龍眼組蛋白去乙酰化酶基因DlHDT1的克隆與特性分析

李曉斐，張舒婷，蔣夢琦，申 序，霍 雯，林玉玲，賴鐘雄

(福建農林大學 園藝植物生物工程研究所，福州 350002)

組蛋白乙酰化和去乙酰化修飾在真核生物中廣泛存在，是調控染色質的結構和基因表達的一種重要的組蛋白翻譯后修飾方式。乙酰化修飾主要發生在組蛋白N末端的賴氨酸殘基上，由組蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferase,HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)共同調控其動態平衡。HDAC可與其他蛋白形成多亞基阻遏復合物，去除核心組蛋白N端的乙酰基團，從而使染色質發生凝集作用，達到抑制基因轉錄表達的目的[1]。植物中HDAC可劃分為RPD3/HDA1、SIR2和HD2三個亞家族。最早HD2蛋白是從玉米中鑒定出來并分離純化[2]，是植物中特有的一種酸性核磷酸化蛋白，在動物和真菌中均未發現這種酶的存在，其結構不同于RPD3/HDA1和SIR2家族，但是在序列上均與肽酰脯氨酰順反異構酶同源[3]，因此在植物中該蛋白具有很高的研究價值。目前HD2基因在調控植物生長發育、抗逆境脅迫等方面的功能均有報道。如研究發現巴西橡膠樹HbHDT1基因可能參與其體細胞胚發生[4]；水稻OsHDT702通過參與細胞分裂或增殖調節植株的葉片寬度[5]；擬南芥HDT1和HDT2通過調控miR165/166表達水平來調控葉片極性[6]；且研究發現HD2在擬南芥合子胚及體細胞胚發生過程中發揮重要作用[7]。HD2不僅調控植物生長發育過程，在激素應答、抗逆境脅迫等方面也發揮重要作用。如擬南芥中，HD2C與HDA6發生互作，并通過組蛋白修飾調節基因表達，進而影響植株對ABA和NaCl的敏感性[8]；過表達AtHD2D的轉基因植株對干旱、鹽和寒冷等非生物脅迫表現出更高的耐受性[9]；小麥中HD2基因在挑旗期和抽穗期的熱脅迫響應過程發揮重要作用[10]。

龍眼(DimocarpuslonganLour.)是無患子科(Sapindaceae)龍眼屬(Dimocarpus)亞熱帶名貴果樹，在中國主要分布于福建、臺灣、廣西、廣東、四川、貴州、云南等省區，與荔枝、香蕉、菠蘿同為“華南四大珍果”。龍眼胚胎發育狀況嚴重影響果實產量及品質[11]，自然條件下，合子胚取樣困難等因素限制了對龍眼胚胎發育的研究，而龍眼體胚發生體系的建立是對龍眼生理生化及開展分子機制研究的理想模型[12]。本研究結合前期對龍眼HD2亞家族2個基因DlHDT1和DlHDT3在龍眼體胚發生過程和激素脅迫響應的表達模式鑒定[13]，篩選出最有可能參與龍眼體胚與非生物脅迫響應的組蛋白去乙酰化酶基因為DlHDT1，因此，將DlHDT1作為本研究的目的基因，對其進行全長克隆驗證、系統發育樹構建、蛋白互作網絡預測、非胚性及胚性培養物中的轉錄組數據分析、亞細胞定位，并對其表達模式進行分析，以期為研究龍眼胚胎發育過程中DlHDT1的調控機制提供新的線索。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗以福建農林大學園藝植物生物工程研究所長期繼代保存的‘紅核子’龍眼胚性愈傷組織(embryonic callus,EC)為起始材料[14]，參照賴鐘雄[15]的培養方法，在MS培養基上分別添加0.1和0.5 mg·L-12,4-D，黑暗條件培養20 d，EC分別分化為不完全胚性緊實結構(incomplete compact pro-embryogenic,ICpEC)及球形胚(Globular embryos,GE)。

每瓶接種0.2 g龍眼EC，用不同濃度(0、25、50、100 mmol·L-1)NaCl處理，置于25 ℃、110 r/min、黑暗條件下搖床培養24 h；同時，采用10%聚乙二醇(PEG6000)滲透調節劑模擬干旱脅迫處理，置于25 ℃、110 r/min、黑暗條件下搖床培養0、4、8 和12 h，分別收樣液氮冷凍，置于-80 ℃備用。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及cDNA逆轉錄按照Transzol up試劑盒說明書(全式金，中國)分別提取龍眼EC、ICpEC、GE階段及NaCl和PEG6000處理的RNA，取EC、ICpEC、GE階段的RNA各取1 μL混

合，然后采用TransScript?Ⅱ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR試劑盒(全式金，中國)逆轉錄為cDNA供克隆使用；采用Hifair?Ⅱ 1st Stand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR逆轉錄試劑盒(翊圣，中國)進行NaCl和PEG6000處理下的cDNA合成供qRT-qPCR使用。

1.2.2DlHDT1基因CDS全長序列的獲得與驗證選取擬南芥HD2氨基酸序列，經龍眼基因組數據庫(NCBI 登錄號為PRJNA305337)同源比對，篩選注釋共獲取5條DlHD2候選序列(Dlo_031412.1、Dlo_030193.1、Dlo_023309.2、Dlo_026619.1、Dlo_000805.1)。采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件對候選序列進行鑒定，篩選出具有完整保守結構域的成員共2條(Dlo_031412.1和Dlo_030193.1)；采用NCBI Blast同源比對參照其他物種的共同命名方法，將DlHD2成員分別命名為DlHDT1和DlHDT3[13]，通過前期的數據分析選擇對DlHDT1進行全長驗證以及后續分析。

利用DNAMAN軟件在CDS序列兩端設計特異性引物(表1)，將引物序列送至福州尚亞生物技術有限公司合成。以1.2.1中逆轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增，擴增體系為25 μL：2×Trans-

Start?FastPfu PCR SuperMix(-dye) 12.5 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸51 s，34個循環；72℃延伸5 min。將獲得的PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測目的片段，利用GeneJET Plasmid Miniprep Kit試劑盒(賽默飛世爾科技，美國)進行目的片段的回收。將膠回收產物與Bzero載體進行連接，并轉化到Trans1-T1感受態細胞(全式金，中國)，過夜培養進行菌液PCR驗證后，挑選陽性克隆子送至上海博尚生物技術有限公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析采用ExPASy (https://www.expasy.org/)對DlHDT1氨基酸序列進行蛋白基本理化性質預測；采用WOLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/) 進行亞細胞定位預測；采用Plantcare(http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ html/)預測啟動子順式作用元件；采用SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測N端信號肽；采用NetPhos3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/ services/ NetPhos/)預測蛋白磷酸化位點；采用EMBnet TMpred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)預測蛋白跨膜結構域；采用MEME(Multiple expectation maximization for motif elicitafion)預測保守基序(motif)，然后在TBtools中進行可視化。

1.2.4 系統進化樹構建利用NCBI對DlHDT1的蛋白序列進行blast分析，下載包含龍眼在內的19種親緣關系較近植物的HDT1蛋白序列，在MEGA7.0軟件進行多序列比對，采用鄰近法(neighbor-joining method)進行系統進化樹構建，Bootstrap設置1 000次重復，其它參數為默認值，利用在線工具iTOL(https://itol.embl.de/upload.cgi)對其進行美化。

1.2.5 DlHDT1蛋白互作調控網絡預測分析參考擬南芥基因互作網絡利用在線軟件STRING(https://string-db.org)選擇k均值聚類算法進行聚類分析，最低互動評分設置為medium confidence(0.400)，預測DlHDT1與其他蛋白之間的互作關系。

1.2.6 蛋白亞細胞定位根據Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit試劑盒(諾唯贊，中國)引物設計方法，分別設計帶有線性化1302表達載體末端15 bp同源序列的上下游特異性引物DlHDT1-1302-F和DlHDT1-1302-R(表1)，通過PCR擴增目的基因，并進行瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶。利用限制性內切酶BglⅡ和BcuⅠ對1302載體進行雙酶切，然后參照Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit方法對目的片段和線性化1302載體進行重組，將重組產物轉化大腸肝菌Trans-T1，活化后涂布于含有卡那抗生素(50 mg·L-1)的LB培養基上，培養并篩選單克隆進行菌液PCR，測序正確后提取pCAMBIA1302-DlHDT1-GFP重組質粒，采用凍融法將pCAMBIA1302-35S-GFP空載及重組質粒轉入農桿菌，用農桿菌介導法侵染洋蔥內表皮并進行DlHDT1蛋白亞細胞定位觀察。

表1 引物序列Table 1 List of primers used

1.2.7DlHDT1基因在龍眼體胚發生過程及脅迫處理下的表達模式分析結合轉錄組數據分析‘紅核子’龍眼在非胚性培養物(NEC)和胚性培養物(EC、ICpEC和GE)階段的FPKM值(SRA:PRJNA565345)；利用DNAMAN對DlHDT1序列進行qRT-PCR特異性引物設計(表1)，分別以ACTB和UBQ為PEG6000和NaCl處理下的內參基因[16]，使用LightCycler480儀器進行qRT-PCR檢測，用2-ΔΔCt法計算DlHDT1的相對表達量，然后采用SPSS軟件進行差異顯著性分析(P<0.05)，最后用Excel和Graphpad數據處理及制圖。

2 結果與分析

2.1 龍眼DlHDT1基因CDS序列克隆及生物信息學分析

以DlHDT1-F和DlHDT1-R為上下游引物，用RT-PCR 技術擴增得到918 bp目的片段(圖1)，其編碼305個氨基酸；利用克隆得到的DlHDT1的CDS序列與DlHDT1(Dlo_030193.1)基因組序列進行多序列比對，相似性為99.78%，說明成功克隆獲得DlHDT1基因。

利用ExPASy在線軟件對DlHDT1編碼蛋白質的基本理化性質進行分析，結果顯示該蛋白為不穩定親水性蛋白，不穩定系數為43.99，親水性為-1.035，氨基酸個數為305 aa，等電點為4.65，相對分子質量為32 585.54 Da。亞細胞定位預測顯示定位于細胞核中。SignalP預測顯示該蛋白不含信號肽，不屬于分泌蛋白。蛋白跨膜結構預測顯示該蛋白無跨膜結構，不屬于跨膜蛋白。該蛋白磷酸化修飾位點預測顯示共有43個磷酸化位點，其中絲氨酸(Ser)修飾位點有23個，蘇氨酸(Thr)修飾位點8個，酪氨酸(Tyr)修飾位點1個。

2.2 HDT1蛋白系統進化樹構建及motif分析

利用NCBI BLAST對龍眼HDT1的氨基酸序列進行blast比對，結果顯示該蛋白與漾濞槭、開心果、甜橙、克里曼丁橘相似度較高，分別為78.76%、70.87%、69.97%、69.9%，說明HDT1在進化中保守性較高。選擇并下載與DlHDT1相似度較高的18種植物的氨基酸序列，利用MEGA7軟件進行系統進化樹的構建，結果顯示(圖2)，HDT1蛋白主要分為3個分支，不同分支的HDT1可能具有不同的起源。

M.DNA marker圖1 DlHDT1基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification result of DlHDT1 gene

對該系統進化樹中不同物種蛋白質的保守基序(motif) 進行分析，結果(圖2)顯示，所有物種都有motif 1、motif 5、motif 6、motif 8、motif 9 這5個保守基序；此外，發現親緣關系相近的植物基序結構相似度較高，如龍眼與漾濞槭處于同一分支，二者均含motif 20；克里曼丁橘和甜橙處于同一分支，二者均含motif 13；說明與DlHDT1親緣關系相近的物種結構具有相似性，進一步推測其功能也可能相近。

圖2 龍眼與其他植物的HDT1系統進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of HDT1 in longan and other plants

2.3 龍眼DlHDT1基因啟動子順式作用元件分析

提取DlHDT1基因起始密碼子ATG上游2 000 bp區域，采用Plantcare對啟動子順式作用元件分析結果表明(圖3)：該基因啟動子除了含有CAAT-box和TATA-box必需元件外，還有光響應元件9個，茉莉酸甲酯響應元件4個，厭氧誘導響應元件3個，脫落酸、赤霉素、生長素、低溫、干旱、缺氧特異性、胚乳發育響應元件均各為1個。

A.光;B.茉莉酸甲酯;C.厭氧;D.生長素;E.干旱;F.胚乳;G.赤霉素;H.脫落酸;I.低溫;J.富含AT的DNA結合蛋白圖3 DlHDT1啟動子順式作用元件分布A.Light;B.MeJA;C.Anaerobic;D.Auxin;E.Drought;F.Endosperm;G.Gibberellin;H.Abscisic acid;I.Low temperature;J.ATBP-1 binding siteFig.3 Promoter cis-acting element distribution of DlHDT1

2.4 龍眼DlHDT1蛋白互作調控網絡分析

String數據庫是基于試驗數據、文本挖掘以及生信分析(基因臨近、融合、共表達、同源性)進行評分，預測蛋白間互作情況。本研究以擬南芥蛋白數據庫為參考，利用String預測DlHDT1蛋白與其他蛋白間的互作調控網絡。

聚類預測顯示(圖4)，DlHDT1[AtHDT2(AtHD2B)]蛋白與其他蛋白存在互作關系并形成2個分支，第一支與HD1蛋白發生互作，HD1與HDT1均屬于組蛋白去乙酰化酶蛋白；第二支與HDA3、FIB2、NOP56、RPS6A、NUC-L1發生互作，這些蛋白主要與RNA加工、DNA復制、細胞分裂、蛋白質合成、細胞增殖等功能相關。說明DlHDT1蛋白除與自身家族成員發生互作外，還可以與其他蛋白發生互作，預測與DlHDT1蛋白互作關系較強的蛋白可能與其具有功能相關性。

圖4 以擬南芥為參考構建DlHDT1蛋白互作網絡Fig.4 Interaction network of DlHDT1 proteins based on Arabidopsis thaliana association model

2.5 龍眼 DlHDT1蛋白的亞細胞定位

WoLF PSORT在線網站對DlHDT1蛋白亞細胞定位預測結果顯示該蛋白定位在細胞核，與擬南芥中的定位結果一致[7]，這一定位結果與組蛋白去乙酰化酶能夠在組蛋白末端的賴氨酸殘基上發揮脫乙酰化修飾的作用相關。將構建好含有DlHDT1與GFP 融合蛋白載體的農桿菌注射到洋蔥內表皮，將其置于28 ℃的暗培養箱培養48 h，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP的定位情況。結果顯示：在導入pCAMBIA1302-GFP空載的洋蔥表皮細胞，GFP熒光幾乎充斥整個細胞中(圖5，D-F)；而導入含目的基因DlHDT1融合蛋白的洋蔥表皮細胞，僅在細胞核中呈現明顯的綠色熒光信號(圖5，A-C)，進而驗證了DlHDT1蛋白定位于細胞核。

2.6 龍眼DlHDT1在體胚發生過程及干旱和鹽脅迫處理下的表達模式

2.6.1DlHDT1在龍眼體胚發生過程的FPKM值分析龍眼體胚發生過程的轉錄組數據結果顯示：DlHDT1在非胚性愈傷組織(NEC)向球形胚(GE)發育過程中均檢測到表達且FPKM值高于300，其中在球形胚GE階段FPKM最高為810.64(圖6)，因此推測DlHDT1可能有利于非胚性及胚性培養物的生長發育，尤其有利于球形胚GE發生。

2.6.2DlHDT1在干旱和鹽脅迫處理下的qRT-PCR分析利用qPCR技術檢測10%的PEG6000在不同時間處理下DlHDT1基因的表達情況，結果顯示，與對照組相比(0 h)，DlHDT1基因在4、8和12 h 不同處理下均呈現下調表達趨勢(圖7，A)，雖在處理8 h時其表達略有上調，但總體仍為負調控趨勢。在不同濃度NaCl處理下DlHDT1基因呈現“V”型表達趨勢，在NaCl濃度為25 mmol·L-1時表達量達最低，在NaCl濃度為100 mmol·L-1時表達量達最高，但與對照組相比也為負調控趨勢(圖7，B)，由此推測DlHDT1參與鹽脅迫及干旱脅迫過程，并存在負調控關系。

A-C.導入DlHDT1基因融合表達載體的洋蔥表皮細胞；D-F.導入pCAMBIA1302-35S-GFP 空載體的洋蔥表皮細胞；A、D 為熒光激發圖；B、E 為明場圖；C、F 為疊加圖圖5 DlHDT1蛋白在洋蔥表皮細胞亞細胞定位A-C.Onion epidermal cells introduced with 1302 vector with DlHDT1 gene;D-F.Onion epidermal cells introduced with pCAMBIA1302-35S-GFP empty vector;A and D were shot in flourescent field;B and E were shot in bright field;C and F were shot in merged fieldFig.5 Subcellular localization of DlHDT1 protein in onion epidermal cells

NEC.非胚性愈傷組織；EC.胚性愈傷組織；ICpEC.不完全胚性緊實結構；GE.球形胚圖6 龍眼胚性及非胚性培養物DlHDT1的FPKM值NEC.Nonembryogenic callus;EC.Embryogenic callus;ICpEC.Incomplete embryotic compacted structure;GE.Spherical embryoFig.6 FPKM value of DlHDT1 at non-embryogenic and embryogenic cultures in longan

不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著圖7 不同脅迫處理下DlHDT1的相對表達量Different normal letters indicate significant differences between treatments at 0.05 levelFig.7 Relative expression of DlHDT1 under different treatments

3 討 論

3.1 龍眼DlHDT1蛋白定位于細胞核

HD2亞家族最初是在玉米中鑒定出來[2]，目前已在水稻[17]、擬南芥[18]、甜橙[19]等植物中鑒定出HD2亞家族基因。本研究基于龍眼基因組數據庫克隆得到DlHDT1的CDS序列為918 bp，該基因隸屬于HD2亞家族，并對其進行生物信息學分析，結果顯示DlHDT1為不穩定、親水的酸性蛋白，無信號肽及跨膜結構，含豐富的蘇氨酸和絲氨酸的磷酸化修飾位點，推測它與信號傳導、細胞周期、生長發育等諸多生物學問題有密切關系。蛋白質在核糖體完成生物合成后只有轉運到正確的細胞器或區域中才能發揮作用[20]，蛋白質亞細胞定位研究對于解析蛋白質的功能和調控，理解細胞生理活動機制具有重要意義。為研究DlHDT1蛋白的亞細胞定位情況，通過農桿菌介導轉化洋蔥表皮后共聚焦顯微鏡下觀察亞細胞定位，結果表明DlHDT1蛋白定位于細胞核中，這與水稻[5]、毛果楊[21]中定位結果一致。

3.2 龍眼DlHDT1可能參與體胚發生及非生物脅迫響應

HD2作為植物特有的一種組蛋白去乙酰化酶，廣泛參與植物的生長發育過程。如參與擬南芥根的生長，過表達AtHD2D植株側根生長較長，轉基因植株的根冠比高于野生型[9]。參與擬南芥種子發育，沉默AtHD2A基因導致轉基因植物種子敗育[22]；HD2A可通過葡萄糖信號傳導途徑在擬南芥幼苗萌發的早期發揮重要作用[23]。SlHDT3基因通過調控番茄果實中類胡蘿卜素及乙烯生物合成影響番茄紅素的積累及番茄果實成熟[24]。植物中HD2蛋白從玉米胚中被分離純化出來，且在玉米胚胎的早期形成過程中HD2蛋白以酸性核仁磷酸化形式存在于核內，可能參與調節核糖體染色質的結構和功能[25]。擬南芥中HD2家族有4個成員，HD2A、HD2B和HD2C在胚珠、胚乳中表達量較高[22]，說明HD2家族基因可能參與植物胚胎發育過程。本研究通過分析DlHDT1在龍眼體胚發生過程中的轉錄組數據，顯示DlHDT1基因在龍眼體胚發生NEC、EC、ICpEC和GE階段均有表達，且在GE階段表達量最高，綜上推測DlHDT1可能參與龍眼體胚發生形態建成。

HDT1在調控植物生長發育進程、抗逆境脅迫等方面均發揮重要作用。本研究對DlHDT1基因的順式作用元件分析發現，其啟動子序列含低溫、干旱等逆境脅迫相關作用元件，推測DlHDT1可能在極端溫度及干旱等逆境脅迫中起著重要作用。在水稻中過表達HD2亞家族基因OsHDT701增強了幼苗期植株對鹽脅迫的耐受性[26]；擬南芥中HD2D轉基因植株通過增加側根數量來獲取更多的養分和水分而響應干旱脅迫[9]。本研究通過qRT-PCR檢測DlHDT1在NaCl及干旱脅迫下表達模式，結果顯示DlHDT1基因均表現為下調表達趨勢，與楊樹中HD2亞家族基因在NaCl和干旱脅迫處理下表達趨勢一致[27]，推測干旱及鹽脅迫與龍眼體胚發生早期DlHDT1基因表達存在負調控關系。擬南芥HD2蛋白可以與其他蛋白發生互作，進而共同參與脅迫響應，如AtHD2C與含BRM的SWI/SNF染色質重塑復合物發生互作，形成去乙酰化復合體，抑制下游基因的轉錄從而響應逆境脅[28]。本研究通過蛋白互作網絡分析顯示DlHDT1可與多種蛋白發生互作，DlHDT1的表達受到干旱和鹽脅迫的調控，由此我們進一步推測DlHDT1基因可能在龍眼適應非生物脅迫過程中具有重要作用，但在蛋白層面DlHDT1如何與蛋白互作參與脅迫調控有待進一步研究。

本研究從龍眼基因組和轉錄組數據庫中篩選并克隆出組蛋白去乙酰化酶基因DlHDT1的CDS序列，亞細胞定位顯示該基因定位于細胞核，表達模式分析顯示DlHDT1基因可能參與龍眼體胚發生的形態建成，且響應干旱及NaCl脅迫應答。