HPLC法測定清心蓮子飲中京尼平苷酸的含量*

陳忠新，茍鑫宇，牟景龍，解 穎，李 強

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱150040；2.哈爾濱維科生物技術開發公司，黑龍江 哈爾濱150069）

清心蓮子飲是國家發布的第一批《經典名方目錄》方藥之一，來源于《太平惠民和劑局方》，具有清心火，益氣陰，交心腎、清熱利濕、益氣扶正、生津、收斂浮陽之功效[1]。主治：小便白濁，便赤如血，口舌干燥漸成消渴，男子五淋，婦人帶下赤白及病后氣不收斂，五心煩熱?，F今臨床仍廣泛應用，多用于治療腎臟疾病及尿路感染等[2-4]。

該方由九味中藥組成，其中車前子清熱利濕為方中臣藥，其有效成分環烯醚萜類京尼平苷酸具有抗炎作用[5,6]。本研究以京尼平苷酸為指標性成分，采用HPLC測定其含量，為清心蓮子飲的后續研究及應用奠定了基礎。

1 儀器、試藥及藥材

1.1 儀器

ThermoU3000型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）;AB204-N型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;KQ-500D型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）;GLZY-0.5B型真空冷凍干燥機（上海浦東冷凍干燥設備有限公司）。

1.2 試藥及藥材

購自中檢所的京尼平苷酸對照品（批號：111828-201403）；色譜甲醇采購于迪馬科技有限公司；甲醇、HAc等分析純試劑均購自天津天大化學試劑有限公司；方中九味藥材均為道地藥材，其中車前子購自河北省滄州市。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

選用Elite HPLC C18（4.6×25mm，5μm）色譜柱，以甲醇-0.5% HAc（體積比5→32∶95→68）為流動相進行梯度洗脫，將檢測波長設定為254nm，柱溫采用30℃，流速設置為1.0mL·min-1。

2.2 供試品溶液的制備

按《太平惠民和劑局方》記載，稱取蓮子30g、黃芩20g、車前子20g、茯苓30g、麥冬20g、地骨皮20g、炙黃芪30g、人參30g、炙甘草20g。混和粉碎過篩并混勻，稱取粗粉12g，加麥冬3g，300mL水煎煮兩次，每次1h，得240mL標準煎液。制備成凍干粉，備用。精取凍干粉0.22g，用20mL 60%甲醇超聲溶解20min，濾過，蒸干，甲醇定容至10mL容量瓶中，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取京尼平苷酸對照品4.5mg，甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中，制成濃度為0.09mg·mL-1的標準品溶液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備

稱取處方中除車前子外的其他八味藥材，按2.2項下方法制備成陰性對照樣品溶液。

2.5 專屬性考察

按2.1項下色譜條件，取對照品溶液、供試品溶液以及陰性對照液，進行色譜測定，結果在246nm條件下，對照品溶液及供試品溶液在相同的保留時間呈現一致的特征峰，而陰性樣品溶液無對應色譜峰，因此說明，陰性對照樣品對京尼平苷酸的測定無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 對照品、供試品及陰性對照色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard,test sample and negative control

2.6 線性關系考察

精密吸取2.3項下京尼平苷酸標準品溶液各2、4、6、8、10μL，注入高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進行測定。以含量為X軸，峰面積比值為Y軸進行線性回歸，得標準曲線回歸方程為Y=11.185X+0.065，R2=0.9999。結果表明京尼平苷酸含量在0.18～0.90μg之間線性關系良好。

2.7 精密度考察

取2.2項下供試品溶液，按2.1項下色譜條件，連續重復進樣測定6次，每次10μL，計算京尼平苷酸峰面積的RSD值為0.76%（RSD＜3%），表明儀器精密度良好。

2.8 重復性考察

分別量取2.2項下各凍干粉0.22g按后續方法進行處理，制成6份供試品溶液，各進樣10μL，測得京尼平苷酸平均值為4.8025mg·劑-1，RSD值為2.65%（RSD＜3%），表明方法重復性良好。

2.9 穩定性考察

取配制好的同一供試品溶液，在0、2、4、6、8、10、12h各進樣10μL，測得京尼平苷酸峰面積RSD值為2.59%（RSD＜3%），表明樣品在配制完成后的12h內基本穩定。

2.10 加樣回收率試驗

精密稱取2.2項下制備的6份清心蓮子飲凍干粉各0.11g，分別加入0.14mg·mL-1的京尼平苷酸標準品溶液各1mL，制備成供試品溶液，測定條件參照2.1項，每次進樣量同上，計算回收率，結果符合加樣回收率要求，見表1。

2.11 樣品含量測定

分別取不同批次的清心蓮子飲凍干粉各0.22g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液。分別取10μL注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，計算京尼平苷酸含量。3批樣品京尼平苷酸含量分別為4.8244、4.8770和5.0073mg·劑-1，考慮到實驗誤差的存在，各基準物質含量略有差異，在合理的波動范圍之間。

3 結論

清心蓮子飲化學成分復雜，車前子為方中臣藥，京尼平苷酸為車前子的主要有效成分。本實驗建立了一種高效液相色譜方法，并對實驗方法進行了方法學考察，并用該方法對3個平行批次樣品中該指標性成分的含量進行了測定，結果表明，本實驗方法比較成熟，科學合理，穩定可靠，重復性好，在線性范圍內具有良好的靈敏度和加樣回收率，為清心蓮子飲有效成分的含量測定、質量控制以及臨床的合理應用提供了實驗依據和理論支持。