白芍(Radix paeoniae alba)提取物對中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)造血組織發育及造血因子Astakine的影響*

呂孫建 焦錦彪 劉 莉 袁雪梅 于 喆 張海琪杭小英 施偉達 吳穎蕾

白芍()提取物對中華絨螯蟹()造血組織發育及造血因子Astakine的影響*

呂孫建1焦錦彪2劉 莉3袁雪梅1于 喆1張海琪1①杭小英1施偉達1吳穎蕾1

(1. 浙江省淡水水產研究所 農業農村部淡水漁業健康養殖重點實驗室 湖州 313001; 2. 西南大學水產學院 重慶 400715; 3. 浙江省農業科學院水生生物研究所 杭州 310021)

血淋巴細胞在甲殼動物免疫反應中起著非常重要的作用, 其主要由造血組織(Hematopoietic tissue, HPT)生成并隨著開管式循環分布到身體各處。到目前為止, 還沒有相關研究表明甲殼動物造血組織是否受草本植物的影響。本研究以中華絨螯蟹()為對象, 利用熒光定量PCR、免疫熒光和組織化學等技術, 初步探索了白芍()提取物對中華絨螯蟹造血組織和造血因子Astakine的影響。結果顯示, 在原代培養的造血組織細胞中添加終濃度為0.85 mg/mL的白芍提取物后, 造血因子mRNA的表達量顯著上調(<0.05)。進一步制備含1%白芍提取物的中華絨螯蟹飼料并進行飼喂實驗, 結果顯示飼喂含白芍提取物飼料的中華絨螯蟹造血組織的mRNA的表達量較飼喂前上調了10.5倍, 要高于對照組。免疫熒光結果同樣表明, 飼喂含白芍提取物飼料后中華絨螯蟹造血組織的Astakine蛋白熒光信號也要強于對照組。通過造血組織的形態學觀察和造血組織體重百分比的檢測, 我們發現白芍組中華絨螯蟹造血組織含有較多卵形小葉, 且造血組織體重百分比較飼喂前增加了6.64%, 而對照組僅增加1.6%。免疫保護率實驗顯示, 在脂多糖急性刺激下, 白芍添加組的中華絨螯蟹的存活率(77.5%)要高于對照組(57.5%)。綜上所述, 白芍提取物可以促進中華絨螯蟹造血因子的表達和造血組織的發育, 從而提高中華絨螯蟹的免疫調節功能。

白芍()提取物; 中華絨螯蟹(); 造血組織; 造血因子

中華絨螯蟹(), 又名河蟹、大閘蟹, 是我國的主要淡水養殖品種, 具有較高的經濟價值, 其2019年養殖總產量達到了778682 t (Sun, 2013; Lv, 2015;于秀娟等, 2020)。隨著人工養殖的迅速發展, 中華絨螯蟹病害問題越來越突出, 由于目前養殖過程中缺乏對幼蟹的病原檢測, 且飼養密度過高以及抗菌藥物的濫用, 病毒、細菌、寄生蟲和真菌等各類病原微生物引起的疾病的暴發愈發劇烈, 嚴重影響了中華絨螯蟹的養殖效益, 給養殖戶造成了巨大的經濟損失(Lv, 2014)。目前針對中華絨螯蟹的疾病防控沒有特別有效的辦法, 仍然是以使用抗生素和消毒劑為主, 而這又會導致耐藥菌的產生和疫病防控難度的進一步加大(Franz, 2020)。由于病原菌的復雜性和抗病藥物的不可持續性, 免疫增強劑作為一種新型藥物, 可以增強機體的免疫功能, 是提高中華絨螯蟹抗病能力的有效途徑。

甲殼動物的免疫屬于非特異性免疫, 血淋巴細胞隨著血液循環分布到身體各處, 在其免疫反應中起著重要的作用(S?derh?ll, 2003)。在機體感染病原菌過程中, 血細胞的多種免疫功能被激活, 包括黑化、吞噬、包被和細胞因子的釋放, 如抗菌肽、凝集素、過氧化物酶和酚氧化酶等(Jiravanichpaisal, 2006)。多糖類物質被認為是一種廣譜型免疫增強劑, 有研究表明, 多糖類物質能夠引起甲殼動物血細胞的劇烈變化(Lv, 2014)。在前期的研究中, 我們也發現中華絨螯蟹受病原菌, 如嗜水氣單胞菌、枯草芽孢桿菌以及脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激后, 血淋巴中的透明細胞、顆粒細胞和半顆粒細胞數量會急劇降低, 而后逐漸恢復(Lv, 2014)。同樣地, S?derh?ll等(2003)也發現注射β-1,3-葡聚糖可以影響甲殼動物血細胞的數量, 從而刺激血細胞的生成和釋放。研究表明, 甲殼動物血細胞的生成、存儲和釋放等生物學過程主要是由造血組織(Hematopoietic tissue, HPT)負責(Lin, 2011a)。中華絨螯蟹的造血組織位于胃的背腹側, 是一層薄且不透明的組織(Jia, 2016)。該組織由一系列結締組織連接的卵形小葉組成, 含有豐富的造血干細胞和各分裂期血細胞的前體細胞(Jia, 2016; S?derh?ll, 2016)。S?derh?ll(2016)研究發現, 克氏原螯蝦在受病原微生物或細菌多糖刺激后, 造血組織會啟動血細胞生成的功能, 該過程包括血細胞的增殖、分化及最終從造血組織釋放到血腔中。因此, 我們相信造血組織在甲殼動物整個生活史, 尤其是在抵御外來病原微生物的過程中發揮著重要的作用。

中草藥富含多糖、甙類、生物堿、苦味素、生物類黃酮等多種有效成分, 不僅可以提高營養物質的利用效率、增強機體新陳代謝、促進機體生長, 還能調節機體的免疫功能, 并且擁有價格低廉、來源豐富、不易污染環境等優點, 因而已成為水產養殖中非常適宜的免疫增強劑(Xu, 2019)。劉紅柏等(2004)研究發現, 在鯉魚飼料中添加由黃芪、板藍根、茯苓和魚腥草組成的復方制劑可以改善鯉魚的腸道菌群; 郭永軍等(2005)也報道了草本植物飼料添加劑(主要是黃芪)可以增強機體免疫功能和提高存活率。在傳統的中草藥制劑中, 白芍(, RPA)被認為具有顯著的生血和止痛功效, 且被廣泛用于臨床治療超過2000年(Xu, 2019)。因此, 本研究旨在探究白芍提取物對中華絨螯蟹造血組織和造血因子Astakine的影響, 確定其是否也會影響甲殼動物血細胞的生成等。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗所用中華絨螯蟹(), 每只規格約為10 g, 購于上海崇明島某養殖場。中華絨螯蟹被放置于循環水養殖箱中, 水溫控制在22 °C。養殖期間, 按比例定時投喂商品化飼料, 并于飼喂2 h后清除殘餌及糞便。

1.2 造血組織細胞培養

中華絨螯蟹造血組織的分離參考北美淡水鰲蝦造血組織分離的方法進行(Lin, 2011b)。用于造血組織消化的消化液由抗凝劑(100 mmol/L葡萄糖, 26 mmol/L檸檬酸, 415 mmol/L氯化鈉, 30 mmol/L檸檬酸鈉, 30 mmol/L EDTA, pH 7.0)配制而成, 并含有0.1%的I型和IV型膠原酶(索萊寶, 中國)。分離的造血組織迅速置于1 mL的消化液中, 在37 °C條件下孵育45 min。將含造血組織細胞的消化液置于40 μm的細胞篩中過濾, 隨后在1000 r/min速度下離心15 min。收集的造血組織細胞經L-15培養基(賽默飛, 美國)清洗2遍后, 重新在1000 r/min速度下離心15 min, 用L-15培養基重懸造血組織細胞并調整細胞濃度至1×105個/mL。

1.3 白芍提取物安全濃度分析

取1×105個/mL濃度的造血組織細胞懸液200 μL, 接種到96孔細胞培養板后在24 °C的培養箱中培養, 每隔3 d更換一次培養基。將購自陜西森弗天然制品有限公司的白芍()提取物溶解在L-15培養基中, 并通過0.2 μm濾膜過濾后備用。用L-15培養基將白芍提取物終濃度調整至100、50、25、12.5、6.7、3.4、1.7和0.85 mg/mL, 并將調整好的含各濃度白芍提取物的培養基添加到96孔細胞培養板中進行孵育, 每個濃度3孔重復。連續孵育7 d, 每天用熒光DNA結合染料4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(碧云天生物技術, 中國)對細胞進行染色。用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution, PBS)清洗細胞2遍后, 室溫下用4%多聚甲醛固定細胞15 min, 隨后用PBS繼續清洗2遍, 并添加終濃度為1 μg/mL的DAPI 200 μL, 室溫孵育15 min后在熒光顯微鏡(萊卡, 德國)下拍照以觀察細胞形態。

1.4 造血組織細胞造血因子Astakine mRNA的檢測

將造血組織細胞以1×105個/mL的終濃度接種到96孔板中, 向細胞中添加含0.85 mg/mL白芍提取物的L-15培養基200 μL。在孵育的第0、1、2、3、4、5、6和7天, 取造血組織細胞并用RNAiso Plus (TaKaRa, 日本)提取總RNA, 隨后用PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time) (TaKaRa, 日本)將總RNA反轉錄成cDNA第一鏈。使用LightCycler?480 SYBR Green I Master (Roche, 瑞士)對各時間點造血組織細胞的mRNA進行檢測。表1列出了用于擴增中華絨螯蟹和基因的特定引物序列。qRT-PCR反應混合物包含2.5 μL cDNA第一鏈, 1 μL (10 nmol/L)正向引物, 1 μL (10 nmol/L)反向引物, 3 μL水和5 μL Master Mix, 并根據已有擴展程序進行反應(Lyu, 2020)。每組實驗重復三次, 最后根據2–ΔΔCt法計算造血因子mRNA的相對表達量。

表1 用于和qRT-PCR檢測的引物序列

Tab.1 Speci?c primers for qRT-PCR analysis of Astakine and β-actin

1.5 造血組織造血因子Astakine mRNA的檢測

含1%的白芍提取物中華絨螯蟹顆粒飼料由中大飼料集團有限公司制備并提供。實驗蟹被分成兩組, 每組100只。實驗組和對照組分別提供含白芍提取物和不含白芍提取物的飼料, 每日飼喂兩次, 飼養5周, 每周取5只蟹用于造血組織的采集及mRNA的檢測。

1.6 白芍提取物對造血組織的影響分析

飼養5周后, 各組取10只蟹, 對個體和造血組織進行稱重, 并計算造血組織體重百分比(造血組織重量/蟹重量)。另外, 從實驗組和對照組中分離造血組織, 用4%多聚甲醛室溫固定15 min, 然后進行石蠟包埋切片。H.E染色過程如下: 石蠟切片經蘇木精處理5 min, 沖洗3 min, 再用伊紅染色1 min, 切片用蓋玻片固定, 顯微鏡下拍照并觀察。

1.7 造血組織的免疫熒光分析

將石蠟切片置于封閉液(0.5% Triton X-100, 2% BSA, 0.5%兔血清PBS)中室溫孵育1 h, 后續步驟則是在前述方法(Jia, 2016)基礎上修改后進行。吸走封閉液, 加入本實驗室保存的兔源Astakine多克隆抗體(1︰200)進行孵育, 清洗后用帶有FITC標記的羊抗兔二抗(1︰1000)進一步孵育, 最后采用Pannoramic 250系統進行觀察及拍照, 使用Indica labs HALO系統進行分析。

1.8 白芍提取物對中華絨螯蟹抗急性刺激的影響分析

用脂多糖模擬革蘭氏陰性菌的感染進行急性刺激, 從實驗組和對照組中取40只蟹, 使用1 mL注射器向血腔中注射50 μL生理鹽水溶解的脂多糖(100 μg/mL), 每天統計各組死亡數并計算最終的存活率。

1.9 統計分析

數據以平均值±標準差表示, 使用SPSS11.0軟件進行數據顯著性分析, 采用單因素方差分析(ANOVA)進行統計分析,<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 白芍提取物對造血組織細胞的影響

為確定白芍安全劑量, 我們在原代培養的造血組織細胞里添加不同終濃度(100, 50, 25, 12.5, 6.7, 3.4, 1.7和0.85 mg/mL)的白芍提取物, 并于作用不同天數后用DAPI對細胞進行染色和顯微觀察。由圖1可見, 白芍終濃度大于6.7 mg/mL時對細胞有明顯的毒性, 細胞表現出類似于甲殼動物黑化作用的生物學反應。DAPI染色結果顯示, 當白芍終濃度高于0.85 mg/mL時, 造血組織細胞的細胞核不完整、且無法被染成藍色熒光。

我們進一步用qRT-PCR檢測在終濃度為0.85 mg/mL的白芍提取物的作用下, 造血因子在不同作用時間下的表達量。結果顯示前6天mRNA的表達量在白芍提取物作用下穩步上升, 到第7天時則下降(圖2a)。在白芍提取物作用的第2天,mRNA的表達量達到了初始濃度的8.73倍, 顯著高于對照組的表達量(0.05); 在作用后的第6天, 白芍組mRNA的表達量達到最高值, 且也顯著高于對照組(0.05)。

2.2 白芍提取物對造血組織Astakine mRNA的影響

在飼喂含有白芍提取物的飼料后, 我們解剖并獲取中華絨螯蟹的造血組織, 檢測組織內的mRNA的表達量。由圖2b可見, 在飼喂含有白芍提取物的飼料后, 中華絨螯蟹造血組織mRNA的表達量有一定上升, 但在第5周時出現下降。在喂食的第1周, 該基因表達量達到了初始的1.5倍, 在第4周時達到了初始的10.6倍, 但差異性分析顯示白芍組與對照組無顯著性差異(>0.05)。

圖1 不同終濃度白芍提取物作用下的造血組織細胞形態觀察

圖2 造血組織細胞(a)和造血組織(b)Astakine mRNA的表達量

注: “*”標注表示組間存在顯著性差異(<0.05)

2.3 白芍提取物對造血組織發育的影響

在經過了5周的飼喂后, 我們檢測了飼喂含白芍提取物及對照組的中華絨螯蟹造血組織的發育情況, 檢測指標包括造血組織體重百分比和造血組織卵形小葉數量。由圖3a可知, 飼喂含白芍提取物飼料的中華絨螯蟹造血組織器官要明顯大于對照組, 稱重結果顯示實驗組造血組織體重百分比初始為8.13%, 5周后達到了14.77%(增長了6.64%), 而對照組5周后只有9.73%(增長了1.60%)(圖3b)。H.E染色結果顯示實驗組和對照組的造血組織卵形小葉中都含有大量的血細胞前體細胞, 其中飼喂含白芍提取物飼料的中華絨螯蟹的造血組織較對照組含有更多的卵形小葉(圖3c)。

圖3 造血組織的形態(a)、造血組織體重百分比(b)和H.E染色結果(c)

注: S1—S4分別為分離的實驗組和對照組造血組織樣品

2.4 白芍提取物對造血組織Astakine蛋白的影響

利用免疫熒光技術對飼喂含白芍提取物飼料及對照組中華絨螯蟹的造血組織Astakine蛋白進行檢測。結果如圖4所示, 飼喂含白芍提取物飼料的中華絨螯蟹造血組織的Astakine蛋白含量較對照組要高。

2.5 白芍提取物對中華絨螯蟹抗急性刺激的影響分析

為確定白芍提取物對中華絨螯蟹抗性的影響, 本研究用100 μg/mL脂多糖模擬革蘭氏陰性菌感染對中華絨螯蟹進行急性刺激。7 d的統計結果顯示, 飼喂含白芍提取物的中華絨螯蟹的存活率為77.5%, 而對照組只有57.5%, 實驗組較對照組成活率提高了20%(表2)。

3 討論

中華絨螯蟹是我國的主要淡水養殖品種, 但近年來該品種深受多種病原微生物的危害(Lv, 2014), 如白斑綜合征病毒、呼腸孤病毒、弧菌和氣單胞菌等(徐海圣等, 2001; 薛仁宇等, 2005; 房海等, 2008; 雷燕等, 2017)。目前針對以上疾病, 養殖戶采用的主要防控手段仍然以抗生素和消毒劑為主, 這將不可避免地導致耐藥菌的產生, 加重疾病的防控難度(Franz, 2020)。

植物提取物富含多糖、甙類、生物堿、苦味素、生物類黃酮等多種有效成分, 不僅可以提高營養物質的利用效率、增強機體新陳代謝、促進機體生長, 還能調節機體的免疫功能, 并且擁有價格低廉、來源豐富、不易污染環境等優點, 已成為水產養殖中非常適宜的免疫增強劑(Gong, 2014)。目前已有相關研究涉及植物提取物在中華絨螯蟹養殖中的應用, 如Zhao等(2018)發現金銀花莖乙醇提取物能夠提高中華絨螯蟹血細胞的吞噬率和吞噬指數、酚氧化酶活性和一氧化氮合成酶活性。同樣地, Zheng等(2019)也發現飼料中添加淫羊藿苷可以顯著提高中華絨螯蟹的抗氧化能力和非特異性免疫力。白芍作為傳統中藥材, 具有多種生物學活性, 如生血、保肝和止痛等(Xu, 2019)。在本研究中, 我們通過在造血組織細胞培養液和飼料中添加白芍提取物, 來評估其對中華絨螯蟹造血因子和造血組織的影響。為確定白芍的安全劑量, 我們在原代培養的造血組織細胞中添加不同濃度白芍提取物。通過對細胞核的染色及形態學觀察, 我們發現6.7 mg/mL的終濃度會導致造血組織細胞出現類似細胞黑化作用的生物學反應。黑化反應是甲殼動物血細胞一種常見的免疫反應, 是指細胞合成黑色素外殼和細胞毒性效應物(Charoensapsri, 2014)。白芍提取物能誘導造血組織細胞發生黑化反應意味著過量添加該物質極有可能誘導細胞產生高氧化性的物質并導致細胞死亡。通過進一步比較DAPI染色的熒光顯微結果, 我們發現0.85 mg/mL以上的白芍提取物終濃度無法使細胞核顯示藍色熒光, 這意味著高濃度的白芍提取物有可能對造血組織細胞的細胞核也產生了損傷。綜合以上, 本次選用終濃度為0.85 mg/mL的白芍提取物作為后續評估的實驗用濃度。

qRT-PCR結果顯示添加0.85 mg/mL的白芍提取物能夠誘導造血組織細胞的mRNA表達量發生變化, 主要變現為各時間點該基因表達量的顯著提高。與初始表達量相比, 在添加0.85 mg/mL的白芍提取物后, 該基因的表達量顯著提高并在最高值時達到了初始時的8.73倍。Astakine作為一種新發現的造血因子, 由Lin與S?derh?ll等人首次從北美淡水鰲蝦中發現(Lin, 2011a), 并被證實與甲殼動物血細胞的增殖和分化息息相關(Lin, 2010)。與細胞實驗結果相似的是, 在飼喂含有白芍提取物的飼料后, 中華絨螯蟹造血組織的mRNA表達量相對對照組也有升高。同樣地, 免疫熒光檢測結果也顯示飼喂含有白芍提取物的飼料的中華絨螯蟹造血組織含有更強的Astakine蛋白熒光信號, 這說明白芍能夠誘導蟹造血組織中釋放造血因子。進一步通過評估造血組織體重百分比和組織切片, 我們發現白芍提取物對造血組織發育有明顯的促進作用, 實驗組造血組織體重比較飼喂前提高了6.64%, 而對照組僅提高了1.6%, 且實驗組造血組織含有較多的卵形小葉。血細胞是甲殼動物免疫功能主要載體, 能夠行使包括吞噬、包囊、黑化和裂解外來病原菌等多種生物學功能(Jiravanichpaisal, 2006)。我們前期的研究結果顯示用脂多糖、嗜水氣單胞菌和枯草芽孢桿菌注射中華絨螯蟹, 能夠導致蟹的血細胞數量急劇下降, 后又緩慢恢復(Lv, 2014)。這個現象說明外來刺激在導致血細胞數量下降的同時可能也會誘導血細胞的增殖和釋放。S?derh?ll(2016)推測該過程主要包括3部分, 分別是血細胞干細胞的增殖、分化和釋放, 成熟的血細胞會從造血組織卵形的小葉中釋放并進入開放的血淋巴循環系統(Lin, 2011a)。雖然目前尚無關于白芍對甲殼動物造血組織影響的報道, 但高等動物關于造血因子的研究發現可以佐證我們的實驗結果。Fang等(2013)研究發現含有白芍的植物提取物可以顯著提高血細胞生成相關通路基因的表達量, 主要是造血因子。Zhu等(2016)也發現含有白芍的植物提取物促進了小鼠骨髓基質細胞和血淋巴中的白細胞數量。脂多糖是一類革蘭氏陰性細菌細胞壁的免疫刺激物, 能夠誘導中華絨螯蟹血細胞的急劇下降, 甚至死亡(Lv, 2014)。本研究發現飼喂含有白芍提取物飼料的中華絨螯蟹對脂多糖的耐受力要優于對照組, 主要表現為蟹的成活率較高, 以上說明白芍提取物可能提高了蟹對脂多糖急性刺激的抗性。

圖4 €造血組織Astakine蛋白的定位及熒光強度

注: DAPI標記為細胞核染色的藍色熒光; FITC綠色熒光信號為Astakine蛋白; 紅色矩形框標注的為造血組織卵形小葉; 紅色箭頭指示的為強熒光信號的Astakine蛋白

表2 白芍提取物對中華絨螯蟹抗脂多糖刺激的影響

Tab.2 Effect of RPA extraction on the E. sinensis against acute LPS stimulation

4 結論

本研究以中華絨螯蟹為實驗對象, 初步探索了白芍提取物對甲殼類造血組織及造血因子Astakine的影響。結果顯示在細胞培養基中添加低濃度(0.85 mg/mL)的白芍提取物可以提高造血組織細胞mRNA的表達量。同樣地, 用含1%白芍提取物的飼料飼喂中華絨螯蟹也提高了中華絨螯蟹造血組織的mRNA和蛋白的表達量, 而且實驗組造血組織相較對照組也有明顯變化, 主要變現為組織增大及組織內卵形小葉數量增多。另外, 本研究還發現飼喂含白芍提取物的飼料可以提高蟹對脂多糖急性刺激的抗性。以上研究結果表明白芍提取物對中華絨螯蟹造血因子表達及造血組織發育有一定促進作用, 該結果可為其他甲殼動物造血組織的發育及免疫增強劑的篩選提供參考。

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EFFECTS OFEXTRACTION ON HEMATOPOIETIC TISSUE AND HEMATOPOIETIC FACTOR ASTAKINE IN

LYU Sun-Jian1, JIAO Jin-Biao2, LIU Li3, YUAN Xue-Mei1, YU Zhe1,ZHANG Hai-Qi1, HANG Xiao-Ying1, SHI Wei-Da1, WU Ying-Lei1

(1. Key Laboratory of Fish,Health and Nutrition of Zhejiang Province,Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, China; 2. College of Fisheries,Southwest University, Chongqing 400715, China; 3. Institute of Hydrobiology,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021, China)

Hematopoietic tissue (HPT) is responsible for crustacean haemocytes proliferation, and it can be generally released into hemolymph. At present, no research about the effect of plant herbs on HPT development has been reported. Among widely used immunopotentiator candidate of plant herbs,(RPA) is a major species that can be used for the preparation of blood nourishment medication. Therefore, we studied the effects of RPA on theHPT in combination with analysis of HPT cytokine Astakine and HPT development. The results indicate that the final RPA concentration of 0.85 mg/mL significantly up-regulated themRNA expression in the HPT cells (<0.05). In addition, RPA-containing commercial feed up-regulated themRNA expression of HPT to 10.5 folds as compared to its initial level. In the immunofluorescence assay, we observed the expression of Astakine protein in HPT in RPA group. As indicated by the morphological observation and hematopoietic tissue body percentage evaluation, the HPT in RPA-fed crab contained more ovoid lobules and the hematopoietic tissue body percentage was increased by 6.64%, while only by 1.6% in the control. Furthermore, as shown in the lipopolysaccharide challenge experiment, the survival rate (77.5%) in RPA feeding group was higher that than that of the control group (57.5%). Therefore, the RPA could boost the Astakine expression, promote the HPT development, and further improve the immune system function.

extraction;; hematopoietic tissue; hematopoietic factor

* 湖州市公益項目, 2018GZ16號; 浙江省科研院所扶持專項, 2020YSZX002號, 2020YSZX010號。呂孫建, 助理研究員, E-mail: lvsunjian@163.com

張海琪, 碩士生導師, 正高級工程師, E-mail: zmk407@126.com

2020-09-09,

2020-10-17

S945

10.11693/hyhz20200900251