小麥種子顏色測定的色差計法和目測法及對穗發芽抗性的鑒定效果

陳 泠，朱展望，劉易科，佟漢文，何偉杰，鄒 娟，張宇慶，高春保,2

(1.湖北省農業科學院糧食作物研究所/糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室/農業部華中地區小麥病害生物學科學觀測實驗站/湖北省小麥工程技術研究中心，湖北武漢 430064；2.主要糧食作物產業化湖北省協同創新中心，長江大學，湖北荊州 434025)

我國的長江中下游麥區、西南麥區、東北春麥區等區域在小麥成熟時節常出現陰雨天氣，小麥易發生穗發芽災害[1-2]。穗發芽不僅會降低小麥產量，易使籽粒霉爛、品質劣化，而且會導致小麥喪失種用價值。小麥種子顏色目測可區分為紅粒小麥和白粒小麥，且一般認為紅粒小麥的穗發芽抗性比白粒小麥強[3-4]。小麥種子顏色的目測法結果易受主觀和環境因素影響，誤差較大。NaOH法也可以判斷小麥種子顏色，紅粒和白粒小麥種子經5% NaOH溶液浸泡后，溶液分別呈深紅色和淡黃色[5]，但這種方法也存在感官誤差。用色差計測量顏色，數據客觀穩定，可排除人為因素干擾，便于不同測量材料間定量比較。色差計的測定方法多采用CIELAB(L*a*b*)系統[6]。該系統以3個色度測量值L*、a*、b*表示樣品的顏色，其中L*為正值表示亮，為負值表示暗；a*為正值表示紅色，為負值表示綠色；b*為正值表示黃色，為負值表示藍色。Peterson等[7]用色差計法和目測顏色分級法分析了543份美國硬白冬小麥籽粒顏色，發現部分色差計參數L*、a*、b*在不同分級間差異顯著，但無法用于準確判斷顏色分級。Groos等[8]認為，a*/L*比值比較適合分析小麥籽粒顏色和小麥穗發芽間的關系。Imtiaz等[5]用小麥種子色差計數據與小麥穗發芽進行分析，結果顯示，a*/L*比值與種子發芽指數、穗發芽率間相關系數分別為-0.64和-0.37(P< 0.001)。Zhu等[9]在全基因組關聯定位小麥穗發芽抗性QTL位點時，將色差計參數a*/L*比值作為小麥種子顏色的替代值來分析QTL位點與種子顏色的相關性。

本研究利用色差計分析小麥種子顏色，期望用色度的指標L*、a*和b*等來定量分析小麥的種子顏色，同時比較色差計法和目測法測定結果與小麥穗發芽抗性的相關性，以期為穗發芽抗性分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究分析用小麥材料790份，包括湖北地方小麥資源種質材料557份(由湖北省中期種質資源庫提供)和優異品種(系)233份(含國外材料12份)。驗證用小麥材料228份(國內育成品種和品系217份，國外材料11份)。所有材料于2018-2019年度種植于湖北省農業科學院南湖試驗田，正常田間管理。

1.2 整穗發芽率測定

在小麥生理成熟時，每個分析材料隨機選取5個穗子(含10 cm穗下節部分)，每個驗證材料隨機選取10個穗子，取樣時確保穗子完整、無病害、無缺損。樣品室溫晾干5 d，保存于-20 ℃冰箱中待用。材料收集完成后，從冰箱中取出穗子，插在有孔的托盤上，室溫晾干2 d。托盤孔徑0.6 cm，孔距1.6 cm。托盤移至人工氣候室中進行自動降雨模擬實驗，每4 h噴淋20 min，室內溫度20±2 ℃。處理5 d后取出發芽整穗，保存在-20 ℃冰箱中，以便后期人工計數。以種子胚芽或胚根超過種子長度的一半作為發芽鑒定標準。小麥材料的整穗發芽率(SGR)=(所有穗子的發芽種子數/所有穗子種子總數)×100%。

1.3 色差計測量

色差計為柯尼卡美能達CM-5(https://sensing.konicaminolta.asia/product/cm-5-spectrophotometer/)。田間小麥材料成熟后，人工收割，利用單穗脫粒機進行脫粒，每個小麥品種(系)經人工去雜，剔除病害、雜粒和不飽滿粒后，稱取30 g種子用于色差計測量顏色參數。色差計先用白板校正，然后開始下述操作步驟：將種子倒滿測量平皿，用直尺沿平皿表面刮平后進行測量。重復上述步驟，獲得L*、a*、b*的3次測量值，L*值越大，顏色越亮(白)，a*值越大，顏色越偏紅色，b*值越大，顏色越偏黃色。取3次結果的平均值用于統計分析。

1.4 數據分析

利用Excel和SPSS20軟件對數據進行統計和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 小麥籽粒顏色的色差計測定結果和穗發芽情況

小麥籽粒的L*、a*和b*平均值分別為 52.60±3.18、10.19±1.03和27.54±2.30，其中a*的變異系數最大，b*值其次，L*最小(表1)。

表1 色差計和穗發芽結果分析

通過目測法將790份材料分成455份紅粒材料和335份白粒材料。對色差計測定指標L*、a*和b*及其比值進行獨立樣本T檢驗表明，紅粒和白粒材料間L*、a*、b*、a*/b*和a*/L*均值均差異顯著，其中紅粒的a*、a*/b*和a*/L*均值顯著高于白粒，其他值均顯著低于白粒。說明紅粒小麥種子顏色偏紅暗，白粒小麥種子顏色偏黃亮。紅粒小麥的SGR均值顯著低于白粒小麥，說明紅粒小麥比白粒小麥抗穗發芽。紅粒和白粒小麥SGR的變化范圍分別為0.00%～100.00%和4.33%～ 99.58%，說明紅粒和白粒小麥中都有抗穗發芽和感穗發芽材料。

紅粒和白粒的L*、a*和b*值變異系數相對于總體有所降低，但紅粒SGR變異系數高達122.36%，說明紅粒小麥在品種(系)間SGR值差異很大。

2.2 色差計參數、種子顏色、SGR之間的相關性

對色差計數據、種子顏色(紅粒設置為1，白粒設置為2)和SGR數據相關性分析(表2)表明，790份小麥材料的色差計參數與種子顏色均顯著相關，其中a*、a*/b*和a*/L*與種子顏色呈負相關，其他呈正相關。特別是a*/b*和b*/a*與種子顏色相關性最強，相關系數分別為-0.934和0.941，說明a*/b*值越大或b*/a*值越小，種子顏色越趨于紅色。色差計參數、種子顏色與SGR均顯著相關，其中a*/b*和b*/a*與SGR相關性較高(相關系數分別為-0.831和 0.835)，而種子顏色與SGR的相關性最高(相關系數為0.854)，說明白粒(種子顏色值高)或b*/a*值大，穗發芽率高。

表2 色差計數據、種子顏色和SGR間的相關性

與總體相比，紅粒和白粒材料的部分數據間相關性發生變化。如a*與L*和b*的相關性由負相關變為正相關。紅粒材料中，僅a*/b*和b*/a*與SGR顯著相關。白粒材料中，除L*和b*/L*外，其他色差計數據均與SGR顯著相關。色差計各參數與SGR相關值都較低。

2.3 色差計法判斷種子顏色回歸方程及驗證

將種子顏色設定值作為因變量(紅粒設置為1，白粒設置為2)，色差計參數為自變量，進行逐步回歸分析，得到方程Y=-12.699+ 1.232b*/a*+21.308b*/L*-0.349b*+ 0.175L*，調整后R2為 0.908。利用該方程對790份分析材料進行檢驗，紅粒材料Y值為0.61～1.42，白粒材料Y值為1.53～2.41，四舍五入后與目測結果完全一致。用228份驗證材料進行驗證，得到紅粒材料Y值為0.85～1.36，白粒材料Y值為 1.64～2.22，與感官評價一致，說明用色差計可以很好地判斷種子顏色。

利用色差計測量結果可以比較不同小麥材料的種子顏色差異。按種子L*、a*、b*、a*/b*和b*/a*值的升高順序對228份驗證小麥材料進行排序，取部分小麥材料種子進行種子顏色比較(圖1)。隨著L*值的升高，小麥種子顏色變亮(圖1A)。a*值升高，種子紅色加深(圖1B)。b*值升高，種子越偏黃色(圖1C)。a*/b*值升高，種子顏色由偏黃色變為偏紅色(圖1D)。b*/a*值升高，種子顏色變化與a*/b*的種子顏色變化相反(圖1E)。

A～E：小麥種子按L*，a*，b*，a*/b*和b*/a*升序排列，數字表示小麥種子按L*，a*，b*，a*/b*和b*/a*升序的排名。

2.4 色差計參數、種子顏色與SGR回歸線性 分析

將790份小麥材料的SGR作為因變量，種子顏色(紅粒為1，白粒為2)作為自變量，進行逐步回歸分析，回歸方程為Y=-0.467+0.622X，調整后R2=0.729。將790份小麥材料的SGR作為因變量，以色差計參數L*、a*、b*、a*/b*、b*/a*、a*/L*和b*/L*為自變量，進行逐步回歸分析，得到方程Y=-13.271+0.893b*/a*+23.376b*/L*-0.410b*+0.196L*，調整后的R2為 0.725。上述結果說明小麥種子顏色(紅或白)可解釋小麥穗發芽抗性72.9%的變異，色差計參數可解釋小麥穗發芽抗性72.5%的變異。

將455份紅粒小麥材料的SGR作為因變量，色差計參數L*、a*、b*、a*/b*、b*/a*、a*/L*和b*/L*為自變量，進行逐步回歸分析，得到方程Y=-42.427+6.951b*/a*-42.702a*/L*+60.194a*/b+19.302b*/L*，調整后的R2為 0.114，說明紅粒小麥中，色差計參數可解釋其穗發芽抗性11.4%的變異。同理，在白粒小麥中進行相應的逐步回歸分析，得到方程Y= 1.027-0.164a*+2.411b*/L*，調整后的R2為 0.087，說明白粒小麥中，色差計參數只能解釋白粒小麥穗發芽抗性8.7%的變異。

3 討 論

3.1 色差計法可用于小麥種子顏色定量分析

本研究利用色差計參數和小麥種子顏色目測法結果構建了回歸線性方程，R2達到了0.9以上，進一步利用228份獨立小麥材料驗證分析表明，此方程可靠性較高，說明用色差計參數可準確判定小麥種子顏色(紅或白)。色差計法與目測法各有優缺點：色差計法可用于小麥種子顏色的定性定量分析，但相對目測法感官判斷，稍費時繁瑣；目測法操作簡單，但誤差大，不能定量比較種子顏色。因此，在小麥種子顏色分析中，可將色差計法作為目測法定性的補充手段，用于種子顏色的定量比較分析。

3.2 種子顏色目測法和色差計法對小麥穗發芽的鑒定效果

人們在育種和研究中發現，紅粒小麥比白粒小麥抗穗發芽。Zhou等[2]對717份中國地方小麥品種進行了6個環境下的種子發芽實驗，結果表明，白粒品種的發芽率顯著高于紅粒品種，發芽率均值范圍分別為47.2%～79.6%和19.1%～ 56.0%。陳 泠等[4]對169份白粒小麥和71份紅粒小麥進行4個環境的整穗發芽實驗，結果也顯示，白粒品種發芽率均值顯著高于紅粒品種，均值范圍分別為63.30%～78.81%和36.3%～ 71.35%。本研究中，紅粒小麥SGR顯著低于紅粒小麥，這與前人研究結果一致。

本研究相關性分析結果顯示，種子顏色目測法數據、色差計法參數值a*/b*和b*/a*與小麥穗發芽相關性強，相關系數分別為0.854、-0.831和0.835；其次是a*/L*與小麥穗發芽的相關性，相關系數為-0.735。單獨分析紅粒小麥和白粒小麥時，a*/b*和b*/a*與穗發芽的相關性也高于a*/L*，因此在分析顏色與穗發芽抗性關系時，可以考慮用色差計參數a*/b*和b*/a*。線性回歸分析顯示，種子顏色目測法數據和色差計參數可分別解釋小麥穗發芽抗性72.9%和72.5%的變異。這說明小麥種子顏色對小麥穗發芽抗性的影響較大。但單獨分析紅粒小麥或白粒小麥時，色差計參數與穗發芽抗性相關性弱，相關系數最大為0.244。線性回歸分析表明，色差計只能分別解釋紅粒和白粒小麥穗發芽抗性的11.4%和8.7%變異，說明在紅粒小麥中或白粒小麥中，顏色對穗發芽抗性影響較小，還存在其他影響穗發芽抗性的因素，如抗性基因或抗性QTLs等[9-13]。

790份小麥材料中，紅粒小麥材料和白粒小麥材料的SGR范圍分別為0～100%和4.33%～99.58%，說明紅粒和白粒小麥中都有抗性和感性品種。特別是455份紅粒小麥中，穗發芽率變異系數高達122.36%。因此，必須通過穗發芽鑒定實驗確定小麥品種(系)的穗發芽抗性，而不能僅憑顏色或色差計數據。