飼料，因其遺傳多樣性豐富，且具備耐旱、耐鹽堿、耐重金屬、耐缺鉀、耐缺氮等優良品質，是研究作物抗逆機理的理想材料[1]。

對于陸地植物來說，氣孔是植物體與大氣之間交換氣體的主要通道，也是植物體失去自身水分最主要的通道[2]。植物體表面的氣孔一般由兩個保衛細胞圍成，是一類高度分化的細胞，它們對于多種內外刺激非常敏感，在感知到環境因子的變化后，迅速對其作出應答，并通過調節氣孔的開度來準確而靈敏的作出應激反應，因此，研究保衛細胞與環境因素之間的關系是研究植物對外界環境脅迫應答良好的模式實驗系統[3]。保衛細胞在逆境脅迫下，發生膨壓改變，導致氣孔開度變化，從而影響植物的光合作用、蒸騰作用等生物學過程[4]。分離保衛細胞，對保衛細胞轉錄組、蛋白質組、代謝組等組學水平的變化進行分析，有利于發現起關鍵作用的生物學過程和起節點作用的信號組分。

Zeiger等[5]首次對植物保衛細胞原生質體進行分離，此后二段酶處理法逐漸完善[5-8]，這為分子機理的研究提供了材料基礎。Obulareddy等[7]研究表明，酶解時間不影響保衛細胞原生質體的純度和產量，但影響RNA的提取量。此后，該方法也在鴨跖草、擬南芥、蠶豆、甜菜、番茄等植物物種中獲得成功，使得保衛細胞的研究漸趨深入[8-12]。

Hetherington等[2]通過對擬南芥、蠶豆等模式植物的研究, 已經掌握了氣孔響應環境變化的一些規律。但楊 洋等[13]研究表明，禾本科植物的保衛細胞和模式植物擬南芥的保衛細胞有許多不同之處，擬南芥的保衛細胞是腎形的，而禾本科植物的保衛細胞均為啞鈴形。魏 琳等[14]研究也發現，禾本科小麥氣孔對生理因子的應答幅度明顯大于擬南芥，說明對于糧食安全具有重大意義的大麥、小麥、水稻、玉米等禾本科植物的啞鈴形保衛細胞可能使氣孔調控更加精細和高效。因而，禾本科植物啞鈴形保衛細胞的分離及表達譜的研究亟待開展起來。但禾本科植物保衛細胞為啞鈴形，且保衛細胞外有大小相近的副衛細胞，表皮中還有表皮毛、硅化細胞、栓化細胞、邊刺等特化細胞，保衛細胞不易從其他細胞中分離出來。此外，禾本科作物的角質層較厚，不利于酶解溶液對細胞壁的解離。因此，分離禾本科啞鈴形保衛細胞存在較大困難。其次，就組學研究而言，需要較大數量的保衛細胞，因此對保衛細胞分離技術的要求也較高[15]。

隨著新一代高通量測序技術的發展，脅迫誘導的轉錄組分析已經在一系列禾本科植物中完成，但目前轉錄組研究主要集中在整株植物、葉片和根系上[16]，由于禾本科植物保衛細胞不易分離，導致RNA提取工作效率低下，質量不高，因此，對保衛細胞轉錄組進行研究很少。本研究以大麥幼苗胚芽鞘為研究材料，通過優化胚芽鞘表皮條撕取方法，利用優化的一步酶解法分離保衛細胞，以期為進一步提取高質量的大麥幼苗胚芽鞘保衛細胞RNA進行轉錄組相關研究奠定 基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 大麥種子

供試大麥品種為Morex，由天津農學院天津-布里斯托環境變化對農作物影響研究中心提供。

1.1.2 試驗試劑

酶解液配方如下：

酶解基礎液100 mL：D-山梨醇9.838 8 g，嗎啉乙磺酸0.097 6 g，聚乙烯聚吡咯烷酮K40 0.100 0 g、牛血清白蛋白0.250 0 g，100 μL CaCl2(0.5 mmoL·L-1)、100 μL MgCl2(0.5 mmoL·L-1)、10 μL KH2PO4(10 μmoL·L-1)，DEPC處理水90 mL，pH值調控在5.4～5.8之間，使用KCL與KOH調節，配制完畢于-4 ℃保存。

酶解工作液10 mL：酶解基礎液8.5 mL，纖維素酶R-10 0.150 0 g，離析酶R-10 0.050 0 g；1 mL蟲草素-5′-三磷酸鈉(0.1 mg·mL-1)；500 μL放線菌素-D(0.3 mg·mL-1)；20 μL RNA抑制劑。震蕩充分溶解后外覆錫紙隔絕光源，于-20 ℃保存。

熒光素雙醋酸酯(FDA)溶液：將0.050 0 g熒光素雙醋酸酯溶于10 mL丙酮中，配制成5 mg·mL-1母液，4 ℃避光保存，工作濃度為10 μg·mL-1。

1.2 試驗方法

1.2.1 大麥幼苗培養

挑選籽粒飽滿、大小均勻的大麥Morex種子150粒，水中浸泡10 min后瀝干，剝去稃皮，露出胚部后轉移至小燒杯中，70%的乙醇消毒1 min后，用蒸餾水沖洗3次以上，備用。

將鋪有醫用紗布的發芽盒用蒸餾水潤濕，將沖洗過的大麥種子腹溝向下合理密度均勻排列后，半掩盒蓋并轉移至大麥生長室(溫度27± 1 ℃，濕度60±2%，光照強度3 000 lx，光周期 12 h)，澆足水，培養60 h，以24 h為一周期補水。60 h后，待全苗有80%的葉尖露出5 mm的胚芽鞘時，觀察大麥幼苗生長情況。

1.2.2 大麥胚芽鞘表皮條的獲取

在超凈工作臺中，準備兩個一次性小型培養皿，分別裝入DEPC處理水與酶解基礎液。取一片DEPC 處理的無菌潔凈載玻片作為操作板。滴管吸取少量DEPC處理水于載玻片上，剪取一段符合要求的幼苗移至載玻片，刀片于“V字領”(圖1a)起沿愈合線(圖1b)縱切幼苗，用無菌鑷子剝離胚芽鞘內包裹的大麥幼葉，得到兩個半圓柱體空心胚芽鞘段，用無菌刀片去掉3 mm尖端后，外側向下，使用刀背輕輕“刮壓”胚芽鞘近根端5 mm處位置，刀鋒不完全切斷葉肉層細胞后翻轉胚芽鞘至外側向上，將“刮壓”區域向尖端撕去，獲得一段胚芽鞘表皮條。之后用解剖針做穿孔處理(在表皮條上用解剖針扎數個小眼)或非穿孔處理并迅速轉移至酶解基礎液中。重復操作獲得足量(≥100)大麥胚芽鞘表皮條。

a：大麥胚芽鞘“V字領”；b：大麥胚芽鞘愈合線。

1.2.3 不同酶解溫度和酶解時間下大麥胚芽鞘保衛細胞的分離效果測定

取25支潔凈的1.5 mL離心管，每一支加入500 μL酶解液。用解剖針小心挑起表皮條，每支離心管中裝入5片，分別在暗環境下置于20、25、30、35和40 ℃水浴鍋中，分別水浴處理1、1.25、1.5、1.75和2 h后，用DEPC處理水輕柔漂洗每一片表皮條，于透射顯微鏡下檢測酶解結果，分析最佳酶解效果。

1.2.4 穿孔處理下大麥胚芽鞘保衛細胞的分離效果測定

將大麥胚芽鞘表皮條做穿孔(在表皮條上用解剖針扎數個小眼)和不穿孔兩種處理，比較兩種處理對大麥胚芽鞘保衛細胞分離的影響。

1.2.5 大麥胚芽鞘保衛細胞活性檢測

取未經酶解的大麥胚芽鞘表皮條與酶解徹底的大麥胚芽鞘表皮條，經FDA熒光染色劑染色后置于熒光顯微鏡下觀察，驗證酶解法對保衛細胞活性的影響。

1.2.6 轉錄抑制劑作用下大麥胚芽鞘保衛細胞RNA含量的測定

2 結果及分析

2.1 不同酶解時間、不同酶解溫度組合對大麥胚芽鞘保衛細胞分離的影響

從圖2可以看出，纖維素酶與離析酶存在最適酶解溫度，溫度不足導致酶解不徹底(圖2a)；溫度過高則導致酶失活，造成酶解不徹底和保衛細胞失活(圖2b)；工作酶也有一定的活性時間，酶解時間過短導致酶解不徹底(圖2c)，酶解時間過長則導致表皮層的蠟質層與角質層受損嚴重，因此，需要篩選出酶解溫度與酶解時間的最佳組合。為了確定酶解溫度與酶解時間的最佳搭配，撕取100株大麥胚芽鞘表皮條，酶解溫度分別設置為20、25、30、35和40 ℃，酶解時間分別設置為1、1.25、1.5、1.75和2 h，并兩兩組合，摸索最佳組合，最終確定酶解最佳組合為酶解溫度30 ℃、酶解時間1.5 h(圖2d)，經過三次重復試驗驗證，確定該組合是可行的。

a：酶解溫度過低的酶解效果；b：酶解溫度過高的酶解效果；c：酶解時間不足的酶解效果；d：最適酶解溫度和酶解時間(水浴30 ℃，1.5 h)的酶解效果。

2.2 穿孔處理對大麥胚芽鞘保衛細胞分離的影響

將大麥胚芽鞘表皮條做穿孔處理，使酶解液能夠滲入其中以提高酶解質量。從圖3可以看出，在相同酶解時間(1.5 h)和酶解溫度(30 ℃)下，未經穿孔處理的大麥胚芽鞘表皮條(圖3a)酶解不徹底，有殘留表皮細胞；而經穿孔處理的大麥胚芽鞘表皮條(圖3b)酶解徹底，獲得的表皮條僅有保衛細胞，比較純凈。

a:未經穿孔處理的大麥胚芽鞘表皮條；b:經穿孔處理的大麥胚芽鞘表皮條。

2.3 大麥胚芽鞘保衛細胞活性檢測結果

以透射顯微鏡觀察酶解前后的胚芽鞘表皮條(圖4a和4b)為對照，用熒光顯微鏡觀察大麥胚芽鞘表皮條酶解前后的染色結果，可以看出，FDA染色后，胚芽鞘保衛細胞酶解前后均發黃綠色熒光(圖4c和4d)，說明本研究酶解法對保衛細胞的活性幾乎沒有影響或影響很小，可用于后續RNA的提取以及進一步的轉錄組測序研究。

a：未經酶解的胚芽鞘表皮條；b：酶解后的胚芽鞘表皮條；c：未經酶解FDA染色的胚芽鞘表皮條；d：酶解后FDA染色的胚芽鞘表皮條。

2.4 轉錄抑制劑對大麥胚芽鞘保衛細胞RNA含量的影響

從表1可以看出，加入蟲草素和放線菌素-D兩種轉錄抑制劑的酶解液和未加入兩種轉錄抑制劑的酶解液分別對大麥胚芽鞘麥皮條酶解后，其大麥胚芽鞘保衛細胞所提取的RNA濃度和純度均相差不大，表明加入轉錄抑制劑后，對大麥胚芽鞘保衛細胞的RNA含量沒有影響。

表1 轉錄抑制劑對大麥胚芽鞘保衛細胞RNA含量的影響

3 討 論

氣孔是植物與外界進行氣體交換的通道。保衛細胞是植物表皮的特化細胞，外界因素通過影響保衛細胞的膨壓，控制氣孔開放與關閉。目前，已鑒定出與氣孔信號轉導相關的基因和氣孔發育不同階段的轉錄因子[17-18]。

隨著科技的發展，轉錄組學已在植物抗病、抗逆和遺傳進化過程中得到了廣泛的應用。

保衛細胞具有功能的異質性，因而采用組學的技術方法能夠從整體水平上全面系統地解析保衛細胞的功能機制。對禾本科植物保衛細胞進行轉錄組測序及轉錄組差異性表達分析有可能填補禾本科植物研究領域的空白。但采用組學方法研究保衛細胞功能通常需要大量高質量的保衛細胞，對保衛細胞分離技術的要求較高[15]。

保衛細胞分離純化工作在雙子葉植物中已經有大量的報道，如Fischer等[19]和Willmer等[20]對蠶豆保衛細胞的獲取技術都有比較詳細的敘述[19-20]；項 燕等[21]采用兩步酶解法對蠶豆保衛細胞進行分離，優化撕取環境使獲取表皮條的成功率大幅提升；梁 蕓等[22]在兩步酶解法的基礎上，采用更加廉價的纖維素酶，摸索出最佳酶解時間，成功獲得大量的擬南芥保衛細胞原生質體。但是鑒于單子葉植物氣孔的特點，目前有關單子葉植物保衛細胞分離純化的相關報道較少。因此，本研究通過優化表皮條撕取方法和利用一步酶解優化法分離大麥胚芽鞘保衛細胞，為提取高質量的大麥幼苗胚芽鞘保衛細胞RNA，以及進一步進行轉錄組相關研究奠定夯實的基礎。

大麥胚芽鞘的保衛細胞在葉片中含量較低，考慮到發芽率和撕取大麥胚芽鞘的成功率，大麥幼苗的總需求量較高，大約在150株左右。而且相對大麥葉片來說，大麥胚芽鞘體積較小，撕取大麥胚芽鞘表皮條的操作難度更高，因此，如何快速獲得大量合格胚芽鞘表皮條成為關鍵。本研究利用優化后的撕取法來獲得高質量的大麥胚芽鞘表皮條，效果較好，通過“刮壓”這一物理手段人為制造出表皮條與葉肉細胞層的分界，形成便于撕取表皮條的斷層。這個改進極大地縮短了大麥胚芽鞘表皮條的獲取速度，解決了保衛細胞因離體時間過長導致活性下降甚至死亡的問題，有效保障了后續試驗順利進行。

與兩步酶解法比較，使用一步酶解法[23-24]縮短試驗時長，從而提高了保衛細胞的存活時間。本研究表明，表皮條須按一定比例和酶解液混合才能有效地分離保衛細胞，且酶解溫度及酶解時間對分離保衛細胞的質量和產量影響最大。酶解溫度過低或酶解時間太短，細胞壁分解不充分，表皮細胞不能被徹底酶解掉，表皮細胞殘留嚴重，導致保衛細胞RNA不純，不能進行后續試驗研究；酶解溫度過高或酶解時間過長則會加重對保衛細胞的損傷，導致保衛細胞從表皮條上提前脫落，活力降低。本研究對工作酶的最適溫度與最適時間設置了一系列梯度組合進行摸索，確定了酶解的最佳溫度與時間組合(水浴30 ℃、1.5 h)，保證了所獲取保衛細胞的純度和活力。另外，本研究酶解前用解剖針對胚芽鞘表皮條進行穿孔處理，使酶解液很好滲透進入胚芽鞘內部，更快速地酶解掉表皮細胞，結果證實該方法是行之有效的，效果較好。

因保衛細胞RNA的質量會隨保衛細胞離體時間的增加而降解，所以在提取RNA時，保證保衛細胞的活性是一個極其重要的環節。為了檢測利用上述改進方法提取的保衛細胞是否具有高活力，本研究利用FDA法對大麥保衛細胞進行染色鑒定。FDA是一種非極性物質，本身無熒光，能自由地穿越細胞質膜，在活細胞內，FDA被細胞內的酯酶裂解成有極性且發綠色熒光的熒光素，由于熒光素不能自由通過質膜，因而可以在熒光顯微鏡下通過觀察細胞是否有熒光來確定細胞活性[25]。保衛細胞經FDA染色后，在488 nm激發光下，發黃綠色熒光表示有活力，發紅色熒光(葉綠素產生)表示死亡，且亮度越高則活力越強。本研究結果表明，本試驗采取的一步酶解法提取的保衛細胞發黃綠色熒光，且酶解前后亮度差別不大，說明酶解對保衛細胞的活性無影響或影響很小，可以用于后續試驗。同時，本研究將酶解液基礎液作為表皮條暫存液，因酶解基礎液中包含維持細胞滲透壓和活性的必要元素，能夠在酶解過程中提供保持其活性的液體環境，從根本上延長了表皮條保衛細胞的活性，從而為下一步試驗奠定基礎。

蟲草素被發現有抑制mRNA翻譯的作用，放線菌素-D則可以抑制RNA的合成特別是mRNA的合成[26]，本研究在酶解液中加入蟲草素和放線菌素-D兩種抑制劑，并與未加入兩種抑制劑的酶解液分別處理大麥胚芽鞘表皮條，對保衛細胞RNA含量進行比較，結果表明，兩種抑制劑對RNA的提取量沒有太大影響，因此，蟲草素與放線菌素-D可作為酶解過程中大麥胚芽鞘保衛細胞RNA的保護劑。

4 結 論

本研究優化了獲取大麥胚芽鞘表皮條的方法和酶解方法，從而能夠高效提取高活性的大麥胚芽鞘保衛細胞，為進一步轉錄組測序提供很好的材料來源。通過“刮壓”人為制造出表皮條與葉肉細胞層的分界，從而便于撕取表皮條，縮短大麥胚芽鞘表皮條的獲取時間；將大麥胚芽鞘表皮條做穿孔處理，使酶解液能夠滲入其中以減少酶解時間，提高酶解質量；確定了酶解的最佳溫度與時間組合為水浴30 ℃、1.5 h，保證了所獲取保衛細胞的純度和生理活性。在酶解液中加入轉錄抑制劑(蟲草素與放線菌素-D)，避免酶解過程中高溫和機械傷害對細胞內基因轉錄表達的誘導，且不影響RNA含量，保證了酶解前后大麥胚芽鞘保衛細胞RNA含量的一致性以及后續轉錄組測序的嚴謹性。