羥基紅花黃色素A對高糖誘導RAW264.7巨噬細胞M 1/M 2表型轉化的影響作用①

鄭 丹 趙笑蕓 申達月 張曦瀾 李元平 廖 暉

（山西醫科大學附屬人民醫院藥學部，太原030012）

紅花具有活血通經、祛瘀止痛的功效，羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）是紅花的主要活性成分，在抗炎、抗腫瘤、抗氧化等方面發揮重要的藥理作用［1-2］。課題組前期研究發現，含有HSYA的紅花提取物能夠抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的RAW264.7巨噬細胞產生一氧化氮（nitric oxide，NO）及IL-1β［3］。

巨噬細胞是重要的免疫細胞，在機體內發揮防御、監視、調節、提呈抗原及清除病原體和介導炎癥反應的作用。巨噬細胞在不同情況下可以轉化為M1、M2等不同表型，在炎癥反應中分別發揮損傷及保護的不同作用［4］。在LPS、高糖等的誘導下，巨噬細胞向M1型轉化增加，IL-1β、TNF-α等炎癥因子大量產生，同時M2型減少［5］。

本研究利用高糖作用于巨噬細胞［6］，觀察M1型極化的標志物TNF-α、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）及M2型極化標志物CD206、精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）蛋白表達的變化，探究HSYA對高糖誘導的巨噬細胞表型轉化及NO、IL-1β等炎癥因子的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠巨噬細胞系RAW264.7為Absin生物技術公司（中國上海）提供。RPMI1640培養基、雙抗（Gibco）；胎牛血清（FBS）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5×（變性）、Western blot膜再生液、兔抗Arg-1、兔抗iNOS、兔抗CD206、兔抗TNF-α購于武漢博士德生物工程有限公司；HSYA購于中國食品藥品檢定研究院；二甲基亞砜（DMSO）、LPS、葡萄糖（D-glucose）、RIPA組織細胞裂解液、ECL Plus超敏發光液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于北京索萊寶公司；GAPDH，山羊抗兔二抗，山羊抗鼠二抗均購于武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細胞培養 小鼠巨噬細胞系RAW264.7培養于含有10%FBS、100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中貼壁生長。待細胞長到80%～90%時，對細胞進行傳代分瓶培養。

1.2.2 確定誘導巨噬細胞M1型轉化的高糖濃度以11.1、25.0、33.3、44.4 mmol/L葡萄糖分別培養巨噬細胞，其中11.1 mmol/L組為正常葡萄糖對照組，其余3組為高糖模型組，0.5μg/ml LPS（溶于DMSO溶液）作為模型對照［3］。各組培養時間分別為12 h、24 h。收集各組上清液，Griess法測定上清液中NO的代謝產物亞硝酸鹽（NO2-）含量，篩選出可誘導巨噬細胞向M1型轉化的高糖濃度。

1.2.3 確定HSYA在高糖中的安全作用濃度 將RAW264.7細胞按1×104個/孔接種于96孔板。37℃、5%CO2條件下培養24 h后，棄培養基，重新加入200μl含有不同濃度HSYA的培養基（含33.3 mmol/L葡萄糖），濃度分別為50、100、200、400μmol/L，繼續培養18 h，棄上清，加入200μl新鮮培養基，再加入20μl CCK-8試劑，37℃孵育后，于酶標儀450 nm條件下測定吸光度（OD）值。根據以下公式計算：RAW264.7細胞生存率（%）＝1-（A溶劑對照-A各樣品）/A溶劑對照×100%，篩選出HSYA的安全作用濃度。

1.2.4 Western blot檢 測TNF-α、iNOS、CD206、Arg-1的蛋白表達 生長狀態良好的細胞以1×106個/孔接種于6孔板，培養24 h后，將實驗分為4組，HSYA（100、200μmol/L）加入RAW264.7細胞作用2 h，再加入葡萄糖，使終濃度為33.3 mmol/L。同時設33.3 mmol/L高糖模型組及11.1 mmol/L正常對照組，24 h后分別收集細胞及上清液。提取所收取的細胞蛋白，BCA試劑盒檢測總蛋白濃度。取50μg待測蛋白樣品，10%SDS-PAGE分離蛋白，轉膜并封閉后，加入TNF-α、iNOS、CD206、Arg-1、GAPDH一抗，4℃孵育過夜，洗膜，加入二抗于37℃孵育2 h，洗膜，加入ECL顯色液，置于凝膠成像儀中觀察并分析結果，以GAPDH作為內參。

1.2.5 細胞上清液IL-1β及NO2-含量的測定 收集1.2.4中各組細胞上清液，ELISA試劑盒測定IL-1β，Griess法測定NO2-含量。

1.3 統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行統計學分析，兩兩比較采用獨立t檢驗。數值資料以±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 確定誘導M1型極化的高糖濃度 與DMSO溶劑對照組相比，LPS作用于巨噬細胞12 h及24 h后，NO2-含量均顯著升高［（5.9±0.4）μmol/L vs（38.2±1.7）μmol/L，P＜0.05，及（6.0±0.6）μmol/L vs（45.0±1.1）μmol/L，P＜0.05］。25.0 mmol/L高糖作用于巨噬細胞12 h與24 h后，NO2-含量與11.1 mmol/L葡萄糖對照組相比，均未顯著增加。33.3 mmol/L高糖及44.4 mmol/L高糖作用24 h的NO2-含量均顯著高于12 h［33.3 mmol/L：（40.7±2.8）μmol/L vs（17.2±0.9）μmol/L，P＜0.05，及44.4 mmol/L：（41.2±3.4）μmol/L vs（23.8±1.0）μmol/L，P＜0.05］。33.3 mmol/L高 糖 與44.4 mmol/L高糖作用24 h的NO2-含量無顯著性差異，因此，最終選擇33.3 mmol/L高糖濃度作用24 h作為誘導RAW264.7細胞向M1型極化模型建立的最佳條件（表1）。

2.2 HSYA對RAW264.7細胞生存率的影響 與對照組相比，HSYA濃度在50、100、200、400μmol/L時的細胞存活率分別為97.6%、97.8%、98.0%、86.6%，結果見圖1。HSYA濃度在50～200μmol/L時，對RAW264.7細胞的致死率均小于5%，可認為以上濃度不會對細胞的生長產生影響[7]。

表1 葡萄糖濃度對RAW264.7細胞產生NO的影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of glucose concentration on NO production in RAW264.7 cells（±s，n=6）

表1 葡萄糖濃度對RAW264.7細胞產生NO的影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of glucose concentration on NO production in RAW264.7 cells（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05，LPSmodel group vs DMSOcontrol group at 12 h；2）P＜0.05，LPS model group vs DMSO control group at 24 h；3）P＜0.05，33.3 mmol/L and 44.4 mmol/L high glucose group vs 11.1 mmol/Lcontrol group at 12 h；4）P＜0.05，33.3 mmol/L and 44.4 mmol/Lhigh glucosegroup vs11.1 mmol/L control group at 24 h；5）P＜0.05，33.3 mmol/Lhigh glucosegroup at 24h vs12h；6）P＜0.05，44.4mmol/Lhighglucosegroup at24hvs12h.

Groups DMSOsolvent control LPSmodel control 11.1 mmol/L glucose control 25.0 mmol/L glucose 33.3 mmol/L glucose 44.4 mmol/L glucose-（μmol/L）12 h 5.9±0.4 38.2±1.71）6.1±1.2 6.7±1.7 17.2±0.93）23.8±1.03）NO2 24 h 6.0±0.6 45.0±1.12）5.9±1.1 6.5±1.0 40.7±2.84）5）41.2±3.44）6）

圖1 HSYA對RAW264.7細胞生存率的影響Fig.1 Effect of HSYA on survival rate of RAW264.7 cells

2.3 HSYA對高糖誘導RAW264.7細胞M1型/M2型分型的影響作用 如圖2所示，與11.1 mmol/L對照組相比，33.3 mmol/L高糖模型組的TNF-α、iNOS蛋白表達增加，Arg-1、CD206表達減少，其中以TNF-α、iNOS及Arg-1的蛋白表達差異顯著（P＜0.05）。與33.3 mmol/L高糖模型組相比，100、200μmol/L的HSYA均可顯著上調Arg-1蛋白表達而下調TNF-α、iNOS蛋白表達（P＜0.05），同時HSYA增加Arg-1的作用在200μmol/L時顯著優于100μmol/L時（P＜0.05）。

圖2 HSYA對高糖誘導RAW 264.7細胞M1/M 2極化的影響作用Fig.2 Effect of HSYA on M 1/M 2 polarization induced by high glucose in RAW264.7 cells

表2 HSYA對高糖誘導RAW 264.7細胞NO和IL-1β的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of HSYA on production of NO and iIL-1βin RAW 264.7 cells induced by high glucose（±s，n=6）

表2 HSYA對高糖誘導RAW 264.7細胞NO和IL-1β的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of HSYA on production of NO and iIL-1βin RAW 264.7 cells induced by high glucose（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05，content of nitrite NO2-at 33.3 mmol/L high glucose model group vs 11.1 mmol/L control group；2）P＜0.05，content of NO2-at 100 and 200μmol/L HSYA group vs 33.3 mmol/L high glucose model group；3）P＜0.05，content of IL-1βat 33.3 mmol/L high glucose model group vs 11.1 mmol/L control group；4）P＜0.05，content of IL-1βat 100 and 200μmol/L HSYA group vs 33.3 mmol/L high glucose model group；5）P＜0.05，content of IL-1βat 200μmol/L HSYA group vs 100μmol/LHSYA group.

-Groups NO2 NOinhibition rate（%）IL-1βinhibition rate（%）11.1 mmol/Lglucosecontrol 33.3 mmol/L glucose model 33.3 mmol/L glucose+100μmol/L HSYA 33.3 mmol/L glucose+200μmol/L HSYA（μmol/L）5.9±1.1 40.7±2.81）28.4±2.52）25.2±1.62）- -- -IL-1β（pg/ml）14.7±0.2 69.4±4.63）35.3±2.94）25.9±1.94）5）61.8±8.6 79.2±3.9 35.4±6.3 44.0±8.9

2.4 HSYA對HG誘導RAW264.7細胞產生NO及IL-1β的影響作用 由表2可知，與11.1 mmol/L組相比，33.3 mmol/L高糖組的NO2-含量由（5.9±1.1）μmol/L增加至（40.7±2.8）μmol/L，IL-1β的含量由（14.7±0.2）pg/ml增加至（69.4±4.6）pg/ml，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。與33.3 mmol/L高糖組相比，HSYA在100、200μmol/L時，均可顯著抑制NO2-及IL-1β產生（P＜0.05）。200μmol/L HS-YA抑制NO2-的作用與100μmol/L相比差異無統計學意義，但對IL-1β的抑制作用差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是心腦血管疾病、腎臟疾病等多種慢性病的主要危險因素。中國研究者者近期發表在《新英格蘭醫學雜志》和《美國醫學會雜志》上的研究顯示，我國成年人DM和DM前期的患病率近年呈不斷攀升趨勢，DM已成為影響我國居民健康的重大公共衛生問題之一［8］。中藥在DM的治療中發揮重要作用，基于755首中藥處方治療DM用藥規律研究顯示，在DM的治療中，有3大類中藥發揮重要作用：補虛藥如黃芪，清熱藥如黃連，活血化瘀藥如紅花等［9］。動物試驗顯示，以四尿嘧啶制作DM模型，口服紅花提取物后，與格列本脲治療組無著差異，提示紅花在DM治療中具有潛力［10-11］。目前，紅花中的主要藥效物質HSYA在治療DM及其并發癥的研究中取得了一定進展，研究認為，HSYA治療DM的作用與其抗炎作用相關［12-13］。

巨噬細胞參與的體內慢性炎癥是Ⅱ型DM、動脈粥樣硬化等代謝性疾病的共同機制［14］。研究顯示，巨噬細胞受外界微環境變化影響，可在疾病的發生發展中分別發揮促炎及抗炎作用。巨噬細胞功能上的改變與巨噬細胞極化至不同亞型相關：極化至M1型參與炎癥反應，而極化至M2型參與抗炎過程。現代醫學研究認為，巨噬細胞M1/M2型極化失調是DM等疾病的核心發病機制［15］。進一步研究HSYA對高糖誘導的M1/M2型極化失調的作用，對HSYA治療DM具有一定的臨床指導意義。

課題組的前期研究顯示，以0.5μg/ml LPS作用于巨噬細胞后，NO的大量產生與巨噬細胞極化至M1型相關［3］。本研究以LPS為模型對照，比較巨噬細胞在25.0、33.3、44.4 mmol/L等不同葡萄糖濃度時NO代謝產物NO2-的含量。研究結果顯示，以33.3 mmol/L高糖誘導巨噬細胞，在NO2-含量顯著增加的同時，M1型極化標志物TNF-α、iNOS的蛋白表達顯著增加，M2型極化標志物CD206、Arg-1的蛋白表達均減少。研究同時顯示，HSYA具有體外調整高糖狀態時M1/M2型極化失調的作用，即上調保護型的M2型，并下調損傷型的M1型。

高血糖可刺激DM模型大鼠的氧自由基大量產生，引起細胞增殖、凋亡調控紊亂，DM發病過程中iNOS及TNF-α表達增加，NO產生增多，導致胰島微血管內皮細胞（IMECs）受損；IMECs的損傷也是高血糖條件下促炎細胞因子IL-1β的來源［16］。課題組進一步的研究顯示，HSYA具有體外減少高糖誘導的NO及IL-1β產生的作用。

綜上，HSYA具有調整高糖狀態時巨噬細胞M1/M2型極化失調、減少NO、IL-1β等炎癥因子生成的作用。有研究顯示，HSYA抑制炎癥反應的作用與體內的NF-κB信號通路相關［17］。課題組將從高糖誘導巨噬細胞分型，進而影響NF-κB信號通路開展HSYA的相關體內研究。