基于DNA條形碼對溫州洞頭海域游泳生物的鑒定

吳曉雯 王鐵桿 劉穎 張鵬

(浙江省海洋水產養殖研究所，溫州市海洋生物遺傳育種重點實驗室，浙江溫州 325005)

海洋游泳動物是海洋生態系統和海洋生物資源的重要組成部分，包括海洋魚類、頭足類、甲殼類等，可以直接給人類提供高營養價值的食物，具有重要的經濟利用價值。對海洋游泳生物進行調查鑒定是海洋生物資源監測、海洋生物多樣性研究的基礎工作，也是海洋資源開發利用和海洋保護區建設重要的參考依據。長期以來，都是根據生物的外部形態來鑒定物種。通常魚類在早期的形態特征差異不夠明顯或者相類似，很難根據其早期階段的形態特征進行精確分類[1]。由于物種表型具有可塑性，其形態特征會受到生物或者非生物因素的干擾[2]；生物在不同的生長發育階段或者兩性異形也會影響鑒定的準確性[3]。此外，形態學鑒定還受到分類者經驗和能力的影響，需要大量的專業知識積累。因此，準確地鑒定物種顯得尤為重要。

隨著生物分子技術的快速發展，DNA條形碼分析成為物種系統演化和分類鑒定的1種新的手段[4]，是專業人員可以運用的1種有效鑒定工具[5]。Hebert 等[6]明確提出了DNA 條形碼(DNA barcoding) 的概念，即通過使用短的、標準化的基因片段來進行物種鑒定，以提高真核生物識別效率，也使得DNA 序列輔助分類方法得到一定程度的統一。DNA條形碼技術的快速發展，在物種鑒定方面表現出較高的優越性，尤其是DNA條形碼數據庫的構建，為種類鑒定奠定了基礎。目前，線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COI) 基因被公認為標準DNA條形碼[7-8]，可以有效鑒定魚類[9-12]、頭足類[13]、甲殼類[14]和多毛類[15]。

洞頭海域處于浙江省南部，該海域受浙閩沿岸流和臺灣暖流的低、高鹽水系交匯的影響，水文條件適宜，海域開闊，海洋生物資源豐富。雖然已有該海域游泳動物的物種組成和群落結構季節性變化的研究報道[16-17]，但鮮有關于DNA條形碼數據收集的報道。為了監測該地區的游泳生物資源，本研究通過測定和比對溫州海域常見游泳生物的線粒體COI基因的DNA 條形碼序列，分析該基因在溫州海域游泳生物鑒定中的可行性，并為建立溫州海域游泳生物DNA 條形碼庫提供方法和基礎數據，研究結果可為該地區漁業監測、海洋生物資源保護、海洋保護區的建立提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與鑒定

2020年4月在浙江省洞頭海域進行張網調查(張網網口長10 m、寬7 m、高5 m， 80目)，生物學測定按照《海洋調查規范 第6 部分：海洋生物調查》(GB/T 12763.6—2007)進行。將每個調查站位的漁獲物全部取樣裝入樣品袋，做好漁撈記錄和樣品袋編號記錄后，冰鮮保存，帶回實驗室進行分析和鑒定，對主要品種進行生物學測定。稱量用電子天平精確度為0.001 g。游泳動物中軟體動物和節肢動物種類名稱及分類地位參考《中國海洋生物名錄》[18]，魚類參考《中國海洋魚類》[19]《浙江海洋魚類》[20]等文獻資料。

1.2 試驗方法

取漁獲物的肌肉組織，用雙蒸水洗去雜物，再用濾紙吸干，采用海洋動物組織DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)提取基因組DNA，4 ℃保存備用。利用通用引物對目的基因進行擴增，引物詳見表1。

表1 引物序列信息

PCR反應體系為25 μL：上下游引物各1 μL(10 μM)，DNA模板2 μL，金牌PCR Mix(green，北京擎科生物技術有限公司)21 μL。PCR反應程序為：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，53 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。以上試驗均設置陰性對照。取2 μL擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將單一目的條帶的PCR產物送到杭州擎科生物技術有限公司進行純化和雙向測定，以確保序列的可靠性。

1.3 數據處理

對獲得的全部序列進行人工比對并進行人工矯正，截取有效準確片段進行后續分析，將所有序列在NCBI數據庫中進行blast序列相似性比對，采用兩兩序列間遺傳相似度>98%的為同一物種、92%～98%為同一屬、85%～91%為同一科的標準對洞頭海域的游泳生物進行種類鑒定[21-22]。然后通過MEGA 6.0[23]對序列進行排列，計算所獲序列的長度、GC含量、多態位點、簡約信息位點等參數。結合數據庫中與樣品DNA 條形碼相似度最高的序列，利用鄰接法(neighbor-joining) 構建系統發育樹。鄰接法分支樹的可信度采用Bootstrap檢驗，經1 000次自檢獲得分支樹節點的支持率。

2 結果和分析

2.1 基因序列

本研究共獲得29條序列，經過比對，平均長度為666 bp，其中魚類序列共有19條，無脊椎動物10條，所有序列沒有插入、缺失堿基。保守位點316個，變異位點350個，單變異位點13個，簡約信息位點337個。T、C、A和G含量分別為31.8%、24.9%、25.1%和18.1%。

在脊椎動物(魚類)19條序列中，保守位點379個，變異位點287個，其中單變異位點30個，簡約信息位點257個。T、C、A和G含量分別為30.2%、27.1%、24.3%和18.4%。

在無脊椎動物(頭足類、甲殼類和多毛類)10條序列中，保守位點346個，變異位點320個，其中單變異位點41個，簡約信息位點279個。T、C、A和G含量分別為34.8%、20.8%、26.9%和17.5%。

2.2 序列同源性分析

將所獲得的29條有效序列在GenBank數據庫中進行blast比對，比對結果見表2。其中魚類19種，頭足類2種，甲殼類5種，多毛類3種。共有15條序列相似度為100%，12條序列相似度為99.0%，1條序列相似度為98.8%，大于98%的序列共有28條，占所有序列的96.5%。只有長吻沙蠶(Glycerachirori)相似度為86.19%。將所有序列上傳到GenBank數據庫，獲得相應的登錄號(見表2)。

表2 樣品信息

2.3 遺傳距離分析

K2P雙參數模型為生物條形碼協會(Consortium for the Barcode of Life，CBOL) 推薦的遺傳距離計算方法[24]。本研究采用K2P 雙參數模型，結合GenBank 數據庫檢索到的29條序列，統計試驗中樣品的種內、種間和科間的遺傳距離，結果見表3。根據K2P 模型計算各分類階元的遺傳距離，結果顯示，硬骨魚綱的種內遺傳距離為0.11%，種間遺傳距離為24.87%；甲殼類的種內遺傳距離為0.24%，種間遺傳距離為23.99%；多毛類的種內遺傳距離為0.24%，種間遺傳距離為29.47%。

表3 各個分類級別遺傳距離

2.4 系統進化分析

本研究構建的NJ 樹由58條序列構成，在種的水平上，所有序列均與GenBank中的序列聚合，與形態學鑒定結果一致。所有種類能夠聚為獨立分支，同種物種均能聚合在一起，同一物種的序列聚合后，再與同一屬的樣品序列聚合，同屬和同科的樣品序列均聚合在一起，同形態分類一致。在科以上階元中，NJ樹與形態學鑒定結果不一致，各目未能完全聚合在一起，存在一定的交叉(見圖1)。

3 討論

傳統的形態分類物種鑒定過度依賴于鑒定者的個人能力和經驗，分類單元的表型可塑性也會加大錯誤識別的概率[1]。DNA條形碼方法已被證明是1種有效的物種識別工具，尤其是對于損壞、不完整或由幾個形態學上不同階段組成的標本，可以使物種鑒定過程實現信息化和標準化[25]。DNA 條形碼技術能夠準確地鑒定形態相似種、隱存種以及處于不同生活史階段的物種，為海洋生態調查、物種遺傳進化以及環境資源保護提供數據和支持。但是，DNA條形碼也有局限性，如在某些情況下，近緣物種序列相似度較大，可能會導致DNA條形碼無法識別而失敗。因此，DNA條形碼可以作為鑒定物種的輔助工具，但不能替代形態分類學分析[26]。本研究中，通過DNA條形碼鑒定，所鑒定的小公魚sp與島嶼小公魚(Stolephorusinsularis)的相似度為100%。但是根據《臺灣魚類志》[27]記載，島嶼小公魚(Stolephorusinsularis)分布于印度-太平洋熱帶海域，包括我國臺灣南、北、東北及西部近海，在我國東海未有記載。本次利用DNA條形碼鑒定出的島嶼小公魚(Stolephorusinsularis)值得探討，遺憾的是由于樣本個體過小，無法對其進行形態學的深入比較。出現該結果的原因可能有以下2個方面：一是因待測樣品同時與GenBank數據庫中其他物種序列相似度相同，即種間界限不明顯，DNA片段難以將物種間的遺傳距離拉開，因而無法做出判定，需要借助其他序列輔助來綜合判定。利用DNA 條形碼技術雖然可以快速鑒別物種，但這項技術還需要結合傳統的形態鑒定方法才能獲得準確的種類序列，從而為DNA 條形碼鑒別工作累積有效的資料；另一方面，GenBank 是1個開放的共享數據庫，數據資料雖然豐富且龐大，但是其中的基因序列質量良莠不齊，上傳者在進行形態鑒定時也可能存在偏差，導致比對的序列同源性存在偏差。為了避免此情況，在此基礎上應該使用其他的條形碼進行輔助鑒定。

Hebert等[5]最早提出DNA條形碼的定義，以COI基因部分DNA序列作為物種分類指標，種內遺傳距離一定要小于種間距離，種間遺傳距離在2%以上，且是種內遺傳距離的10 倍以上。本次研究中，硬骨魚綱的種內遺傳距離為0.11%，種間遺傳距離為24.87%，種間遺傳距離約為種內遺傳距離的226倍；甲殼類的種內遺傳距離為0.24%，種間遺傳距離為23.99%，種間遺傳距離約為種內遺傳距離的100倍；多毛類的種內遺傳距離為0.24%，種間遺傳距離為29.47%，種間遺傳距離約為種內遺傳距離的122倍。以上結果表明以COI基因進行游泳生物鑒定是可行的。在構建的系統進化樹中，所有物種都能聚為獨立分支，且以屬、科作為分類單元均能在進化樹上成功聚類，說明DNA條形碼技術能成功應用于游泳生物的鑒定。

本研究遵循：相似度>98%的序列為同一種類，90%～98%為同一屬，80%～89%為同一科的標準對洞頭海域游泳生物進行種類判定[1]。所獲物種獲得的COI基因的DNA片段與相應基因的標準DNA條形碼進行序列同源性比對，得到的比對結果相較于傳統的形態學鑒定更為精準。本研究根據DNA 條形碼的鑒定結果，共鑒定出了28種游泳生物，其中魚類19種，頭足類2種，甲殼類5種，多毛類1種，序列比對的相似度均大于98%，條形碼鑒定和形態學判別結果互相吻合，因而可精準判別樣品所屬的物種，與預期結果一致。結果表明，該方法穩定、精準、易于操作，可應用于物種鑒定，值得推廣。

本研究中還存在一些不足的地方需要改進。例如有樣品的基因組DNA提取失敗，導致目的基因擴增失敗，無法進行后續實驗，因此未能獲得該物種的序列。該樣品在捕獲時未能及時進行冰凍保存，在鑒定時出現反復凍溶的情況，可能因此導致基因組DNA降解嚴重。此外，為了避免腸道內其他生物對實驗的影響，一般只取背部肌肉來提取基因組DNA，由于一些稚魚個體較小，其肌肉組織非常少，提取過程中稍有操作不當，即導致樣品基因組DNA提取失敗，未能獲得有效的基因組DNA。在今后的研究中需對操作進行優化，以提高實驗的檢出率。

本研究基于COI基因的DNA條形碼分析能夠識別洞頭海域的的大部分游泳生物，其鑒定結果與形態鑒定結果相吻合。DNA條形碼技術已成功應用于識別其他地理區域中的海洋魚類[1,28]。本研究建立了一個較可靠的洞頭海域的游泳生物DNA條形碼參考文庫，這將有助于更好地進行該地區的漁業監測、海洋生物資源保護和管理。

4 結論

基于COI基因的DNA 條形碼技術將隨機選取的29個樣品中的28個樣品準確鑒定到種，表明COI基因序列適用于溫州海域游泳生物物種的分類鑒定。在形態學分類資料缺乏或樣品形態特征缺失的情況下，DNA 條形碼技術可以作為游泳生物鑒定的一種便捷有效的方式，同時可以用來對游泳生物形態學分類系統進行補充和修訂。

由于COI基因的突變速率相對于線粒體DNA 控制區低，在鑒定分化程度較低的物種(如圓屬)時，利用COI序列無法準確鑒定到種。為了更好地發揮DNA 條形碼技術在物種鑒定中的作用，DNA 條形碼數據庫在數量和種類上亟需完善，以使物種鑒定更為精確。