基于TLR4/MyD88/NF-κB信號通路探討黃芪多糖對肺癌小鼠免疫功能的影響及對Th1/Th2的調節作用①

劉艷玲 袁 娟 郭 敏 張延鋒 陸君君 曹 巍

（新鄉醫學院第三附屬醫院呼吸內科，新鄉453003）

肺癌在全球惡性腫瘤發病率和病死率中位居第一，盡管新的診斷和治療方法不斷發展，但每年仍有約210萬例患者被確診為肺癌，約180萬例死亡病例［1］。研究表明，免疫功能紊亂是肺癌發生的重要基礎，多數惡性腫瘤患者存在免疫功能紊亂，其中Th1和Th2細胞失衡可引發免疫逃避，是腫瘤發生的重要機制［2-3］。隨著腫瘤與免疫功能關系的研究深入，腫瘤免疫治療成為放化療和手術治療之外的重要治療手段，改善腫瘤患者的免疫功能狀態是肺癌防治的關鍵。黃芪是我國傳統中草藥，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，含有黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）、黃芪黃酮和黃芪皂苷等成分［4］。APS是黃芪的主要水溶性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病、調節機體免疫功能等多種功效，是有效的抗腫瘤藥物和免疫調節劑，廣泛應用于臨床［5-6］。Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）在識別病原體和激活先天免疫系統中起重要作用，Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）是第一個被鑒定的TLR蛋白，可識別革蘭氏陽性菌脂多糖［7］。TLR4信號通路的關鍵分子包括TLR4、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）等，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活可導致Th1/Th2免疫失衡，加快炎癥發展［8］。研究報道，APS可直接作用于巨噬細胞表面TLR4，可通過TLR4介導MAPKs和NF-κB活化誘導RAW264.7細胞分泌細胞因子［9-10］。但APS對肺癌患者是否通過TLR4信號通路發揮免疫調節和抗腫瘤作用尚未明確。本研究采用C57BL/6J野生型（TLR4+/+）和TLR4基因敲除（TLR4-/-）小鼠構建Lewis小鼠肺癌模型，以TLR4/MyD88/NF-κB信號通路為切入點，觀察APS對Lewis肺癌小鼠的腫瘤抑制作用和免疫功能的影響及其對Th1/Th2的調節作用，初步探究其作用機制，為肺癌臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞 SPF級C57BL/6J野生型（TLR4+/+）小鼠50只（北京維通利華實驗動物技術有限公司）；TLR4-/-小鼠50只（美國Jackson實驗室），6～8周齡，體重18～22 g，雌雄各半。實驗動物及飼養條件符合《實驗動物管理條例》要求。Lewis肺癌細胞株購自中科院上海細胞庫，培養于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，5%CO2、37℃，每2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗，研究方案獲我院倫理委員會批準。

1.1.2 試劑與儀器 APS（上海一基實業有限公司，純度＞90%）；注射用順鉑（齊魯制藥）；RPMI1640培養基、胎牛血清（美國Gibco公司）；紅細胞裂解液、HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo Scientific）；引物（日本TaKaRa）；CD3、CD4、CD8a大鼠抗小鼠單抗（美國BD公司）；IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；TLR4、MyD88、NF-κBp65兔源單克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；超凈工作臺、Multiskan MK3酶標儀；AE223電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）；IX53顯微鏡（日本奧林巴斯）；TGL16MB高速冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 C57BL/6J野生型（WT）TLR4+/+和TLR4-/-小鼠各隨機分為模型組、順鉑組、APS高、中、低劑量組，每組10 TLR+/+，分別建立Lewis肺癌移植瘤模型。收集對數生長期Lewis肺癌細胞，生理鹽水重懸，調整細胞濃度為1×107個/ml，皮下注射于小鼠右前肢腋窩，0.2 ml/只，接種第7天小鼠右側腋下可觸到黃豆大小腫塊提示造模成功。

1.2.2 給藥方法 造模第2天，APS高、中、低劑量組小鼠灌胃給予400、200、100 mg/kg APS溶液（臨用前蒸餾水配制），0.2 ml/10 g，模型組小鼠灌胃給予等量蒸餾水，1次/d，連續14 d；順鉑組小鼠腹腔注射順鉑注射液（3 mg/kg），200μl/20 g，1次/d，連續3 d。

1.2.3 腫瘤抑制率、胸腺指數和脾指數測定 最后1次給藥后2 h處死小鼠，稱重，分離小鼠腫瘤組織、胸腺，稱重。超凈臺中分離小鼠脾組織，稱重。腫瘤抑制率=（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%；胸腺指數（mg/g）=胸腺質量（mg）/體重（g）；脾指數（mg/g）=脾質量（mg）/體重（g）。

1.2.4 HE染色檢測各組小鼠腫瘤組織病理變化分離小鼠腫瘤組織，多聚甲醛固定48 h，洗凈，梯度乙醇脫水，制作肺組織蠟塊，冰上預冷，切片（4μm），置于載玻片，二甲苯脫蠟30 min，梯度乙醇復水，蘇木精和伊紅染液分別對細胞核和細胞質染色，脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察各組小鼠腫瘤組織病理變化。

1.2.5 流式細胞術檢測小鼠脾淋巴細胞亞群水平 無菌環境下分離小鼠脾組織，剪碎，置于70μm細胞篩網中研磨，至組織塊全部通過篩網，收集組織懸液，300 g離心5 min，棄上清，加入3倍體積紅細胞裂解液冰上裂解5～10 min，300 g離心5 min，棄上清，含5%胎牛血清的RPMI1640培養基重懸，重復洗滌、離心2次，培養基重懸，調整細胞濃度為1×107個/ml。取小鼠脾淋巴細胞懸液加入流式管，100μl/管，加入熒光標記的CD3、CD4、CD8a單抗，混勻，室溫避光孵育20 min，加入2 ml PBS緩沖液，300 g離心5 min，棄上清，加入0.5 ml PBS緩沖液重懸，流式細胞儀檢測脾淋巴細胞亞群水平。

1.2.6 ELISA試劑盒檢測小鼠脾組織Th1和Th2細胞因子含量 稱取各組小鼠脾組織置于組織勻漿器中，加入預冷的PBS緩沖液（1∶5）充分研磨，5 000 g離心10 min，收集上清。取各組待測樣品加入反應孔，100μl/孔，每組分別設4個復孔，37℃孵育90 min，棄孔內液體，加入100μl生物素化抗體工作液，37℃孵育60 min，棄孔內液體，洗滌3次，加入100μl酶結合物工作液，37℃孵育30 min，棄孔內液體，洗滌5次，90μl/孔加入底物溶液，37℃孵育15 min，加入50μl終止液，450 nm波長處檢測，根據標準曲線計算各組小鼠脾組織中IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10含量。

1.2.7 Western blot檢測腫瘤組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關蛋白表達 取0.1 g小鼠腫瘤組織剪碎后冰上研磨，離心取沉淀，加入裂解液提取肺組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，80 V電泳2 h，60 V轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，放入10 ml TLR4、MyD88、NF-κB p65兔源一抗稀釋液（1∶1 000）中，4℃孵育12 h，第2天用TBST緩沖液清洗3次，10 min/次，加入羊抗兔二抗（1∶2 000）中，37℃孵育2 h，TBST緩沖液清洗3次，ECL發光，反應1 min后置于凝膠成像系統顯影。以GAPDH為內參，Image J軟件分析各蛋白灰度值，計算蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.2.8 qRT-PCR檢測腫瘤組織TLR4、MyD88、NFκB mRNA表達 稱取0.1 g小鼠腫瘤組織，冰上研磨，加入1 ml Trizol裂解液提取總RNA，RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒合成cDNA。引物由日本TaKaRa公司設計合成，以GAPDH為內參。反應體系：dNTPs 0.5μl+5×Buffer 2.5μl+Taq酶0.3μl+MgCl21.5μl+cDNA模板2μl+上下游引物分別1μl，加去離子水至總體積為25μl。反應條件：95℃5 min，95℃30 s、62℃30 s、72℃30 s，共40個循環，72℃延伸10 min，4℃5 min終止反應，2-ΔΔCt法計算，實驗重復3次，引物序列見表1。

1.3 統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行統計學分析，GraphPad Prism 8.0繪制圖片，計量資料以±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 APS對Lewis肺癌小鼠腫瘤抑制率、腫瘤瘤質量、胸腺指數和脾指數的影響 順鉑組、APS高、中、低劑量組小鼠腫瘤抑制率分別為47.27%、45.00%、38.64%、30.00%；與模型組相比，順鉑組、APS高、中、低劑量組小鼠腫瘤質量顯著降低，順鉑組小鼠胸腺指數和脾指數顯著降低，APS高、中劑量組小鼠胸腺指數和脾指數顯著升高，低劑量組小鼠胸腺指數和脾指數變化無統計學意義；與順鉑組相比，APS高劑量組小鼠腫瘤質量變化無統計學意義，中、低劑量組小鼠腫瘤質量高于順鉑組，APS高、中、低劑量組小鼠胸腺指數和脾指數顯著升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05，圖1）。

2.2 APS對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織病理學變化的影響 HE染色結果顯示，模型組小鼠腫瘤組織細胞質和細胞核輪廓清晰，細胞核較大，顏色深，生長旺盛，無壞死現象，可見血管新生；與模型組相比，順鉑組小鼠腫瘤組織細胞出現大面積壞死區域，細胞核固縮；APS各組小鼠腫瘤組織出現不同程度和不同面積的片狀細胞壞死區域，細胞核固縮，新生血管減少，且呈劑量依賴性（圖2）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.3 APS對Lewis肺癌小鼠脾淋巴細胞亞群的影響 與模型組相比，順鉑組小鼠脾淋巴細胞亞群水平變化無統計學意義，APS高、中劑量組小鼠CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞水平顯著升高，APS高劑量組CD4+/CD8+比值升高（P＜0.05）；與順鉑組相比，APS高、中劑量組小鼠CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞水平升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05），CD4+/CD8+比值差異無統計學意義（P＞0.05，圖3）。

2.4 APS對Lewis肺癌小鼠脾組織Th1/Th2細胞因子水平的影響 與模型組相比，順鉑組小鼠脾組織IL-2和IFN-γ含量降低，IL-4和IL-10含量升高，APS高、中、低劑量組小鼠脾組織IL-2和IFN-γ含量顯著升高，IL-4和IL-10含量顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與順鉑組相比，APS高、中、低劑量組小鼠脾組織IL-2和IFN-γ含量顯著升高，IL-4和IL-10含量顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05，圖4）。

圖1 各組Lewis肺癌小鼠腫瘤質量、胸腺指數和脾指數比較Fig.1 Comparison of tumor weight，thymus index and spleen index of Lewis lung cancer mice in each group

圖2 APS對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織病理學變化的影響（×400）Fig.2 Effect of APSon pathological changes of tumor tissues of Lewis lung cancer mice（×400）

圖3 各組Lewis肺癌小鼠脾淋巴細胞亞群水平比較Fig.3 Comparison of levels of splenic lymphocyte subsets in Lewis lung cancer mice

圖4 各組小鼠脾組織Th1和Th2細胞因子含量比較Fig.4 Comparison of Th1 and Th2 cytokines in spleen tissues of mice in each group

圖5 各組Lewis肺癌小鼠腫瘤組織TLR4，MyD88，NFκB表達Fig.5 Expressions of TLR4，MyD88 and NF-κB proteins in Lewislung cancer mice

圖6 各組小鼠脾組織Th1和Th2細胞因子含量比較Fig.6 Comparison of Th1 and Th2 cytokines in spleen tissues of mice in each group

2.5 TLR4/MyD88/NF-κB信號通路介導APS抗腫瘤和免疫調節作用 為鑒定APS是否通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路發揮抗腫瘤和免疫調節作用，課題組采用APS處理TLR4+/+和TLR4-/-Lewis肺癌小鼠，觀察不同濃度APS對2種類型小鼠腫瘤瘤組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關蛋白和mRNA表達的影響及對小鼠脾組織Th1/Th2細胞因子水平的影響。Western blot和qRT-PCR結果顯示，與模型組相比，順鉑組、APS高、中、低劑量組TLR4+/+小鼠腫瘤組織中TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白和mRNA表達降低，與順鉑組相比，APS高、中劑量組小鼠腫瘤組織中TLR4表達差異無統計學意義，低劑量組小鼠腫瘤組織中TLR4表達高于順鉑組，高劑量組小鼠MyD88和NF-κBp65表達降低，中劑量組小鼠MyD88和NF-κBp65表達差異無統計學意義，低劑量組小鼠MyD88和NF-κB p65表達顯著高于順鉑組（P＜0.05）。相反的是，與模型組相比，順鉑組TLR4-/-小鼠腫瘤組織中TLR4、MyD88和NFκB p65表達降低，但APS高、中、低劑量組小鼠腫瘤組織中TLR4、MyD88和NF-κBp65表達差異無統計學意義（P＞0.05，圖5）。ELISA檢測結果顯示，與模型組相比，順鉑組TLR4+/+小鼠IL-2和IFN-γ含量降低，IL-4和IL-10含量升高，APS高、中、低劑量組IL-2和IFN-γ含量顯著升高，IL-4和IL-10含量顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。與TLR4+/+小鼠相反，與模型組相比，順鉑組TLR4-/-小鼠IL-2和IFN-γ含量降低，IL-4和IL-10含量升高，而APS高、中、低劑量組小鼠IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10含量差異無統計學意義，且APS高、中、低劑量組TLR4-/-小鼠IL-2和IFN-γ含量均低于TLR4+/+小鼠相應APS治療組，IL-4和IL-10含量均高于TLR4+/+小鼠相應APS治療組（P＜0.05，圖6）。

3 討論

肺癌是全球范圍發病率和病死率最高的惡性腫瘤，大部分肺癌患者在首診時已為晚期，化療是肺癌患者，尤其是晚期肺癌患者的主要治療方案［11-12］。化療藥物在殺死腫瘤細胞的同時導致人體免疫功能下降，損傷免疫器官，因此，免疫治療已成為放化療和手術治療之外的重要治療手段［13］。研究表明，中藥及其有效成分可通過提高腫瘤患者免疫功能干擾腫瘤細胞增殖和代謝過程，促進其凋亡［14］。APS是黃芪的主要有效成分，在體內和體外均可抑制肺癌細胞增殖，改善化療所致的免疫功能低下，對化療具有減毒增效作用，但具體作用機制尚不明確［15］。TLR4/MyD88/NF-κB信號通路活化多發生于炎癥和免疫反應，與惡性腫瘤細胞增殖和遷移能力呈正相關［16］。推測APS可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路調控肺癌小鼠免疫功能，產生抗腫瘤作用。因此，本研究以TLR4/MyD88/NF-κB信號通路為切入點，觀察APS對肺癌小鼠免疫功能的影響并初步探究其作用機制。

目前，APS已被廣泛用于癌癥患者的補充和替代治 療［17-18］。YE等［19］報 道，APS可抑制 乳 腺癌MDA-MB-468細胞生長并增強順鉑療效。YANG等［20］通過小鼠H22肝癌異種移植瘤模型研究APS對肝癌的抗腫瘤和免疫調節活性發現，APS通過改善機體免疫應答發揮抗腫瘤活性，改善小鼠胸腺指數和脾指數，提高巨噬細胞吞噬功能。本研究中，順鉑組、APS、中、低劑量組小鼠的腫瘤抑制率分別為47.27%、45.00%、38.64%、30.00%，與模型組相比，APS劑量依賴性抑制Lewis肺癌移植瘤生長，高劑量APS腫瘤抑制作用與順鉑差異無統計學意義，表明APS具有顯著抗Lewis肺癌作用，與既往研究結果相似。胸腺和脾是人體重要免疫器官，也是T淋巴細胞成熟和分化的場所，胸腺指數和脾指數是衡量機體免疫功能的重要指標［21］。T淋巴細胞主要介導細胞免疫，CD3+T細胞代表總T細胞水平，主要反映機體細胞免疫狀態，根據細胞表面標志物不同，T淋巴細胞分為CD4+T和CD8+T淋巴細胞2個主要亞群，CD4+T淋巴細胞可提高免疫功能，CD8+T淋巴細胞則相反，CD4+T和CD8+T淋巴細胞在正常機體中處于動態平衡，當平衡被打破，機體免疫功能則出現紊亂［22］。研究表明，APS可提高乳腺癌荷瘤小鼠的胸腺指數和脾指數，并提高巨噬細胞分泌免疫調節因子的能力［23］。本研究中，APS可呈劑量依賴性提高小鼠胸腺指數和脾指數，提高CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞水平和CD4+/CD8+比值，表明APS可顯著提高肺癌小鼠免疫功能。輔助性T細胞（helper Tcells，Th）是機體重要的免疫調節細胞，包括Th1和Th2 2個亞型，正常情況下，機體Th1/Th2處于動態平衡，但惡性腫瘤患者體內Th2型細胞因子分泌增多，出現Th1/Th2漂移現象，導致Th1/Th2失衡［24］。WU等［25］研究發現，黃芪單獨或與其他藥物聯用可恢復肺癌小鼠血清Th1細胞因子優勢，抑制腫瘤生長并延長生存期。本研究中，與模型組相比，順鉑組小鼠脾組織中Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ含量降低，Th2型細胞因子IL-4和IL-10含量升高，APS高、中、低劑量組小鼠脾組織IL-2和IFN-γ含量顯著升高，IL-4和IL-10含量顯著降低，且呈劑量依賴性，表明APS可逆轉Th1/Th2漂移，恢復Th1/Th2型細胞因子平和，與既往研究結果一致。

MyD88是TLRs家族下游炎癥通路的經典分子，MyD88通過TLR家族成員與IL-1R相關激酶（IRAK）家族相互作用激活NF-κB信號通路，釋放炎癥因子，誘發炎癥反應和免疫反應［8］。DING等［26］研究發現，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路關鍵基因過表達可顯著降低二乙基亞硝胺誘導的肝癌發生率。ZHANG等［27］研究發現，抑制TLR4/NF-κB/MMP-9信號通路可抑制結腸癌細胞增殖，誘導其凋亡，提高caspase-3/9活性。為探究APS是否通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路發揮抗腫瘤和免疫調節作用，課題組分別給予TLR4+/+和TLR4-/-Lewis肺癌小鼠APS，觀察不同濃度APS對2種類型小鼠腫瘤組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響和對Th1/Th2細胞因子水平的影響，結果顯示，在TLR4+/+小鼠中，APS呈劑量依賴性降低小鼠腫瘤組織TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白和mRNA表達，提高脾組織Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ含量，降低Th2型細胞因子IL-4和IL-10含量；與TLR4+/+小鼠相反，在TLR4-/-小鼠中，不同濃度APS組小鼠腫瘤組織中TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白和mRNA表達及脾組織Th1/Th2細胞因子含量與模型組小鼠差異無統計學意義，表明APS可能通過TLR4/MyD88/NF-κB信號途徑發揮抗腫瘤和免疫調節作用。

綜上所述，APS可抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤生長，提高肺癌小鼠免疫功能，逆轉和平衡Th1/Th2漂移現象，其作用機制可能與抑制TLR4/MyD88/NFκB信號通路活化有關。