營養(yǎng)強化對卵形鯧鲹仔、稚魚骨骼發(fā)育基因表達的影響

楊蕊 周勝杰 方偉 馬振華

(1 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，海南三亞 572018；2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東廣州 510300；3 三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南三亞 572018)

卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)隸屬于鱸形目(Perciformes)、鲹科(Carangidae)、鯧鲹屬(Trachinotus)，是1種暖水性中上層洄游魚類，廣泛分布在我國、澳大利亞、日本和東南亞如印度尼西亞、新加坡等的熱帶及亞熱帶海域[1]。該魚體高而側扁，尾柄細短而扁，肉質(zhì)鮮美細嫩，營養(yǎng)豐富，廣受消費者的喜愛[2]。自20世紀90年代，卵形鯧鲹開始在我國廣東、福建和海南等地被繁育養(yǎng)殖，現(xiàn)已成為我國南方主要的養(yǎng)殖海水魚類之一[3-4]。目前對卵形鯧鲹的研究較為廣泛，但主要集中于該魚的人工繁育、發(fā)育和病害等方面[5-10]。

骨骼發(fā)生是脊椎動物發(fā)育過程中重要的組成部分[11]。在這一過程中，不同類型的細胞(如軟骨細胞、成骨細胞、骨細胞和破骨細胞)的分化和增殖抑制了骨骼的形狀、大小和礦物形成[12]。骨骼發(fā)育相關基因的表達能夠反映細胞的增殖和分化，而且還受到個體遺傳特性、生物和非生物因素的影響[13]。骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)屬于轉化生長因子-β超家族成員，可誘導骨形成時的異位[14]。BMP 2和BMP 4蛋白是該家族中重要的成員，主要與軟骨和硬骨的發(fā)育密切相關。sox基因家族是1組轉錄因子，在脊椎動物早期發(fā)育過程中具有十分重要的作用[15]。根據(jù)序列比較結果，該基因家族被分為6個亞組(A, B, C, D, E, F)，其中sox9基因屬于E組，在脊椎動物的發(fā)育過程中扮演著重要的角色[16]。

仔、稚魚在生長發(fā)育過程中，其形態(tài)和代謝等會發(fā)生巨大變化，其中基因表達和調(diào)控是1個關鍵機制。sox8、sox9、bmp2和bmp4基因作為魚類發(fā)育過程中的主要功能基因，了解這些基因在魚類個體發(fā)生過程中的表達將有助于加深對魚類發(fā)育的認識。營養(yǎng)強化是水產(chǎn)育苗過程中十分重要的環(huán)節(jié)，相關研究表明，營養(yǎng)強化能夠促進仔、稚魚的骨骼發(fā)育，并降低骨骼畸形率[17]。本研究采用經(jīng)強化劑(S.presso、海水擬微球藻)強化后的生物餌料(輪蟲和輪蟲無節(jié)幼體)投喂卵形鯧鲹仔、稚魚，最后通過熒光定量的方法分析不同強化組卵形鯧鲹的sox8、sox9、bmp2和bmp4等4個基因的表達，以期為卵形鯧鲹仔、稚魚的發(fā)育提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 受精卵來源與培養(yǎng)條件

營養(yǎng)強化試驗于2020年6月11日—2020年7月5日在中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心陵水實驗基地進行。試驗用卵形鯧鲹受精卵由海南藍海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司提供。將受精卵運輸至基地并置于500 L的孵化桶中進行孵化，孵化期間水溫保持在26 ℃。

孵化后第2天，將幼體轉移至9個500 mL的培育桶中繼續(xù)培養(yǎng)，保持密度為60尾/L。進水口位于培育桶底部，進水經(jīng)孔徑為250 μm的網(wǎng)膜過濾。排水口位于培育桶頂部，用孔徑為300 μm的濾網(wǎng)套住排水孔以防幼體逃逸。每個培育桶布設2個氣石，以保持水中溶解氧(DO)接近飽和水平。幼體培育期間，每天光照處理14 h(光照強度為2 400 lx)，黑暗處理10 h，水體鹽度保持在33.0±0.8，水溫保持在(26.5±1.0)℃，每天換水量為200%。

孵化后第3天開始以10～20個/mL的密度投喂輪蟲(Brachionusrotundiformis)，孵化后第13天開始添加鹵蟲無節(jié)幼體。其中，S.presso組投喂經(jīng)強化劑S.presso(INVE Aquaculture，Salt Lake City，UT，USA)強化12 h的輪蟲和鹵蟲無節(jié)幼體；海水擬微球藻組投喂經(jīng)海水擬微球藻(Nannocholoropsissp，青島宏邦生物技術公司)強化12 h的輪蟲和鹵蟲無節(jié)幼體；對照組投喂未經(jīng)強化的輪蟲和鹵蟲無節(jié)幼體。每組均設3個平行，即每組共3個培育桶。

在魚苗培育階段，每天添加適量的濃縮小球藻來調(diào)節(jié)水色，以保證適合于魚苗培育的淺綠色水體環(huán)境。孵化后第18天開始混合投喂配合飼料，每天投喂5～6次，飼料過渡期4～5 d。育苗期間，每日清除殘飼和死亡的魚苗，每2天清理1次排水口濾網(wǎng)。

1.2試驗采樣

分別于受精卵孵化后第0、5、10、15、20 和25天進行采樣，每個組每個平行分別隨機選取10尾魚苗，用濾紙吸干后置于RNA Store中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA提取

低溫保存的樣品經(jīng)液氮研磨，提取總RNA。使用ND 5000超微量紫外可見分光光度計(北京百泰克生物技術有限公司)測定總RNA的含量。再使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.4實時熒光定量PCR(qPCR)

以提取的RNA為模板，使用PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)反轉錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]合成cDNA，并于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩７崔D錄體系共10 μL，包含2 μL 5×PrimeScript?RT Master Mix，總RNA 500 ng，用Rnase Freed H2O 補至10 μL。反轉錄反應條件：37 ℃反轉錄30 min；85 ℃滅活反轉錄酶5 s。從NCBI數(shù)據(jù)庫選取卵形鯧鲹sox8、sox9、bmp2和bmp4基因序列，使用Primer Premier 5軟件設計引物(見表1)。使用實時熒光定量 PCR儀(杭州朗基科學儀器有限公司)進行qPCR檢測。反應體系共20 μL，包括：10 μL 2×Real Universal PreMix，0.6 μL 10 μmol引物，2 μL稀釋的cDNA模板，用Rnase Freed H2O 補至20 μL。反應條件為：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。每個樣品進行3次qPCR，在每個qPCR周期結束時，對引物進行熔解曲線分析，以確保只得到特定的產(chǎn)物，不形成引物二聚體。設置無DNA模板的陰性對照組，以驗證qPCR過程未受污染。經(jīng)驗證，qPCR效率在100%左右。

表1 試驗所用引物

1.5計算與統(tǒng)計分析

用2-ΔΔCT法測定目的基因mRNA的相對表達量，以β-actin基因作為內(nèi)參基因進行標準化。試驗數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示。使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析和LSD檢驗進行組間比較，統(tǒng)計顯著性水平設為0.05。

2 結果

2.1 不同營養(yǎng)強化組卵形鯧鲹仔、稚魚sox 8基因的表達

由圖1可見，隨著試驗的進行，S.presso組試驗魚sox8基因的相對表達量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，其高峰出現(xiàn)在第10天。海水擬微球藻組也呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律，但其高峰出現(xiàn)在第15～20天。在第5、10天，S.presso組sox8基因的相對表達量顯著高于海水擬微球藻組和對照組(P<0.05)，但在第10～25天，海水擬微球藻組的相對表達量顯著高于其他兩組(P<0.05)。試驗全程，對照組試驗魚sox8基因的相對表達量幾乎都處在較低的水平。

2.2不同營養(yǎng)強化組卵形鯧鲹仔、稚魚sox9基因的表達

由圖2可見，生物餌料強化劑對試驗魚sox9基因的表達有顯著影響(P<0.05)。在第0～15天，S.presso組sox9基因的相對表達量處于較高水平，但之后顯著下降(P<0.05)。海水擬微球藻組sox9基因的相對表達量在第0～10天差異不顯著，在第15 天時達到最高(P<0.05)。總體而言，在第5～20天，S.presso組sox9基因的相對表達量均顯著高于其他2組(P<0.05)，在第25天，海水擬微球藻組sox9的相對表達量高于其他2組。試驗全程，對照組sox9基因的相對表達量呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(P<0.05)。

注：不同小寫字母表示組內(nèi)差異顯著，不同大寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)；下同。

圖2 不同強化組卵形鯧鲹仔、稚魚sox 9基因的表達

2.3 不同營養(yǎng)強化組卵形鯧鲹仔、稚魚bmp 2基因的表達

由圖3可見，生物餌料強化劑對試驗魚bmp2基因的表達有顯著影響(P<0.05)。S.presso組試驗魚bmp2基因的相對表達量隨著日齡的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，其峰值出現(xiàn)在第10天，最低值出現(xiàn)在第25天。海水擬微球藻組bmp2基因的相對表達量在第10天后顯著高于前期(P<0.05)，但后期各時間節(jié)點差異不顯著(P>0.05)。S.presso組bmp2基因的相對表達量在第5～10天顯著高于海水擬微球藻組(P<0.05)，但在之后則相反。試驗全程，對照組bmp2基因的相對表達量表現(xiàn)出顯著高于其他2組的趨勢(P<0.05)。

圖3 不同強化組卵形鯧鲹仔、稚魚bmp 2基因的表達

2.4 不同營養(yǎng)強化組卵形鯧鲹仔、稚魚bmp 4基因的表達

生物餌料強化劑對試驗魚bmp4基因表達的影響情況見圖4。S.presso組bmp4基因的相對表達量隨試驗魚日齡的增加呈現(xiàn)上升趨勢(P<0.05)，海水擬微球藻組則呈下降趨勢。試驗全程，S.presso組bmp4基因的相對表達量幾乎都顯著高于其他2組(P<0.05)。對照組bmp4基因的相對表達量在第10～20天變化不大，在前期和后期相對表達量較低。

圖4 不同強化組卵形鯧鲹仔、稚魚bmp 4基因的表達

3 討論

營養(yǎng)強化是指借助輪蟲、鹵蟲無節(jié)幼體等生物餌料的非選擇性濾食特性，將其作為活的營養(yǎng)載體，將一些含有特殊物質(zhì)的強化劑填充到其腸道中，并以此投喂水產(chǎn)動物苗種的過程[18],其目的是通過營養(yǎng)強化，滿足水產(chǎn)動物苗種對必需氨基酸、脂肪酸和脂溶性維生素等的需求，并有效預防疾病[19]。生物餌料營養(yǎng)強化技術現(xiàn)已廣泛應用在海水魚類苗種繁育過程中。早在20世紀90年代，就有學者開展了輪蟲營養(yǎng)強化對大黃魚生長及成活率影響的研究，結果表明，投喂經(jīng)海水小球藻強化培養(yǎng)的輪蟲后，大黃魚仔稚魚的成活率和生長均顯著優(yōu)于對照組[20]。杜濤等[21]對尖吻鱸、卵形鯧鲹和美國紅魚開展了營養(yǎng)強化育苗試驗，結果表明，投喂經(jīng)小球藻和螺旋藻粉強化的輪蟲后，仔稚魚的成活率顯著高于酵母組。Ma等[22]發(fā)現(xiàn)，投喂經(jīng)S.presso強化后的輪蟲和鹵蟲無節(jié)幼體能夠降低卵形鯧鲹仔、稚魚的畸形率，提高苗種質(zhì)量。為進一步明確S.presso和海水擬微球藻對生物餌料輪蟲和鹵蟲無節(jié)幼體的作用機理，本研究采用經(jīng)S.presso和海水擬微球藻強化的鹵蟲無節(jié)幼體投喂卵形鯧鲹仔、稚魚，并對其骨骼發(fā)育相關基因的表達進行研究，為卵形鯧鲹的苗種繁育提供參考和指導。

轉錄因子sox超家族與動物個體發(fā)育、機體代謝及性別決定等密切相關。sox8基因是該家族E群體的成員之一[23]，該基因廣泛存在于動物個體外胚層或中胚層細胞中，其表達主要發(fā)生在機體成骨細胞分化過程。本研究中，不同的營養(yǎng)強化劑對卵形鯧鲹仔、稚魚sox8基因的表達具有顯著的影響：S.presso和海水擬微球藻對sox8基因的表達均具有顯著的促進作用；S.presso的增強作用主要表現(xiàn)在整個試驗階段，而海水擬微球藻的增強作用表現(xiàn)在第10天之后。sox9也是sox超家族E群體的成員之一，機體軟骨細胞發(fā)育過程中主要依賴于sox9等基因的表達[24]。研究表明，多數(shù)魚類的精巢和卵巢中sox9基因出現(xiàn)復制現(xiàn)象，該現(xiàn)象在斑馬魚、河鲀、刺魚、青鳉和卵形鯧鲹等多種魚類中均被觀察到[15-16,25]。在本研究中，S.presso強化使得試驗魚sox9基因的表達在第25天前顯著增強，但在之后則沒有顯著影響。整體來看，海水擬微球藻強化對sox9基因的表達沒有顯著的影響。

BMP 2和BMP 4是密切相關的蛋白，參與了胚胎背-腹軸發(fā)育等關鍵過程[26]、上皮細胞-間質(zhì)細胞之間的相互作用[27]，還參與了細胞凋亡的過程[28]。Ma等[17]的研究表明，卵形鯧鲹仔、稚魚在第7天左右發(fā)生了骨化過程，到第18天時其骨骼的大部分結構已完全形成并礦化。本研究中，在骨骼發(fā)育階段，S.presso和海水擬微球藻的強化作用并不能增強試驗魚bmp2基因的表達。BMP 4蛋白在脊椎動物發(fā)育過程中發(fā)揮著多種作用，它不僅參與胚胎軸的形成和胚層的誘導，還調(diào)節(jié)組織器官的形成[29]。因此，它可被用來評價微營養(yǎng)素對海洋魚類幼蟲骨骼發(fā)育的影響[30]。本研究結果顯示，在骨骼發(fā)育階段，S.presso的強化作用能夠增強試驗魚bmp4基因的表達，但海水擬微球藻的強化作用并不能增強該基因的表達。