不同殺菌劑對小麥真菌毒素污染防控及農藥殘留風險評估分析

吳 麗，孫 娟,2，張慧杰，胡學旭，李為喜，孫麗娟，張 妍，杜文明，王步軍

(1.中國農業科學院作物科學研究所/農業農村部谷物產品質量安全風險評估實驗室(北京)，北京 100081; 2.北京市水產技術推廣站/農業農村部漁業產品質量監督檢驗測試中心(北京)，北京 100170)

小麥赤霉病(Fusarium head blight，簡稱FHB或Scab)是由鐮孢菌屬(Fusariumspecies)病菌引起的一種典型的氣候型、世界性病害，以溫暖潮濕和半潮濕地區較重，是危害小麥生產的主要病害之一。赤霉病菌侵染小麥后，不僅會嚴重影響其產量與品質，其產生的多種真菌毒素進入食物鏈還可嚴重危害牲畜與人類健康。我國小麥赤霉病主要發生于濕潤多雨的長江流域和沿海麥區。小麥在不同生育期都可能感染赤霉病，抽穗揚花期是最易感病期，若此時遇陰雨天氣，極易造成赤霉病大流行,可造成小麥減產10%～20%，嚴重時減產達80%～90%[1]。赤霉菌產生的常見真菌毒素包括單端孢霉烯族化合物(trichothecenes)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、伏馬毒素(fumonisins，FB)等[2]；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是在小麥中污染水平最高的一種倍半萜類化合物，可在食物鏈中長期存留，對人類和牲畜的健康造成極大威脅[3-4]。因而赤霉病成為制約我國乃至世界小麥安全生產的重要因素之一。目前，生產上具有赤霉病抗性的小麥品種較少，施用化學殺菌劑仍是防控小麥赤霉病最有效和最常用的方法。我國用于防治小麥赤霉病的藥劑主要有多菌靈、氰烯菌酯、咪鮮胺和甲基托布津、三唑醇、嘧菌酯等殺菌劑及其復合劑[5-7]。合理使用殺菌劑可有效抑制小麥赤霉病的發生，對發病較為嚴重的地區需要多次噴藥以控制赤霉病，抑制其產生的真菌毒素污染糧食。但殺菌劑過量使用會造成其在小麥中殘留量過大，即防治毒素污染的同時會帶來農藥殘留的潛在威脅，兩者均為小麥安全生產中的關鍵危害因子。本研究擬通過噴施不同類型殺菌劑及施藥次數探索其對小麥籽粒中真菌毒素污染的防控效果及其殘留風險，旨在尋求小麥赤霉病化學防控的平衡點，達到既能有效防治小麥赤霉病毒素污染又能盡可能減少農藥殘留的目的，為我國小麥安全生產及食品安全提供決策依據。

1 材料與方法

1.1 田間試驗

1.1.1 試驗藥劑

供試藥劑：50%多菌靈WP(可濕性粉劑)生產于江蘇藍豐生物化工股份有限公司；25%氰烯菌酯SC(懸浮劑)生產于江蘇省農藥研究所股份有限公司；25%咪鮮胺EC(乳油)，江西正邦作物保護有限公司；70%甲基托布津WP，生產于上海悅聯化工有限公司。

1.1.2 試驗設計

試驗田分別位于小麥赤霉病發生較為嚴重的河南省信陽市和湖北省襄陽市兩地，試驗點土壤肥力中等且基本一致。供試小麥品種為揚麥16和揚麥20(中感赤霉病品種)，采取直播方式，于2016、2017年連續兩年開展試驗。

使用電動噴霧器噴施殺菌劑，第一次噴藥時間為小麥抽穗后揚花率達10%時，隔5 d噴第二次，第三和第四次每隔7 d噴藥一次。每種藥劑分別噴施1～4次。隨機區組設計，每個處理設三個重復，并設立保護隔離行。以等量清水噴霧作為對照(CK)，兌水量為15～20 L·hm-2,50%多菌靈WP、25%氰烯菌酯SC、25%咪鮮胺EC及70%甲基托布津WP 4種藥劑的用藥量分別為 1.5 kg·hm-2、2.25 L·hm-2、0.9 L·hm-2及 1.5 kg·hm-2。

1.1.3 調查內容與方法

每年六月初待小麥成熟后，各小區分別采取五點對角線方式取樣(各點取樣面積為10 m2)，脫粒，經晾曬混勻后低溫保存，測定小麥籽粒DON與殺菌劑殘留量。

1.2 測定方法

1.2.1 小麥中殺菌劑殘留量檢測

稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中,加10 mL純凈水，30 min后加入10 mL乙腈(色譜級，美國Fisher公司)，振蕩30 min；加入QuEChERS提取鹽包(Part No:5982-0650,美國安捷倫)，用力振搖2 min，8 000 r·min-1離心5 min；轉移8 mL上清液于QuEChERS凈化管，振搖2 min，8 000 r·min-1離心5 min；取2 mL凈化液于50 ℃水浴中氮吹至近干,以甲醇-水(1∶1,v∶v)溶解,混勻并定容至1 mL；過0.22 μm MICRO PES聚醚砜膜，濾液待測。

儀器條件：超高效液相色譜-串聯四級桿質譜(UPLC-XEVO TQ,美國Waters公司),配有電噴霧離子源，液相色譜的色譜柱為ACQUITY BEH C18柱(50 mm × 2.1 mm,粒徑1.7 μm)， 流速為300 μL· min-1，柱溫為26 ℃,進樣體積為5 μL。流動相A為甲醇,流動相B為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序為0～5.5 min,20%～85% A; 5.5～5.8 min,85%～100% A; 5.8～6.0 min,100%～20% A; 6.0 min,20% A,平衡2 min。

質譜分析中，應用電噴霧離子源(ESI+)、多反應監測(MRM)模式，毛細管電壓2.50 kV，離子源溫度110 ℃，去溶劑氣流量1 000 L·h-1，去溶劑氣溫度500 ℃。其他質譜采集參數見表1。

1.2.2 小麥中DON含量檢測

參照課題組已建立方法對DON進行測定[8]。DON標準品購買于美國Sigma公司，用甲醇配制成適當濃度的母液后置于-20 ℃保存。稱取2.00 g樣品于50 mL離心管中,加入80%乙腈-水溶液50 mL,180 r·min-1均質3 min后，8 000 r·min-1離心5 min；上清液用MycoSep 226多功能凈化柱(Romer，美國)凈化； 取4 mL凈化液于50 ℃水浴中氮吹至近干；以甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨(1∶1,v∶v)溶解,混勻并定容至1 mL；過0.22 μm MICROPES聚醚砜膜(德國Membrana公司),待測。

儀器條件：液相色譜的色譜柱為CORTECS C18(100×2.1 mm,1.6 μm),流速為200 μL· min-1,柱溫為40 ℃,進樣體積為2 μL。流動相A為甲醇,流動相B為0.5%甲酸水溶液。梯度洗脫程序為0～3.5 min,5%～85% A; 3.5～4.5 min,85%～100% A; 4.5～5.0 min,100%～5% A; 5.0 min,5% A,平衡2 min。

質譜分析中，應用電噴霧離子源(ESI+); 多反應監測(MRM)模式采集; 毛細管電壓2.50 kV; 離子源溫度110 ℃,去溶劑氣流量800 L·h-1; 去溶劑氣溫度450 ℃。

2 結果與分析

2.1 不同殺菌劑對真菌毒素DON的防控效果

由圖1可知，在對照處理下，信陽地區小麥中DON含量高達3 150 μg·kg-1，顯著高于襄陽地區的污染水平(2 150 μg·kg-1)，表明兩地區赤霉病的流行程度不同，但DON污染水平均超過國家限量值(500 μg·kg-1)。多次噴施四種殺菌劑均能顯著降低小麥籽粒中DON累積量(P< 0.05)。其中多菌靈對DON的防控具有兩面性，噴施50%多菌靈可濕性粉劑1次，小麥籽粒中DON的含量較對照增加18%(信陽)、7%(襄陽)；噴施2～4次，籽粒中DON含量顯著降低，噴施2次為對照的55.3%(信陽)、64.5%(襄陽)；用藥3次，為對照的24.0%(信陽)、29.2%(襄陽)；噴施4次，小麥籽粒中DON含量均較施藥3次降低，其中信陽地區差別不大，而襄陽地區具有顯著差異。

表1 農藥和真菌毒素 UPLC-MS/MS測定參數Table 1 UPLC-MS/MS acquisition parameters for determination of pesticides and mycotoxins

25%咪鮮胺噴施1次后兩地小麥中DON均有降低，其中信陽地區小麥中DON含量未呈現顯著性降低，而襄陽地區小麥DON含量降低顯著(P<0.05)；用藥3次后籽粒中DON含量較對照均顯著降低，較對照降低了55.1%～64.0%，繼續增加施藥次數，DON含量保持穩定。25%氰烯菌酯懸浮劑噴施1～4次，小麥籽粒中DON含量降至對照的42%～58%、29%～49%、 12%～21%及6%～10%，各處理間差異均顯著，對DON的防控效果可達90%～94%。70%甲基托布津WP對籽粒中DON含量的影響與25%氰烯菌酯SC一致，施藥1次籽粒中DON含量較對照顯著降低，降至對照的37%～72%(信陽地區小麥中DON污染較為嚴重)，施藥4次DON降至對照6%～12%。噴施以上4種殺菌劑3次后，信陽地區除25%咪鮮胺外，其他3種藥劑均能使小麥籽粒中DON的污染水平降至安全限量值 以下。

2.2 噴藥次數對小麥籽粒中殺菌劑殘留量的影響

根據GB 2763-2019《食品安全標準 食品中農藥最大殘留限量》，小麥中多菌靈、咪鮮胺及甲基托布津的安全限量值均為500 μg·kg-1，氰烯菌酯的臨時限量值為50 μg·kg-1。由圖2可知，隨著施藥次數的增加，小麥中4種殺菌劑殘留量均不斷升高，其中以多菌靈殘留量最大。多菌靈用藥4次后，信陽、襄陽兩地小麥籽粒中的殘留量分別為502.54 μg·kg-1、547.38 μg·kg-1，均超過限量值。

甲基托布津、咪鮮胺與氰烯菌酯在兩地區使用后的小麥籽粒中殘留量均較小，噴施4次后，甲基托布津的殘留量約60 μg·kg-1，氰烯菌酯的殘留量約30 μg·kg-1，而咪鮮胺殘留水平低于5 μg·kg-1。表明這三種殺菌劑的殘留量對小麥安全生產影響較小。

2.3 DON含量與殺菌劑殘留量的相關性分析

由表2可知，信陽地區小麥籽粒中4種殺菌劑的殘留量與DON含量均呈顯著負相關(P< 0.05)，以咪鮮胺殘留量與毒素DON含量負相關性最強。襄陽地區小麥籽粒中除氰烯菌酯外的3種殺菌劑殘留量與DON含量相關性不顯著。對兩地區小麥籽粒中殺菌劑殘留量與所噴施農藥次數進行相關性，結果(表3)發現，信陽地區4種農藥的施藥次數與其殘留量均呈現顯著正相關 (P<0.05)，相關系數為0.932～0.947；襄陽地區咪鮮胺的施藥次數與其殘留量呈現顯著正相關 (P<0.05)，氰烯菌酯、甲基托布津殘留量與噴施農藥次數呈現極顯著正相關(P<0.01)，相關系數為0.963與 0.913。

表2 小麥籽粒中殺菌劑藥殘留量與DON含量相關性分析Table 2 Correlation analysis of pesticide residues and DON levels of wheat grain

表3 小麥籽粒中殺菌劑殘留量與施藥次數相關性分析Table 3 Correlation analysis of spray time of 4 kinds of bactericides and pesticide residue amount

3 討 論

本研究中，未采取防控措施時，信陽、襄陽兩地小麥籽粒中DON的污染程度均超過國家限量值，說明在這兩個地區小麥揚花至成熟期，如不采取恰當的防控措施會嚴重影響小麥安全生產。兩地區小麥中DON污染水平有較大差異，信陽地區的污染程度較為嚴重，可能與流行菌的種類及當地氣候環境(如在揚花灌漿期的降水量)、作物輪作方式、前茬作物秸稈處理方式以及小麥品種等有關[9]。前人研究發現，揚花期雨水較多會加重小麥赤霉病的發生，此外，玉米-小麥輪作也會加重赤霉病的發生[10-11]。四種殺菌劑能夠不同程度降低小麥中DON的污染，其中，施用25%多菌靈對DON的防控效果表現出兩面性，在兩地施用1次后小麥籽粒中DON 的污染量均高于對照，這可能由于感病菌對多菌靈有一定抗藥性，DON作為其次生代謝產物，在其生長過程中受到脅迫刺激而分泌出更高水平的DON毒素。已有大量研究表明，多菌靈對小麥赤霉病的防控效果逐年下降，鐮刀菌會對其產生一定程度的抗藥性[12-14]，如吳佳文等[13]研究發現，2018年江蘇省部分縣(市、區)分離自小麥穗部的赤霉病菌抗藥菌株頻率為53.18%，其中淮安市寶應湖農場抗藥頻率高達90.00%，徐州市豐縣頻率最低，為27.50%，縣域差異達3.27倍；陳宏州等[14]研究結果表明，江蘇省小麥赤霉病菌對多菌靈的抗性頻率高達50.58%。成曉松等[15]的研究表明，咪鮮胺、氯啶·戊唑醇、戊唑·咪鮮胺、氰烯菌酯·戊唑醇4種藥劑對小麥赤霉病有良好的防控效果，防效均在 80%以上，可作為替代多菌靈防治小麥赤霉病，并指出最佳用藥時間為揚花初期，最佳防治間隔為5～7 d。本研究中，噴施2次后，多菌靈與咪鮮胺處理的小麥籽粒中DON含量較氰烯菌酯與甲基托布津處理小麥中DON含量高，以氰烯菌酯的防控效果最佳，施藥3次對小麥中DON的防控效果可達78.7%～87.1%。姚克兵等[16]的研究表明，在江淮赤霉病重發區，采用25%的氰烯菌酯懸浮劑在小麥揚花10%及揚花100%各施藥1次(共2次)與抽穗后揚花前、揚花10%及揚花100%各施藥1次(共3次)的處理均能有效防控小麥赤霉病，防控效果達到80%以上。因而在小麥生產中，尤其是江蘇、安徽等小麥赤霉病發病嚴重地區，當赤霉病菌對多菌靈抗藥性頻率較高時，建議用新型高效殺菌劑以有效防控小麥赤霉病。

噴施殺菌劑可有效防控小麥赤霉病等病害的發生、降低真菌毒素的污染，然而殺菌劑又會帶來小麥中殺菌劑殘留的安全隱患。本研究發現，4種殺菌劑于小麥揚花期噴施2次的小麥籽粒中多菌靈殘留含量最高，且超過國家糧食安全限量值，其他3種殺菌劑殘留均沒超過國家糧食安全限量值。刁春友等[17]在小麥抽穗揚花期使用多菌靈、氰烯菌酯等11種當前生產上推廣應用的藥劑，施藥2次的小麥籽粒中僅發現多菌靈、氟環唑、甲基硫菌靈3種農藥，其余農藥基本檢測不到。這與本研究結論一致。氰稀菌酯(JS399-19)作為一種新型合成化合物,對鐮孢菌具有較高的專化活性，殺菌活性高，不僅可以有效降低小麥籽粒中DON毒素含量，且在籽粒中殘留較少[18]。表明氰烯菌酯對小麥赤霉病的防控效果最佳。

研究發現，兩地區4種殺菌劑噴施次數與其在小麥籽粒中的殘留量呈現正相關關系，而殺菌劑殘留量與DON的污染程度呈現不同程度的負相關性。信陽地區4種殺菌劑在籽粒中的殘留量與DON含量均呈現顯著負相關關系(P<0.05)，襄陽地區小麥籽粒中有3種殺菌劑殘留量與DON含量相關性不顯著。出現這種情況的原因可能與不同地區的溫度、濕度及栽培耕作制度及發病菌種等相關[19-21]：(1)小麥生長環境條件，如溫度、濕度及輪作方式，或者后期采收儲運過程，均會影響毒素的累積水平，從而導致不同地區小麥中毒素的含量差異較大，與農殘含量的相關性不太一致；(2)毒素的累積水平與真菌的產毒能力有關，不同地區流行的赤霉病菌種可能不同，因而即使小麥赤霉病發病程度相似，但毒素的累積水平仍能表現出較大差異。整體而言，殺菌劑的使用次數即殺菌劑使用量與DON的防控效果呈現正相關關系，但是過多使用殺菌劑尤其是多菌靈又會造成其殘留超標問題，因而如何正確把小麥真菌毒素污染防控與殺菌劑殘留風險控制在一個安全有效的平衡點在小麥安全生產中至關重要。本研究中，4種殺菌劑施藥2～3次后對DON的防控可達到安全范圍內，繼續增加施藥次數對DON防控效果沒有顯著增加。在實際生產中，要根據小麥赤霉病的發病程度合理施用殺菌劑，在保證對赤霉病有效防控的基礎上盡量減少用量以保證小麥的安全生產。

4 結 論

50%多菌靈WP、25%氰烯菌酯SC、25%咪鮮胺EC、70%甲基托布津WP 4種不同類型的殺菌劑對小麥赤霉病均有一定的防治效果，隨著施藥次數的增加， 小麥籽粒中DON含量呈下降趨勢。在4種殺菌劑中，氰烯菌酯對DON的防控效果最佳且殘留水平較低；多菌靈對DON的防控效果較低且殘留量最大。