硝態氮與無機磷濃度及其比例對簇生舟形藻生長生理及細胞形態的影響

陳 寧，何佳昕，孫曉莉，劉 妍，范亞文

(哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院，黑龍江省水生生物多樣性研究重點實驗室，哈爾濱 150025)

硅藻作為常見的淡水藻類，其密度與水體的營養水平密切相關[9-10]，其主要依靠水中的氮、磷元素進行繁殖，水體中氮、磷的濃度以及氮磷比都能對硅藻的種類及豐度產生重要的影響，因此硅藻?？勺鳛樗w檢測的指示性植物[11-12]。早在2007年Ponader等[13]就通過對新澤西河流水體環境的研究發現，水系中硅藻可以作為監測和評估水體中氮、磷濃度的一項常規指標。淡水浮游硅藻最適氮磷比為7.3∶1，此時浮游硅藻的生長和繁殖速度最快，當氮、磷濃度增加時，會影響藻類的葉綠素、蛋白質含量以及SOD活性等多種生理指標[14]。簇生舟形藻是一種典型的普生性淡水單細胞硅藻，具有個體小、生長速度快并對環境污染物高度敏感等特性，因此對于水環境中富營養化有比較明顯且直觀的理化反應，能夠較好地反映水體的營養狀態及水環境變化情況[9]。

目前，水體中氮、磷含量與硅藻相關性的研究多集中于氮、磷含量對硅藻生物量的影響及硅藻對于氮、磷降解等方面，而關于淡水硅藻對富營養化水體不同氮、磷濃度的生理指標響應及形態學變化的研究相對較少。本研究模擬了“仿生”硝態氮和無機磷污染環境，探究不同濃度、不同脅迫時間及不同氮磷比條件下簇生舟形藻對氮磷脅迫的生長、生理及形態的響應特征，從而研究簇生舟形藻對于過高濃度營養鹽的利用狀況，為利用簇生舟形藻指示水體中氮、磷富營養化水平提供理論基礎，這對探究硅藻對水環境中氮磷脅迫的響應機制及其對水環境監測的指示作用都具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 藻種的培養

簇生舟形藻由哈爾濱師范大學水生生物實驗室采集并分離純化，并將分離純化后的簇生舟形藻轉接至WC改良培養基中進行培養。在無菌條件下，挑選生長良好的純種藻株放入恒溫培養箱中進行逐級擴大培養，培養溫度為(20±1)℃，光照條件為4 000 lx，光/暗時間為12 h/12 h，每天對藻液定時搖動3～5次，防止藻體在瓶壁附著成塊，培養10～15 d，達到對數生長期，用于后續實驗。

1.2 氮、磷脅迫實驗

依照文獻記載[15-17]和前期預實驗結果，采用不同濃度梯度的硝酸鈉(NaNO3)和磷酸二氫鉀(KH2PO4)對簇生舟形藻分別進行單一氮、磷濃度以及氮磷配比3組脅迫處理，每組各設置5個水平，氮脅迫濃度分別為0.5、5.0、50、250和500 mg·L-1(NO3--N)，磷脅迫濃度分別為0.05、0.5、1、5和25 mg·L-1(H2PO4--P)，氮磷濃度配比分別為5∶1、10∶1、20∶1、50∶1和100∶1。實驗藻種的初始細胞密度為1×104cell·mL-1。每個實驗組設3次重復，將藻株放入WC培養基中，置于20 ℃恒溫培養箱中培養，光照條件為4 000 lx，光/暗時間為12 h/12 h，分別在處理1、3、5、7、9、11、和13天時取樣進行相關指標的測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 細胞密度依照設定濃度脅迫后，采用分光光度法與血球計數法相結合的方法對簇生舟形藻進行細胞數量統計，用細胞個數與透光率(OD680)之間的線性回歸方程計算細胞密度?；貧w方程為C= -0.101 4x+ 98.522(R2=0.999 4)，式中C代表細胞密度(×104cell·mL-1)，x代表OD680值。取2 mL處理后的藻液，混勻，在680 nm波長下測定透光率(以純凈的WC改良培養基調零)，按上述回歸方程計算出相應的細胞密度并繪制生長曲線。對處理13 d后的簇生舟形藻進行比生長速率測定，比生長速率(μ)計算公式如下：μ= (lnXt-lnX0)/t

式中，X0表示初始藻細胞量，Xt表示t天后的藻細胞量

1.3.2 葉綠素a含量采用丙酮萃取法測定細胞中的葉綠素含量[18]。取不同濃度氮、磷及其配比脅迫后的均勻藻液10 mL置于離心管中，5 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，加入5 mL 80%丙酮，超聲破碎30 min，于4 ℃冰箱中避光提取24 h，4 ℃、5 000 r·min-1離心10 min，取上清液，分別在663 nm和646 nm波長下測定其吸光度A663和A646(以80%丙酮調零)。根據以下公式計算葉綠素a(Ca)含量：

Ca=12.21A663-2.81A646

1.3.3 丙二醛含量采用TBA法測定細胞內丙二醛含量[19]。取5 mL不同濃度氮、磷及其配比脅迫后的藻液，3 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，用液氮研磨至粉末狀，加入3 mL的10%三氯乙酸，離心5 min，上清液即為酶液。取2 mL待測酶液和2 mL的0.6%硫代巴比妥酸溶液，混勻，于沸水浴中反應30 min，迅速冷卻并離心，取上清液分別于450、532及600 nm波長下測定其吸光度A450、A532和A600。取2 mL硫代巴比妥酸和2 mL三氯乙酸混勻，作為對照管進行調零，按以下公式進行計算丙二醛含量(CMDA)：

CMDA(μmol·L-1)=6.45(A532-A600)-0.56A450

1.3.4 蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定細胞內的蛋白質含量[20]。取5 mL不同濃度氮、磷及其配比脅迫后的藻液，3 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，用液氮研磨沉淀至粉末狀，加入1.5 mL的磷酸緩沖液，離心5 min，上清液即為粗酶液。分別取1 mL由不同實驗組藻液提取得到的粗酶液，加入染料溶液5 mL混勻，5 min后在595 nm波長處測定吸光值A595，對照標準曲線求得蛋白質濃度。

1.3.5 超氧化物歧化酶活性采用氮藍四唑光還原法測定細胞內超氧化物歧化酶(SOD)活性[21]。取5 mL不同濃度氮、磷及其配比脅迫后的藻液，3 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，用液氮研磨沉淀至粉末狀，加入1.5 mL的磷酸緩沖液，離心5 min，取上清液。并且設置調零管和測定管置于暗處反應10 min，最大光還原管置于25 ℃恒溫光照培養箱中反應10 min，于560 nm波長下測定吸光度A560。用以下公式進行計算SOD活性(以鮮重表示)：

SOD活性(U·g-1)=(A空-A測)V總/(0.5A空WV反)

式中：A空為最大光還原管的吸光值，A測為測定管的吸光值，V總為提取液總體積(mL)，W為樣品鮮重(mg)，V反為反應時添加的酶液體積(mL)。

1.3.6 過氧化氫酶活性過氧化氫酶(CAT)活性采用鉬酸銨法[22]測定。取5 mL不同濃度氮、磷及其配比脅迫后的藻液，3 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，用液氮研磨沉淀至粉末狀，加入1.5 mL的磷酸緩沖液，離心5 min，上清液即為粗酶液。取上清液0.2 mL與1.0 mL的基質液一起置于37 ℃水浴箱中水浴60 s，加32.4 mmol·L-1鋁鉬酸銨1.0 m L，混合后于室溫放置5 min，在405nm處用空白調零，測定樣品組(包括1.0 mL基質，1.0 mL鉬酸銨試劑，0.2 mL上清液)和空白組(包括1.2 mL緩沖液和1.0 mL鉬酸銨試劑)的吸光度值A和A0。CAT活性(以蛋白質含量表示)計算公式如下:

CAT活性(U·mg-1)= (A0-A)×271/(1/60×V×C)

式中：A0為空白管的吸光度值，A為測量管的吸光度值，V為反應中加入酶溶液的體積，C為樣品的蛋白濃度。

式中，Na為形態發生畸變的細胞數，N0為細胞的總體數量

1.4 數據處理

實驗數據圖采用Origin繪制，方差分析利用One-way ANOVA進行分析，多重比較采用LSD法進行。所有的數據分析都在SPSS 25.0軟件中進行，差異顯著性水平為0.05(P<0.05)和0.01(P<0.01)。

2 結果與分析

2.1 氮、磷施用濃度及比例對簇生舟形藻生長的影響

2.2 氮、磷施用濃度及比例對簇生舟形藻葉綠素a和蛋白質含量的影響

不同小寫字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異，下同。圖1 不同氮、磷施用濃度及比值下簇生舟形藻細胞密度和比生長率的變化The different normal letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level;the same as belowFig.1 Changes of algal cell density and specific growth rate under different N and P concentrations and N/P ratios stress

圖2 不同氮、磷施用濃度及比例下簇生舟形藻葉綠素a和蛋白含量的變化Fig.2 Changes of Chl a and protein contents in algal cell under different N and P concentrations and N/P ratios

2.3 氮、磷施用濃度及比例對簇生舟形藻丙二醛(MDA)含量的影響

圖3 不同氮、磷施用濃度及其比例處理下簇生舟形藻丙二醛含量的變化Fig.3 Changes of MDA content in algal cell under different N and P concentrations and N/P ratios

2.4 氮、磷施用濃度和比例對簇生舟形藻SOD和CAT活性的影響

圖4 不同氮、磷施用濃度和比例下簇生舟形藻的SOD和CAT活性的變化Fig.4 Changes of SOD and CAT activities in algal cell under different N and P concentrations and N/P ratios

2.5 氮、磷施用濃度對簇生舟形藻形態特征及畸形率的影響

3 討 論

A-F.光學顯微鏡觀察：A-C.對照；處理；處理；F.N∶P(100∶1)處理；G-Q.掃描電子顯微鏡觀察：G、H.對照；處理；處理；O-Q.N∶P(100∶1)處理圖5 高濃度氮(500 mg·L-1)、磷(25 mg·L-1)和氮磷比(100∶1)脅迫前后簇生舟形藻細胞的形態變化A-F.Optical microscope：A-C.Control;D. mg·L-1) treatment;E. mg·L-1) treatment;F.N∶P(100∶1) treatment;G-Q.Scanning electron microscope：G,H.Control;I-K. mg·L-1) treatment;L-N. mg·L-1) treatment;O-Q.N∶P(100∶1) treatmentFig.5 Morphological changes of algal cells under high concentrations of N (500 mg·L-1),P (25 mg·L-1) and N∶P(100∶1)

光合作用是藻類最基本和最重要的生命活動過程，葉綠素含量的變化可以直接反映出藻類光合作用能力的強弱，同時葉綠素的含量也是藻類受環境脅迫的重要生理指標之一。本研究結果表明高濃度氮、磷脅迫對簇生舟形藻的葉綠素a有一定的抑制作用，氮處理時間的延長促進了藻類細胞的生長和生物量的積累，這與Song等[29]的研究結果相似。葉綠素a可以降低由脅迫產生的活性氧基團(ROS)導致的細胞損傷[30-31]，其含量變化可能是由于葉綠素a對脅迫引起的細胞內ROS的積累能快速反應。長時間的磷脅迫使藻細胞自身調節能力減弱，同時，磷還能破壞其細胞內葉綠體的合成，阻礙光合作用，最終導致細胞中葉綠素a含量的降低[32]，而這種變化也與細胞密度的變化趨勢基本一致。蛋白質是藻細胞維持正常生理功能的物質保障[23]，通常情況下，當營養鹽供應充足時藻類體內蛋白質的合成量增加。但在本研究表明長期的高濃度富營養環境能影響簇生舟形藻的生理過程并抑制它們的正常生長。這與程麗巍等[33]對幾種藻類的研究結果一致，氮、磷含量對不同藻類體內總蛋白含量的影響存在著一定的差異。在氮磷比為5∶1時葉綠素a和蛋白質含量顯著降低，氮限制能夠顯著抑制三角褐指藻的生長速率與光合活性，葉綠素a含量較氮充足時降低了73%[34]。在本研究表明過高或過低的氮磷比均不利于簇生舟形藻的生長并可能抑制其光合作用。對簇生舟形藻而言氮磷比高于50∶1為磷限制；氮磷比低于50∶1為氮限制，無論氮限制還是磷限制，其葉綠素a和蛋白質含量均明顯低于氮磷比為50∶1的處理組。本研究還發現氮對簇生舟形藻生長和生理狀態的影響高于磷，這與王敏等[35]的研究結論一致。

MDA是膜脂質過氧化的重要標志之一，其含量能反映細胞受活性氧的毒害程度[36-37]。在李雪琴等對蛋白核小球藻的研究中發現，低濃度有機磷農藥脅迫下其體內MDA含量升高，而高濃度下MDA含量降低[38]。這與本研究結果相似，足以表明在短時間氮、磷及氮磷比脅迫下藻類具有一定的抗逆性和適應性，但隨著脅迫時間和脅迫濃度的增加，會使藻類細胞損傷嚴重進而導致其抗逆機制被破壞。超氧化物歧化酶(SOD)是細胞中活性氧清除系統中重要的抗氧化酶，它能使細胞中過量的ROS轉化為H2O和O2，減輕ROS對細胞的損傷[39]，過氧化氫酶(CAT)將H2O2進一步分解為H2O和O2。本研究發現氮、磷濃度及氮磷比的升高激發了簇生舟形藻細胞內的氧化應激反應，SOD和CAT酶活性的增加有助于舟形藻抵抗過量的營養鹽造成的環境脅迫[29,36]。高濃度的氮、磷及氮磷比處理對簇生舟形藻有毒害作用，其原因可能是因為脂質過氧化損傷而導致，此時簇生舟形藻細胞可能處于極度應激狀態，大量的過氧化物和超氧化物消耗了細胞內的碳水化合物使細胞受到了嚴重的氧化損傷。最初，細胞內的活性氧產生在SOD和CAT酶分解的正常范圍內；因此，SOD和CAT酶活性隨著酶底物濃度的增加而提高。當活性氧超過正常分解能力時，SOD和CAT酶活性降低，氧自由基濃度升高，對簇生舟形藻造成傷害。處理后期，活性氧的增加可能遠遠超過簇生舟形藻抗氧化酶系統的正常酶活性，導致植物體內氧化代謝失衡，SOD和CAT活性顯著下降。這一結果與以前的研究[27,40]相似。Jorge和Stephan[41]的研究表明，氨能夠產生氧化應激，表現CAT和POD活性增強，CAT酶活性增加與本研究結果較一致。

4 結 論

(3)模擬實驗數據顯示在環境氮、磷富營養化初期會出現藻類加速生長情況，但是長時間高濃度的氮、磷營養鹽脅迫使硅藻中對細胞起到保護作用的主要生理指標含量或活性均被抑制，并將最終威脅到簇生舟形藻在水體境中的數量和群落結構，說明高濃度氮、磷富營養化對藻體產生了逆境毒害。因此，利用簇生舟形藻對水體中氮、磷富營養化的逆境響應現象可以指示水體營養鹽過量程度，探索硅藻在過度營養水環境中的抗逆水平，還可為藻類對水環境的風險指示提供基礎數據和實踐依據。