寧夏春小麥種質資源Wx基因分子鑒定及其分布

亢 玲，李瑞博，王小亮，張維軍，何進尚，陳東升

(1.寧夏農林科學院農作物研究所，寧夏銀川 750004； 2.西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100)

顆粒結合淀粉合成酶(granule-bound starch synthese ,GBSS)是直鏈淀粉合成途徑中的關鍵酶，又稱為Waxy蛋白(簡稱Wx蛋白)。普通小麥(TriticumaestivumL.)Wx蛋白由Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1三個蛋白亞基組成，分別由位于7AS染色體上的Wx-A1基因、4AL染色體上的Wx-B1基因和7DS染色體上的Wx-D1基因所編碼[1]。小麥淀粉由直鏈和支鏈淀粉兩種類型組成，二者的含量與比例影響小麥淀粉的理化特性，最終決定小麥面粉的用途[2]。Wx蛋白亞基的缺失及組合類型不同，其直鏈淀粉含量存在明顯差異。陳東升等[3]研究表明，Wx蛋白缺失類型對直鏈淀粉含量的效應依次為：Wx-Al、Wx-Bl和Wx-Dl全缺失>Wx-Bl和Wx-Dl缺失>Wx-Al和Wx-B1缺失>Wx-Al和Wx-Dl缺失>Wx-B1缺失≈Wx-Dl缺失>Wx-A1缺失。當3個Wx蛋白全部缺失時，直鏈淀粉含量接近于零，即為糯小麥。前人研究表明，不同Wx蛋白亞基缺失類型的小麥具有不同的加工用途，Wx-Bl亞基缺失的小麥品種，其直鏈淀粉含量為22.3%，更適合制作優質面條；Wx-Al、Wx-Bl和Wx-Dl亞基全缺失的小麥品種，其直鏈淀粉含量幾乎為零，可形成全糯小麥，可做配粉滿足不同面制品加工的需要，有利于制作速凍和冷凍食品，也會延長面包等制品的貨架壽命[4-7]。因此，分析和鑒定Wx基因在寧夏春小麥種質資源中的分布規律，對選育和改良優質面條小麥品種具有重要意義。

寧夏是我國春小麥生產的重要地區之一，面條是寧夏傳統主食之一。近年來，寧夏育種者主要以小麥產量和蛋白品質為研究重點，而對小麥的淀粉品質研究較少，對寧夏春小麥種質資源中Wx等位基因的變異與分布情況還不清楚。因此，本研究利用已開發的Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1基因分子標記，對寧夏春小麥種質資源淀粉品質基因Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1進行鑒定和評價，了解其變異類型和分布狀況，篩選Wx基因缺失的種質資源，以期為該地區和我國相關春麥區選育優質面條小麥品種提供種質資源。

1 材料與方法

1.1 材料來源

參試材料為299個寧夏春小麥種質資源，包括地方品種11個，審定品種45個，引進品種12個，高代品系231個，代表了寧夏春小麥生產和育種的現狀。對照材料有4個，分別為中國春、陜糯1號(Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1缺失)、Kanto107(Wx-A1、Wx-B1缺失)和白火麥(Wx-D1缺失)。

1.2 基因組DNA的提取

試驗材料在恒溫培養箱中育苗，剪取單株的新鮮嫩葉，利用CTAB法提取基因組DNA[8]，重復3次，用于Wx基因的檢測。

1.3 STS標記的選擇

每個Wx基因位點均選用2個分子標記分別進行獨立檢測，二者結果進行相互驗證以保證最終結果的可靠性，所用引物見表1。標記PA1和PA2用來檢測Wx-A1位點的變異，標記PB1和PB2用來檢測Wx-B1位點的變異，標記PD1和PD2用來檢測Wx-D1位點的變異。除PB1和PB2是顯性STS標記外，其余4個均為共顯性STS標記，引物序列由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

表1 檢測目標基因的引物序列及其擴增片段長度Table 1 Sequences and amplified fragment sizes of the primer for targeted genes

共顯性標記擴增得到相應的目標條帶，則屬于相對應的變異類型。例如，利用PA1標記在Wx-A1基因位點擴增得到389 bp條帶，則屬于野生型；擴增得到370 bp條帶，則屬于突變型(Wx-A1基因缺失)。顯性標記擴增基于有無目標條帶進行判斷。例如，利用PB1標記對Wx-B1基因位點擴增得到425 bp條帶，則屬于野生型；若無目標條帶，則屬于突變型(Wx-B1基因缺失)。

1.4 PCR擴增

PCR反應體系為20 μL，包括2×Es Taq MasterMix(Dye)(北京康為世紀生物科技公司)10 μL，10 μmol·L-1的上、下游引物各0.8 μL，10 μmol·L-1的模板DNA 1.5 μL，用ddH2O補至20 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55～70 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，34個循環；最后72 ℃延伸10 min。

1.5 PCR擴增產物的檢測

(1)Wx-D1位點基因的檢測：加6 μL Loading buffer溶于擴增產物中，取10 μL擴增產物用 1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用4S Green Plus 無毒核酸染料(上海生工)膠染法染色，所用電泳緩沖液為0.5×TAE，在130 V恒壓下電泳25 min，用紫外成像系統UVP上觀察拍照。

(2)Wx-A1和Wx-B1位點基因的檢測：擴增產物在5%的變性聚丙烯酰胺上分離，電泳緩沖液為1×TBE，100 W恒定功率電泳30 min，溫度上升到35 ℃時，在點樣孔中加入變性的擴增產物4 μL,對照Marker DL500(Takara)3 μL，60 W恒定功率電泳1 h，銀染法顯色后用紫外燈觀察，統計結果并保留圖像。

2 結果與分析

2.1 Wx-A1位點的檢測結果

利用標記PA1和PA2鑒定寧夏春小麥種質資源Wx-A1基因位點的多態性。部分材料的PCR擴增電泳結果如圖1所示，白禿子等297個材料與對照中國春一樣，分別擴增出389 bp 和336 bp的目的條帶，表明其基因型為Wx-A1a；18A5009和18A4328兩個材料與對照陜糯1號一樣，分別擴增出370 bp和317 bp的目的條帶，表明這兩個材料的基因型為Wx-A1b。

2.2 Wx-B1位點的檢測結果

利用標記PB1和PB2鑒定寧夏春小麥種質資源Wx-B1基因位點的多態性。部分材料的PCR擴增電泳結果如圖2所示，白禿子、山麥等267個材料與對照中國春一樣，擴增出425 bp和440 bp的目的條帶，表明其基因型為Wx-B1a；76N556等32個材料與對照關東107一樣，均未擴增出目的條帶，表明其基因型為Wx-B1b。

2.3 Wx-D1位點的檢測結果

利用標記PD1和PD2鑒定299個寧夏春小麥種質資源中Wx-D1基因位點的多態性。部分材料的PCR擴增電泳結果如圖3所示，白禿子、紅齊麥等297個材料與對照中國春一樣，分別擴增出867 bp和1 400 bp的目的條帶，表明其基因型為Wx-D1a；18A4224和18A4327兩個材料與對照白火麥一樣，分別擴增出279 bp和800 bp的目的條帶，表明這兩個材料的基因型為Wx-D1b。

2.4 寧夏春小麥種質資源Wx基因的組成與分布規律

從表2可以看出，299個寧夏春小麥種質資源中，Wx基因組成以野生型(Wx-A1a/Wx-B1a/Wx-D1a)為主，占參試材料總數的88.3%。在Wx-A1位點上，野生型Wx-A1a的品種(系)有297個，占參試材料總數的99.3%；突變型Wx-A1b的材料有2個，占參試材料總數的0.7%，分別為18A5009(06G52/寧春33號)和18A4328(永2602/揚糯麥1號)。在Wx-B1位點上，野生型Wx-B1a的品種(系)有267個，占參試材料總數的89.3%；突變型Wx-B1b的品種(系)有32個，占參試材料總數的10.7%，其中地方品種中有1個材料(和尚頭)的基因型為Wx-B1b，占地方品種數的9.1%；審定品種中有4個材料的基因型為Wx-B1b，占審定品種數的8.9%，分別為寧春1號、寧春7號、寧春27號、寧春49號；自育高代品系有27個材料的基因型為Wx-B1b，占自育高代品系數的11.7%，分別為18A5004、18A5010、18A4328等。其中18A4328(永2602/揚糯麥1號)的基因型為Wx-A1b/Wx-B1b。在Wx-D1位點上，野生型Wx-D1a的品種(系)有297個，占參試材料總數的99.3%；突變型Wx-D1b的品種(系)有2個，占參試材料總數的0.7%，為優選自育高代品系，分別為18A4224(寧春40號/永2602//寧春33號)和18A4327(永2602/揚糯麥1號)。

表2 299個寧夏春小麥種質資源Wx基因的組成與分布頻率Table 2 Composition and frequencies of Wx genes in ningxia 299 wheat germplasm resources

3 討 論

Wx蛋白直接影響小麥籽粒中直鏈淀粉含量的高低，進而會影響小麥面粉的上漿粘度、膨脹度和糊化特性，最終決定小麥面粉的用途。已有研究證實，Wx蛋白有Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1三個亞基，且在自然群體中存在有3個蛋白亞基的缺失類型；3個蛋白亞基同時缺失會造成小麥籽粒直鏈淀粉含量極低，表現為全糯小麥，這種面粉制作的面包具有多孔、膠粘而且容易變形的特點，制作出的面條易碎、柔軟且無法保持結構；一個或兩個蛋白亞基缺失會引起籽粒中直鏈淀粉含量在一定程度上的降低，表現為部分糯小麥，這種面粉具有較高的上漿粘度、膨脹度和較好的糊化特性，制成的面條質地柔軟且粘性強[3，5]。

本研究表明，寧夏春小麥種質資源Wx基因的組成以野生型(Wx-A1a/Wx-B1a/Wx-D1a)為主，突變型Wx-B1b的頻率相對較高，而突變型Wx-A1b和Wx-D1b的頻率較低。徐兆華等[12]和杜小燕等[13]的分析結果表明，我國小麥種質資源中Wx蛋白亞基類型主要以單亞基缺失為主，并且主要為Wx-B1缺失類型，兼有Wx-A1和Wx-B1缺失類型。這一結論與寧夏春小麥Wx蛋白亞基的鑒定結果比較一致。

何中虎[14]和劉建軍等[15]研究表明，中國小麥品種中Wx-B1蛋白缺失的頻率較高，缺失Wx-B1亞基的小麥品種面粉除了表現出直鏈淀粉較低的特點，而且面粉的高峰粘度大、膨脹勢高、用該類型面粉制作加工的面條品質優良。因此，Wx-B1缺失常作為優質面條小麥品種選育的生化指標。299個寧夏春小麥種質資源中，突變型Wx-B1b頻率的較高，占參試材料總數的10.7%，其中地方品種占0.3%，引進品種占0.7%，審定品種占1.3%，自育高代品系占9.0%。說明通過小麥育種選擇，新品種和高代品系中Wx-B1b類型逐步增加。原因可能是：一方面寧夏春小麥種質資源中通過引進和不斷培育優質種質資源，使得該亞基類型的分布頻率逐漸增加；另一方面人們對品質改良的重視程度在逐漸增加，育種目標除了重視傳統產量及抗性之外，開始兼顧品質 改良。

寧夏引黃灌區主要生產優質硬紅春小麥，面條品質改良是小麥育種的主攻目標。不同Wx蛋白亞基缺失降低小麥直鏈淀粉含量，導致淀粉糊化和膨脹特性的改變，影響面條品質。部分糯質小麥淀粉特性表現出的糊化粘度、稀懈值和膨脹勢特征也各不相同，需要進一步篩選或者培育出最適宜用于制做中國面條的種質資源。因此，在今后育種中，應該重視小麥優質亞基和品質相關性的基礎理論研究、同時在傳統育種工作中引入分子生物學手段，提高優質基因或亞基的篩選效率，從而加速優質面條小麥品種選育的工作。