茶樹G4基因克隆及其在白茶萎凋過程中的表達(dá)模式分析

ZARIPOV TIMUR，周承哲，2，謝思藝，田采云，石碧瀅，朱 晨，2，郭玉瓊*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州350002）

茶樹[Camellia sinensis（L.）O.Kuntze]作為一種重要的木本經(jīng)濟(jì)作物，具有極大的經(jīng)濟(jì)、藥用和文化價值[1-4]。葉綠素具有吸收和傳遞光能的能力，在植物生長發(fā)育中起著重要作用，其含量是決定葉片顏色的關(guān)鍵因素[5-6]。高等植物中的葉綠素主要包括葉綠素a和葉綠素b，其中葉綠素a合成的最后一步是7-丙酸與C20聚異戊二烯醇葉黃醇的酯化反應(yīng)，這一過程依賴于葉綠素a合成酶的作用[7]，目前已在擬南芥等植物中鑒定出其編碼基因（G4）[8]，然而在茶樹中尚未見有關(guān)G4基因的克隆研究。盡管葉綠素不溶于水，對茶湯的色澤影響較小[9]，但葉綠素的含量對干茶色澤品質(zhì)仍然具有重要影響[10]。已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素含量與白茶干茶色澤品質(zhì)呈正相關(guān)[11-12]。白茶作為福建的特種茶之一，因其具有較強(qiáng)的保健功效而深受廣大消費(fèi)者的喜愛[13-14]。萎凋作為白茶加工過程中最關(guān)鍵的工藝，對白茶獨(dú)特品質(zhì)形成具有決定性影響[15-16]。白茶萎凋過程中茶葉受到脫水脅迫，從而影響葉綠素的降解，最終形成白茶灰綠的色澤[15]。為更好地了解白茶萎凋過程中葉綠素含量變化規(guī)律及葉綠素a合成基因G4對葉綠素含量的合成調(diào)控作用，該研究對茶樹G4基因進(jìn)行克隆并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。同時，對白茶萎凋過程中G4的相對表達(dá)量和葉綠素含量進(jìn)行分析，以期為揭示G4在白茶萎凋過程中作用機(jī)理及其對葉綠素含量影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料來源。供試植物材料取自福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)實(shí)踐茶園（26°05′N，119°14′E）的‘福鼎大白’茶樹品種。按照白牡丹白茶采摘標(biāo)準(zhǔn)，從8株長勢一致，無病蟲害的‘福鼎大白’茶樹均一地采取一芽二葉茶樹嫩梢用于后續(xù)分析。

1.1.2 主要試劑。DreamTaq Green Mix酶，T1載體，T1感受態(tài)細(xì)胞，GelGreen熒光核酸凝膠染色劑，DEPC-H2O，75%乙醇。

1.2 方法

1.2.1 白茶萎凋處理。將茶葉置于室內(nèi)進(jìn)行48 h自然萎凋，攤?cè)~厚度為1 cm，設(shè)置萎凋溫度（25±2）℃，相對空氣濕度60%±3%。每12 h（0、12、24、36、48 h）進(jìn)行取樣，每次取樣進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，共獲得15份樣品，并對所有樣本的表型進(jìn)行記錄。將上述樣品分別置于錫箔紙袋中，液氮固樣后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 葉綠素含量測定。葉綠素含量按北京索萊寶科技有限公司試劑盒說明書進(jìn)行測定，稱取葉片中段，稱取0.1 g切成小塊，用蒸餾水洗滌。樣品在研缽中研磨，加入試劑后，轉(zhuǎn)移到試管中，用80%（V/V）丙酮稀釋至10 mL。在弱光條件下進(jìn)行制備，試管在室溫下置于黑暗處3 h，直到底部的組織殘留物完全變白。用分光光度計(jì)測定葉綠素a（645 nm）和葉綠素b（663 nm）的吸光度。葉綠素a和b和總含量按下列公式計(jì)算：

其中，V代表上清液體積；F代表稀釋倍數(shù)；m代表樣品重量。

1.2.3 茶樹總RNA提取及cDNA合成。參照TransZol-Up RNA提取試劑盒說明書（全式金，北京，中國）提供的方法從所有茶葉樣品中提取總RNA。使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的完整性，并利用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific，威爾明頓，美國）檢測其OD值，選取OD260/OD280值在1.8~2.0的RNA樣本按照HifairRⅡ1st Strand cDNASynthesis Ki（t翊圣，上海，中國）說明書提供方案進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA用于CsG4克隆和qRTPCR分析。

表1 引物序列

1.2.4 CsG4的cDNA全長克隆。檢索GenBank中已公布植物的G4序列，設(shè)計(jì)ORF全長驗(yàn)證相關(guān)引物（表1）。以‘福鼎大毫’茶樹葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。參照Lin等的方法，將擴(kuò)增后的目的基因片段進(jìn)行膠回收，T1為載體轉(zhuǎn)入T1感受態(tài)中，挑選出陽性克隆子委托鉑尚生物技術(shù)（福州）有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5 茶樹CsG4序列分析。利用ExPASyProtParam對CsG4進(jìn)行蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)分析；EMBnetTmpred、WoLFPSORT、SignaIP5.0Server、SOPMA以及STRING等在線工具分別用于蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測、亞細(xì)胞定位、信號肽、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和蛋白互作關(guān)系分析；利用NetPhos3.1Server預(yù)測磷酸化位點(diǎn)、PONDR預(yù)測蛋白序列的無序區(qū)、Coils用于卷曲螺旋預(yù)測；并SWISS-MODEL用于模擬蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；采用MEGA 7軟件中的鄰近相連法并設(shè)置bootstrap1000次重復(fù)以構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.6 qRT-PCR定量表達(dá)分析。利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)CsG4異性引物進(jìn)行qRT-PCR檢測（表1）。進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析驗(yàn)證引物特異性，試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，采用2-△△Ct算法計(jì)算定量結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsG4的cDNA克隆與序列分析

以‘福鼎大白’茶樹葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測、膠回收純化和測序后，獲得CsG4的cDNA序列，該序列全長1 125 bp，共編碼374個氨基酸（圖1）。將CsG4在NCBI中進(jìn)行blast比對，結(jié)果顯示CsG4與杜鵑、大麻、咖啡、楊樹和葡萄等多種植物的G4所編碼的氨基酸序列具有84.1%以上的相似性，同源性較高。將CsG4氨基酸序列與茶樹基因組氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示CsG4氨基酸序列與茶樹基因組中轉(zhuǎn)錄本的氨基酸序列（TEA017076.1）相似度為82.9%（圖2）。為進(jìn)一步驗(yàn)證所克隆CsG4序列的正確性，利用‘福云六號’茶樹葉片進(jìn)行克隆，將克隆所得G4序列與CsG4序列進(jìn)行多序列比對后發(fā)現(xiàn)，二者相似性為92.66%，表明所克隆的G4序列的正確性，但不同茶樹品種之間可能存在序列差異。

圖1 CsG4基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

2.2 CsG4編碼蛋白特征

利用ExPASy ProtParam網(wǎng)站分析該基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)，結(jié)果表明CsG4相對分子量為40.49 kD，原子組成為C1872H2932N470O515S7，原子總數(shù)5 796；由20種氨基酸組成，其中Leu（14.4%）、Ala（10.2%）、Gly（8.6%）、Ser（7.0%）和Ile（6.7%）等5個氨基酸含量較為豐富，而His（0.8%）和Met（0.8%）這2種氨基酸含量最少，含有帶負(fù)電氨基酸（Asp+Glu）共26個，帶正電氨基酸（Arg+Lys）共30個；理論等電點(diǎn)（pI）為8.74；不穩(wěn)定系數(shù)為25.76；總平均疏水性為0.313，推測該蛋白為穩(wěn)定、疏水的酸性蛋白。

蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，利用SOPMA在線分析工具預(yù)測CsG4蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其主要為49.47%α-螺旋、11.76%延伸鏈、4.55%β-轉(zhuǎn)角和34.22%不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)（圖3）。利用EMBnet-Tmpred預(yù)測蛋白跨膜區(qū)，結(jié)果顯示CsG4蛋白存在7個跨膜區(qū)域（圖4A），在93-113、169-187、223-240和317-339位氨基酸存在由內(nèi)向外的蛋白跨膜區(qū)域，最高分值為1 747分；在120-138、195-213、224-270及355-374位氨基酸存在由外向內(nèi)的跨膜區(qū)域，最高分值為1 753分，推測CsG4蛋白屬于跨膜蛋白。利用WoLFPSORT和SignaIP5.0分別對CsG4蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位和信號肽分析（圖4B），結(jié)果表明CsG4編碼蛋白主要定位于葉綠體，不具有信號肽。利用NetPhos3.1對CsG4蛋白所含的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示（圖5）該序列含有34個磷酸化位點(diǎn)，分別為15個Thr位點(diǎn)、14個Ser位點(diǎn)和4個Tyr位點(diǎn)，能被蛋白激酶C（PKC）和酪蛋白激酶Ⅱ（CKⅡ）等蛋白激酶磷酸化。利用PONDR在線預(yù)測軟件對G4蛋白序列進(jìn)行無序區(qū)預(yù)測，結(jié)果顯示，無序區(qū)段主要位于1-2、13-37、43-60、80-98、155-164和373-374 6個區(qū)段，占比20.32%。利用Coils工具預(yù)測對CsG4蛋白卷曲螺旋形態(tài)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示CsG4蛋白存在卷曲螺旋。利用SWISS-MODEL對CsG4蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，預(yù)測結(jié)果表明（圖6A）CsG4蛋白主要結(jié)構(gòu)元件為α-螺旋。通過STRING對CsG4蛋白潛在的互作關(guān)系進(jìn)行預(yù)測分析（圖6B），參照擬南芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，G4與AT1G74470和PCB2的互作系數(shù)分別為0.997和0.997，與ALB1的互作系數(shù)為0.995。

圖2 CsG4氨基酸序列多重比對

圖3 CsG4蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

圖4 CsG4蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測及信號肽分析

2.3 CsG4氨基酸序列進(jìn)化樹分析

為進(jìn)一步了解CsG4在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系，將CsG4蛋白與其他植物的G4蛋白進(jìn)行氨基酸多序列比對，并利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，茶樹CsG4與杜鵑（Rhododendron dauricum）和咖啡（Coffea arabica）等植物的親緣關(guān)系最近，與毛果楊（Populus trichocarpa）和楊樹（Populus euphratica）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖7）。

2.4 白茶萎凋過程中葉片表型變化

為了解白茶萎凋過程中葉片色澤的變化，對萎凋葉每隔12 h拍攝一次照片，發(fā)現(xiàn)茶葉中的水分含量不斷減少。在48 h時，顏色從最初的黃綠色變?yōu)榘稻G色，其中芽和第1片葉子的變化更為明顯（圖8）。

2.5 白茶萎凋過程中葉綠素含量變化分析

為了解白茶萎凋過程中葉綠素含量變化，對萎凋過程中‘福鼎大毫’茶樹葉片中的葉綠素含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明，白茶萎凋48 h時，葉綠素含量比茶樹鮮葉下降了近2倍。葉綠素a的降解率高于葉綠素b，chl a/chl b的相關(guān)性不斷降低（圖9）。

2.6 茶樹CsG4在白茶萎凋中的表達(dá)分析

為了解CsG4在茶葉在萎凋過程中的表達(dá)水平，利用qRT-PCR技術(shù)對其表達(dá)量進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，白茶萎凋過程中，CsG4的相對表達(dá)量顯著降低，且與萎凋過程中葉綠素含量總體變化趨勢呈正相關(guān)（圖10）。這些結(jié)果表明，葉綠素含量和相關(guān)基因表達(dá)的降低可能是由采摘損傷和萎凋引起的脫水脅迫，推測可能是植物對脅迫產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)。

3 討論

白茶萎凋過程中葉片綠色消失是由葉綠素降解引起的，因此對葉綠素合成相關(guān)基因進(jìn)行分子克隆，了解其編碼蛋白的理化性質(zhì)及其在白茶萎凋過程中的表達(dá)具有重要意義。該研究表明，CsG4的cDNA序列，全長1 125 bp，共編碼374個氨基酸，存在7個跨膜區(qū)域，且CsG4編碼蛋白主要定位于葉綠體，不具有信號肽。以‘福鼎大毫’茶樹葉片為材料對G4進(jìn)行克隆，克隆所得序列與茶樹基因組中CsG4氨基酸序列與茶樹基因組中轉(zhuǎn)錄本序列（TEA017076.1）相似度為82.9%，為驗(yàn)證所克隆CsG4序列的正確性，利用‘福云六號’茶樹葉片進(jìn)行克隆，將克隆所得G4序列與CsG4序列進(jìn)行多序列比對后發(fā)現(xiàn)，二者相似性為92.66%，進(jìn)一步驗(yàn)證所克隆的G4序列的正確性。而這種差異可能是茶樹品種差異導(dǎo)致的。

圖5 CsG4蛋白所含的磷酸化位點(diǎn)

圖7 CsG4系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖6 CsG4蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測及蛋白互作分析

葉綠素代謝可能是影響白茶萎凋過程中葉色變化的關(guān)鍵因素。對白茶萎凋過程中茶葉中葉綠素含量進(jìn)行測定后發(fā)現(xiàn)，葉綠素含量隨萎凋時間延長總體呈下降趨勢，這一變化規(guī)律與白茶凋萎過程中CsG4的表達(dá)量變化趨勢一致。推測白茶萎凋過程中CsG4表達(dá)對葉綠素含量變化具有重要調(diào)控作用。

茶葉顏色是白茶品質(zhì)的指標(biāo)之一，因此更好地了解白茶萎凋過程中葉綠素代謝的機(jī)制值得深入研究。該研究以期為揭示CsG4在白茶萎凋過程中作用機(jī)理及其對葉綠素含量影響提供理論依據(jù)。

圖8 白茶萎凋過程中葉片表型變化

圖9 白茶凋萎過程中葉綠素含量變化

圖10 白茶萎凋過程中茶樹CsG4表達(dá)分析