艾司西酞普蘭對(duì)抑郁模型大鼠腦內(nèi)抑制性氨基酸變化的作用

丁楷模 ，李冰玥 ，張咪咪 ，李國海 ，李素霞

抑郁癥是最普遍的精神疾病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球超過3.4億人受其影響，是全球首要致殘?jiān)蛑唬?dāng)病情嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致患者自殺，每年有近80萬人死于自殺，其中1/3～1/2的自殺者為抑郁癥患者，成為15～29歲年齡組人群的第二大死亡原因，給全球帶來巨大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和不良后果［1-2］。盡管近數(shù)十年來大量的科學(xué)研究對(duì)抑郁癥的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了研究，提出了各種假說。然而，目前為止抑郁癥的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。

研究表明前額葉皮質(zhì)和海馬與情感、認(rèn)知及學(xué)習(xí)、記憶相關(guān)。慢性應(yīng)激可導(dǎo)致內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)和海馬內(nèi)錐體神經(jīng)元減少、突觸功能缺陷，體積縮小等［3-4］，且功能影像學(xué)、深部腦刺激等研究也證明了抑郁癥與前額葉皮質(zhì)和海馬的結(jié)構(gòu)及功能改變有關(guān)［5-6］。臨床研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者腦脊液中γ-氨基丁酸（GABA）水平降低［7］，經(jīng)顱磁刺激研究報(bào)道抑郁癥患者GABA功能下降［8］，腦磁共振波譜（MRS）研究結(jié)果顯示，抑郁癥患者大腦皮質(zhì)區(qū)域GABA水平降低，且緩解期間GABA水平恢復(fù)正常［9］，這些研究結(jié)果均表明GABA功能異常與抑郁發(fā)生有關(guān)。然而，GABA功能異常是否可被抗抑郁劑艾司西酞普蘭扭轉(zhuǎn)，尚未見報(bào)道。假設(shè)慢性應(yīng)激可導(dǎo)致抑制性氨基酸（如GABA）水平發(fā)生變化，而給予艾司西酞普蘭抗抑郁治療可以逆轉(zhuǎn)上述變化。本研究將構(gòu)建慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（CUS）模型，該模型是研究抑郁癥發(fā)病機(jī)制的重要工具，其模擬了現(xiàn)實(shí)生活中人遭遇低水平、紛繁復(fù)雜的慢性應(yīng)激過程，可導(dǎo)致模型大鼠出現(xiàn)快感缺失樣行為及懶言少動(dòng)的遲滯樣行為［10］，是公認(rèn)可靠的抑郁癥模型之一。然后針對(duì)構(gòu)建的CUS模型大鼠給予艾司西酞普蘭治療其抑郁、焦慮樣行為，通過體質(zhì)量增加量、蔗糖偏好測(cè)試（SPT）、曠場(chǎng)測(cè)試（OFT）、高架十字迷宮測(cè)試（EPM）、黑白盒測(cè)試（BWT）評(píng)估大鼠抑郁、焦慮樣行為變化，并采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)研究艾司西酞普蘭對(duì)氨基酸代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 研究時(shí)間 2016年6月—2017年3月。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawly（SD）成年大鼠，雄性，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物部，大鼠體質(zhì)量為220～240 g。動(dòng)物房恒溫、恒濕〔溫度（22±2）℃，濕度（50±10）%〕，采用12 h/12 h晝夜節(jié)律控制（暗周期8：00～20：00）。實(shí)驗(yàn)開始前，動(dòng)物在動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由飲水進(jìn)食。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及干預(yù)措施 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)38只SD大鼠體質(zhì)量為250～270 g，其中18只給予28 d CUS處理為CUS組，20只正常飼養(yǎng)不予CUS處理為對(duì)照組，根據(jù)干預(yù)方法不同將CUS組和對(duì)照組各分出兩亞組，CUS+艾司西酞普蘭組和對(duì)照+艾司西酞普蘭組于第15天開始腹腔注射艾司西酞普蘭（四川科倫藥業(yè)股份有限公司），10 mg/kg，1次/d，連續(xù)14 d，CUS+溶媒組和對(duì)照+溶媒組于第15天開始腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，1 ml/kg，1次/d，連續(xù)14 d，具體實(shí)驗(yàn)流程見圖1，行為學(xué)測(cè)試均在動(dòng)物的暗周期進(jìn)行。本研究獲得北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（LA2016168），實(shí)驗(yàn)程序均符合美國國立衛(wèi)生研究院動(dòng)物研究指南［11］。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Figure 1 Experiment flow chart

1.3.2 CUS建模流程 本實(shí)驗(yàn)慢性應(yīng)激遵循隨機(jī)、不可預(yù)見性原則，每天在不固定的時(shí)間點(diǎn)給予2種不同的應(yīng)激［12］，28 d應(yīng)激方案見表1。

表1 28 d應(yīng)激方案Table 1 A 28-day stress procedure for establishing a rat model of depression

1.3.3 體質(zhì)量增加量 各組大鼠在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)測(cè)體質(zhì)量，在慢性應(yīng)激第28天再次測(cè)體質(zhì)量，體質(zhì)量增加量=第28天體質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)開始時(shí)體質(zhì)量。體質(zhì)量增加量用來評(píng)估大鼠抑郁樣行為，體質(zhì)量增加量越少，說明大鼠抑郁程度越重。

1.3.4 SPT 大鼠經(jīng)過28 d CUS后分籠，單籠飼養(yǎng)，然后進(jìn)行SPT。SPT分為蔗糖適應(yīng)和偏好測(cè)試兩個(gè)階段；第一階段蔗糖適應(yīng)48 h，單籠飼養(yǎng)的大鼠分別給予1瓶純水和1瓶1%蔗糖水，在第24 h時(shí)交換蔗糖水瓶與純水瓶位置；48 h結(jié)束后進(jìn)行第二階段偏好測(cè)試，對(duì)大鼠禁食、禁水4 h后開始測(cè)試，大鼠自由飲水1 h，第30分鐘時(shí)交換蔗糖水瓶與純水瓶位置，測(cè)試前、后分別對(duì)1%蔗糖水量和純水量進(jìn)行稱重。評(píng)價(jià)指標(biāo)包括蔗糖偏好值和總攝入量。蔗糖偏好值=1%蔗糖水?dāng)z入量/（1%蔗糖水?dāng)z入量+純水?dāng)z入量）×100%［12］；總攝入量=1%蔗糖水?dāng)z入量+純水?dāng)z入量。蔗糖偏好值下降可反映大鼠出現(xiàn)類似現(xiàn)實(shí)中抑郁癥患者的核心癥狀之一：快感缺失。

1.3.5 OFT OFT評(píng)價(jià)大鼠的空間探索能力及焦慮樣行為，實(shí)驗(yàn)開始前大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境30 min。實(shí)驗(yàn)裝置為長×寬×高=100 cm×100 cm×45 cm的曠場(chǎng)，底部劃分為25個(gè)面積相等的方格。記錄大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)5 min的自發(fā)活動(dòng)，其中水平運(yùn)動(dòng)距離（爬格數(shù)）反映大鼠的情緒狀態(tài)，如果水平運(yùn)動(dòng)距離降低則反映大鼠出現(xiàn)現(xiàn)實(shí)中抑郁癥患者懶言少動(dòng)癥狀；大鼠在中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間（s）是利用大鼠在空曠環(huán)境下即好奇又擔(dān)心的矛盾沖突心理，如果在中央格停留時(shí)間減少則反映大鼠出現(xiàn)現(xiàn)實(shí)生活中抑郁癥患者伴發(fā)的焦慮狀態(tài)［12］。每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清理排泄物，使用75%乙醇噴灑消除氣味。

1.3.6 EPM EPM是利用大鼠對(duì)新異環(huán)境的探究特性和對(duì)高懸敞開臂的恐懼矛盾沖突心理評(píng)價(jià)大鼠的焦慮狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)開始前大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境30 min。實(shí)驗(yàn)裝置由距離地面50 cm高的一對(duì)開臂（長×寬=50 cm×10 cm）和一對(duì)閉臂（長×寬×高=50 cm×10 cm×30 cm）組成。開臂和閉臂交叉處有一個(gè)10 cm×10 cm的平臺(tái)，將大鼠置于迷宮的平臺(tái)上，頭朝開臂，觀察者距離迷宮中心至少1 m。記錄5 min內(nèi)大鼠進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)及在兩臂停留時(shí)間（以四肢全部入臂或兩只前爪出臂為進(jìn)、出標(biāo)準(zhǔn)）。其中大鼠進(jìn)入開臂停留時(shí)間，作為評(píng)價(jià)焦慮樣行為的指標(biāo)［13］，在開臂停留時(shí)間縮短提示大鼠出現(xiàn)焦慮樣行為。每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清理大鼠排泄物，使用75%乙醇噴灑消除氣味。

1.3.7 BWT BWT評(píng)價(jià)大鼠焦慮樣行為，實(shí)驗(yàn)開始前大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境30 min。實(shí)驗(yàn)裝置由一個(gè)長×寬×高=50 cm×30 cm×50 cm的黑盒和一個(gè)長×寬×高=50 cm×50 cm×50 cm的白盒組成，兩盒之間有一孔徑（10 cm×12 cm）相通，其中黑盒上頂封閉，白盒上頂開放，大鼠可在黑白盒之間自由穿梭，兩盒均裝有攝像頭，記錄大鼠開始放在白盒中間到離開白盒及在黑盒內(nèi)的活動(dòng)軌跡，觀察時(shí)長為15 min。計(jì)算大鼠潛伏期（s）、在白盒停留時(shí)間（s）及在黑盒停留時(shí)間（s），作為評(píng)價(jià)焦慮樣行為的指標(biāo)［14］。大鼠在白盒停留時(shí)間越短，說明大鼠越焦慮。每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清理大鼠排泄物，使用75%乙醇噴灑消除氣味。

1.3.8 組織樣本衍生化準(zhǔn)備 大鼠行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，麻醉后斷頭取腦，分離出額葉皮質(zhì)和海馬進(jìn)行衍生化處理。腦組織超聲勻漿后，取10 μl勻漿上清液置于試管內(nèi)，加入100 μl工作液，渦旋混勻，高速離心（轉(zhuǎn)速：13 200 r/min，時(shí)間：10 min，溫度：4 ℃）；將上清液轉(zhuǎn)入另一試管，氮吹；加入60 μl衍生工作液，渦旋混勻，旋轉(zhuǎn)離心（轉(zhuǎn)速：13 200 r/min，時(shí)間：10 min，溫度：4 ℃）；65 ℃溫育15 min，然后離心氮吹。加入100 μl乙腈水混合液復(fù)溶，渦旋混勻，旋轉(zhuǎn)離心（轉(zhuǎn)速：13 200 r/min，時(shí)間：10 min，溫度：4 ℃）。使用LC-MS質(zhì)譜儀檢測(cè)樣本。

1.3.9 LC-MS分析 在組織樣本衍生化處理后，進(jìn)行LC-MS分析，10 μl衍生化樣本加入HPLC Ultimate 3000儀器中，液相-質(zhì)譜條件：注溫50 ℃，上樣量10 μl，流動(dòng)相A：水和0.1%甲酸，流動(dòng)相B：乙腈和0.1%甲酸，CUR：20.00，CAD：Medium，CXP：5.00，IS：5500.00，DP：35.0，GS1：55.00，TEM：580.00，EP：10.0，GS2：60.00。按照表2顯示梯度進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

表2 質(zhì)譜檢測(cè)梯度表Table 2 Mass spectrometry detection gradient

1.4 觀察指標(biāo) （1）比較CUS組與對(duì)照組經(jīng)艾司西酞普蘭和溶媒處理后的行為學(xué)變化，通過測(cè)量體質(zhì)量增加量、SPT中蔗糖偏好值、OFT中水平運(yùn)動(dòng)距離來評(píng)估大鼠抑郁樣行為變化，如體質(zhì)量增加量減少、蔗糖偏好值下降、OFT中水平運(yùn)動(dòng)距離減少提示大鼠存在抑郁樣行為變化，通過OFT中中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、EPM中開臂停留時(shí)間、BWT中白盒停留時(shí)間來評(píng)估大鼠焦慮樣行為變化，如在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間減少、開臂停留時(shí)間減少、白盒停留時(shí)間減少均提示大鼠存在焦慮樣行為。（2）比較CUS組與對(duì)照組經(jīng)艾司西酞普蘭和溶媒處理后大鼠前額葉皮質(zhì)和海馬中30種氨基酸濃度的變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Prism 8統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。計(jì)量資料以（±s）表示，行為學(xué)數(shù)據(jù)和氨基酸數(shù)據(jù)采用雙因素兩水平方差分析（twoway ANOVA），post hoc分析均采用Tukey's檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CUS處理和艾司西酞普蘭處理對(duì)大鼠行為學(xué)的影響 CUS與艾司西酞普蘭對(duì)體質(zhì)量增加量無交互作用（P＞0.05），CUS對(duì)體質(zhì)量增加量主效應(yīng)顯著（P＜0.05），艾司西酞普蘭對(duì)體質(zhì)量增加量主效應(yīng)不顯著（P＞0.05）。在SPT中，CUS與艾司西酞普蘭對(duì)蔗糖偏好值均無交互作用（P＞0.05），而CUS和艾司西酞普蘭對(duì)蔗糖偏好值主效應(yīng)均顯著（P＜0.05）。在OFT中，CUS與艾司西酞普蘭對(duì)水平運(yùn)動(dòng)距離無交互作用（P＞0.05），而CUS和艾司西酞普蘭對(duì)水平運(yùn)動(dòng)距離主效應(yīng)均顯著（P＜0.05）；CUS與艾司西酞普蘭對(duì)中央?yún)^(qū)停留時(shí)間無交互作用（P＞0.05），CUS和艾司西酞普蘭對(duì)中央?yún)^(qū)停留時(shí)間主效應(yīng)均不顯著（P＞0.05）。在EPM中，CUS與艾司西酞普蘭對(duì)開臂停留時(shí)間存在交互作用（P＜0.05），但CUS和艾司西酞普蘭對(duì)開臂停留時(shí)間主效應(yīng)均不顯著（P＞0.05）；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，同樣給予溶媒處理，CUS組大鼠的開臂停留時(shí)間較對(duì)照組大鼠縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而給予艾司西酞普蘭處理可以逆轉(zhuǎn)CUS引起開臂停留時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在BWT中，CUS與艾司西酞普蘭對(duì)白盒停留時(shí)間存在交互作用（P＜0.05），CUS和艾司西酞普蘭對(duì)白盒停留時(shí)間主效應(yīng)均顯著（P＜0.05）；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，同樣給予溶媒處理，CUS組大鼠白盒停留時(shí)間較對(duì)照組大鼠縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而給予艾司西酞普蘭處理可以逆轉(zhuǎn)CUS引起在白盒停留時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

表3 CUS組和對(duì)照組經(jīng)艾司西酞普蘭處理后大鼠行為學(xué)觀察指標(biāo)比較（±s）Table 3 Comparison of behavioral changes of rats in CUS group and control group treated with escitalopram or vehicle

表3 CUS組和對(duì)照組經(jīng)艾司西酞普蘭處理后大鼠行為學(xué)觀察指標(biāo)比較（±s）Table 3 Comparison of behavioral changes of rats in CUS group and control group treated with escitalopram or vehicle

注：CUS=慢性不可預(yù)見性應(yīng)激；CUS+艾司西酞普蘭組n=9，CUS+溶媒組n=9，對(duì)照+艾司西酞普蘭組n=12，對(duì)照+溶媒組n=8；與經(jīng)溶媒處理比，aP＜0.05；與對(duì)照組比，bP＜0.05

組別 體質(zhì)量增加量（g） 蔗糖偏好值（%） 水平運(yùn)動(dòng)距離（格數(shù)）艾司西酞普蘭 溶媒 艾司西酞普蘭 溶媒 艾司西酞普蘭 溶媒對(duì)照組 75.36±16.63 69.93±17.44 81.13±8.66 81.41±14.38 129.40±30.25 101.50±25.98 CUS 組 51.11±30.82 36.68±15.76 73.67±9.94 60.77±9.97 70.11±29.87 46.14±21.20 F值 F交互=0.57，F(xiàn)組間=22.32，F(xiàn)干預(yù)=2.53 F交互=0.67，F(xiàn)組間=12.04，F(xiàn)干預(yù)=16.97 F交互=0.13，F(xiàn)組間=32.74，F(xiàn)干預(yù)=5.53 P值 P交互=0.45，P組間＜0.01，P干預(yù)=0.12 P交互=0.42，P組間＜0.01，P干預(yù)＜0.01 P交互=0.73，P組間＜0.01，P干預(yù)＜0.05組別 中央?yún)^(qū)停留時(shí)間（s） 開臂停留時(shí)間（s） 白盒停留時(shí)間（s）艾司西酞普蘭 溶媒 艾司西酞普蘭 溶媒 艾司西酞普蘭 溶媒對(duì)照組 11.52±4.66 11.52±4.56 47.56±25.02 52.75±39.63 33.80±8.68 32.18±6.88 CUS 組 10.02±5.77 9.04±2.71 68.75±31.16a 31.89±20.06b 71.44±11.53a 9.71±2.50b F 值 F交互=1.17，F(xiàn)組間=2.11，F(xiàn)干預(yù)=0.17 F交互=18.87，F(xiàn)組間=0.01，F(xiàn)干預(yù)=3.62 F交互=119.00，F(xiàn)組間=7.58，F(xiàn)干預(yù)=132.10 P 值 P交互=0.29，P組間=0.16，P干預(yù)=0.69 P交互＜0.01，P組間=0.91，P干預(yù)=0.07 P交互＜0.01，P組間=0.01，P干預(yù)＜0.01

2.2 LC-MS分析結(jié)果 在前額葉皮質(zhì)中，CUS與艾司西酞普蘭對(duì)總氨基酸、Glu濃度均無交互作用（P＞0.05），CUS和艾司西酞普蘭對(duì)總氨基酸、Glu濃度主效應(yīng)均不顯著（P＞0.05）。CUS與艾司西酞普蘭對(duì)GABA濃度存在交互作用（P＜0.05），CUS對(duì)GABA濃度主效應(yīng)不顯著（P＞0.05），艾司西酞普蘭對(duì)GABA濃度主效應(yīng)顯著（P＜0.05）；進(jìn)一步分析顯示，同樣經(jīng)過溶媒處理，CUS組前額葉皮質(zhì)中GABA濃度較對(duì)照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而給予艾司西酞普蘭處理后可以逆轉(zhuǎn)GABA濃度的下降（P＜0.05）。CUS與艾司西酞普蘭對(duì)Glu/GABA存在交互作用（P＜0.05），CUS對(duì)Glu/GABA主效應(yīng)不顯著（P＞0.05），艾司西酞普蘭對(duì)Glu/GABA主效應(yīng)顯著（P＜0.05）；進(jìn)一步分析顯示，同樣經(jīng)過溶媒處理，CUS組前額葉皮質(zhì)中Glu/GABA升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而給予艾司西酞普蘭處理可以逆轉(zhuǎn)Glu/GABA升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表4）。而在海馬中，CUS與艾司西酞普蘭對(duì)總氨基酸、Glu、GABA濃度及Glu/GABA均無交互作用（P＞0.05），CUS和艾司西酞普蘭對(duì)總氨基酸、Glu、GABA濃度及Glu/GABA主效應(yīng)均不顯著（P＞0.05，見表5）。

表4 前額葉皮質(zhì)中CUS組和對(duì)照組經(jīng)艾司西酞普蘭處理后氨基酸濃度比較（±s）Table 4 Comparison of amino acid concentration in prefrontal cortex between CUS group and control group treated with escitalopram or vehicle

表4 前額葉皮質(zhì)中CUS組和對(duì)照組經(jīng)艾司西酞普蘭處理后氨基酸濃度比較（±s）Table 4 Comparison of amino acid concentration in prefrontal cortex between CUS group and control group treated with escitalopram or vehicle

注：Glu=谷氨酸；GABA=γ-氨基丁酸；CUS+艾司西酞普蘭組n=5，CUS+溶媒組n=6，對(duì)照+艾司西酞普蘭組n=6，對(duì)照+溶媒組n=6；與經(jīng)溶媒處理比，aP＜0.05；與對(duì)照組比，bP＜0.05

Glu（μg/ml）艾司西酞普蘭 溶媒 艾司西酞普蘭 溶媒對(duì)照組 2 505.50±560.14 2 497.04±586.69 98.48±17.24 101.68±22.65 CUS 組 2 606.97±568.67 2 526.57±67.30 102.07±13.41 90.49±13.34 F值 F交互=0.02，F(xiàn)組間=0.06，F(xiàn)干預(yù)=0.02 F交互=0.98，F(xiàn)組間=0.26，F(xiàn)干預(yù)=0.31 P值 P交互=0.89，P組間=0.80，P干預(yù)=0.87 P交互=0.34，P組間=0.62，P干預(yù)=0.58組別 總氨基酸（μg/ml）Glu/GABA艾司西酞普蘭 溶媒 艾司西酞普蘭 溶媒對(duì)照組 7.31±1.24 7.48±1.28 13.21±3.13 14.26±2.26 CUS 組 8.16±1.08a 4.91±1.19b 12.60±1.79a 20.64±5.62b F值 F交互=9.47，F(xiàn)組間=2.38，F(xiàn)干預(yù)=7.72 F交互=5.17，F(xiàn)組間=3.52，F(xiàn)干預(yù)=8.72 P值 P交互＜0.01，P組間=0.14，P干預(yù)=0.01 P交互=0.04，P組間=0.08，P干預(yù)＜0.05組別 GABA（μg/ml）

表5 海馬中CUS組和對(duì)照組經(jīng)艾司西酞普蘭處理后氨基酸濃度比較（±s）Table 5 Comparison of amino acid concentration in hippocampus between CUS group and control group treated with escitalopram or vehicle

表5 海馬中CUS組和對(duì)照組經(jīng)艾司西酞普蘭處理后氨基酸濃度比較（±s）Table 5 Comparison of amino acid concentration in hippocampus between CUS group and control group treated with escitalopram or vehicle

注：CUS+艾司西酞普蘭組n=5，CUS+溶媒組n=6，對(duì)照+艾司西酞普蘭組n=6，對(duì)照+溶媒組n=6

Glu（μg/ml）艾司西酞普蘭 溶媒 艾司西酞普蘭 溶媒對(duì)照組 2 469.70±219.33 2 458.10±378.68 95.52±14.81 98.74±12.20 CUS 組 2 152.66±938.82 2 696.08±529.83 90.20±9.29 97.89±8.48 F值 F交互=1.35，F(xiàn)組間=0.03，F(xiàn)干預(yù)=1.24 F交互=0.20，F(xiàn)組間=0.38，F(xiàn)干預(yù)=1.18 P值 P交互=0.26，P組間=0.87，P干預(yù)=0.28 P交互=0.66，P組間=0.55，P干預(yù)=0.29組別 總氨基酸（μg/ml）組別 GABA（μg/ml）Glu/GABA艾司西酞普蘭 溶媒 艾司西酞普蘭 溶媒對(duì)照組 7.48±1.82 6.92±1.78 13.04±3.83 14.43±2.96 CUS 組 5.68±2.49 6.16±2.01 17.60±5.10 16.73±5.03 F值 F交互=0.30，F(xiàn)組間=1.82，F(xiàn)干預(yù)=0.00 F交互=0.33，F(xiàn)組間=3.04，F(xiàn)干預(yù)=0.02 P值 P交互=0.59，P組間=0.20，P干預(yù)=0.97 P交互=0.57，P組間=0.10，P干預(yù)=0.89

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激可以引起大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量增加量下降、SPT中蔗糖偏好值下降、OFT中水平運(yùn)動(dòng)距離縮短（模擬抑郁癥中精神運(yùn)動(dòng)性阻滯）、EPM中在開臂停留時(shí)間縮短、BWT中在白盒停留時(shí)間減少等抑郁樣及焦慮樣行為，說明抑郁模型構(gòu)建成功。而給予艾司西酞普蘭可顯著逆轉(zhuǎn)抑郁模型大鼠出現(xiàn)的抑郁及焦慮樣行為，但對(duì)健康大鼠均無明顯影響。另外慢性應(yīng)激可引起大鼠前額葉皮質(zhì)中GABA濃度降低及Glu/GABA增加，給予艾司西酞普蘭可顯著增加GABA濃度，并恢復(fù)Glu/GABA，但在海馬中無類似發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果與既往臨床研究結(jié)果［15］一致，說明前額葉皮質(zhì)中GABA參與應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為發(fā)生，且與艾司西酞普蘭發(fā)揮抗抑郁作用相關(guān)。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激可以引起前額葉皮質(zhì)中其他氨基酸，如異亮氨酸減少，天冬氨酸及丙氨酸增加的現(xiàn)象［16］；慢性束縛應(yīng)激模型中天冬氨酸、丙氨酸、Glu、谷氨酰胺等氨基酸濃度變化與抑郁樣行為發(fā)生相關(guān)［15］；習(xí)得性無助模型中半胱氨酸、乙酰水楊酸、甘氨酰脯氨酸等氨基酸的變化與抑郁樣行為發(fā)生相關(guān)［17］等。以上研究結(jié)果存在差異，可能與選用的抑郁模型不同及選用的檢測(cè)方法靈敏度不同等有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠前額葉皮質(zhì)中GABA濃度下降，與GABBAY等［18］團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在青年抑郁癥患者前扣帶回皮質(zhì)中存在GABA缺乏，以及胡子成［19］團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)首發(fā)抑郁癥患者血漿中GABA等氨基酸濃度下降相一致，說明無論臨床研究還是動(dòng)物模型研究，均證明GABA在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

在抑郁模型大鼠前額葉皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)GABA濃度下降，給予艾司西酞普蘭抗抑郁治療，GABA濃度恢復(fù)，那么GABA濃度下降是抑郁發(fā)生的因還是果？近年來，有研究利用突變小鼠模型及光化學(xué)遺傳的方法來觀察GABA在腦內(nèi)改變情況，結(jié)果表明GABAA受體突變的小鼠［20］或者海馬和皮質(zhì)GABA組織減少50%的突變小鼠［21］在應(yīng)激模型中可以觀察到與抑郁相關(guān)的行為學(xué)表型，比如快感缺失和新奇恐懼樣行為等。同樣也有研究報(bào)道，選擇性抑制GABA能小清蛋白（PV）神經(jīng)元［22］或者生長抑素（SST）神經(jīng)元［23］，均可出現(xiàn)抑郁或焦慮樣行為學(xué)表型。然而，應(yīng)激時(shí)間的長短對(duì)GABA能神經(jīng)元的作用不同，比如經(jīng)過16 d的CUS處理，可導(dǎo)致前額葉皮質(zhì)和海馬中GABA能神經(jīng)元中SST中間神經(jīng)元減少而不影響PV神經(jīng)元［24］；經(jīng)過9周的CUS處理，可以降低易感大鼠PV神經(jīng)元而不影響SST神經(jīng)元［25］。這些結(jié)果可能提示前額葉皮質(zhì)中GABA能系統(tǒng)直接參與了抑郁癥的發(fā)病過程，是抑郁發(fā)生的原因之一。

抑郁模型大鼠前額葉皮質(zhì)中Glu/GABA顯著增加，而給予抗抑郁藥物治療后可逆轉(zhuǎn)Glu/GABA增加。由于前額葉皮質(zhì)中Glu水平未發(fā)現(xiàn)顯著變化，故Glu/GABA增加考慮可能為Glu向GABA轉(zhuǎn)化減少，Glu轉(zhuǎn)化為GABA是在谷氨酸脫羧酶（GAD）催化下，Glu轉(zhuǎn)化為GABA。而GAD主要存在抑制性GABA能神經(jīng)元，有研究表明GABA能神經(jīng)元功能不足在抑郁癥的病理生理機(jī)制中起重要作用［26］，推測(cè)GABA能神經(jīng)元功能異常可能導(dǎo)致GAD異常而影響Glu向GABA轉(zhuǎn)化。

目前臨床上所用的抗抑郁藥物大多是通過抑制單胺能神經(jīng)遞質(zhì)的再攝取，如5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素、多巴胺等，從而達(dá)到增加單胺能神經(jīng)遞質(zhì)，以起到抗抑郁作用。既往研究證明，艾司西酞普蘭也是通過與神經(jīng)突觸前膜上5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白結(jié)合，抑制5-HT的再攝取，導(dǎo)致突觸間隙5-HT濃度升高，從而發(fā)揮抗抑郁作用［27］，而本研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)艾司西酞普蘭能恢復(fù)抑郁模型大鼠前額葉皮質(zhì)中GABA濃度，發(fā)揮抗抑郁作用。近年來，也有類似研究報(bào)道5-HT再攝取抑制劑類藥物如氟西汀，能夠激活GABAA受體提高GABA能神經(jīng)元興奮性［28］；新型抗抑郁藥物氯胺酮也可以增強(qiáng)GABA能神經(jīng)元［29］；以上研究結(jié)果均表明GABA能神經(jīng)元在抗抑郁作用中扮演著重要角色。因此，GABA能系統(tǒng)可能參與抑郁癥的發(fā)生機(jī)制和抗抑郁治療的機(jī)制。目前，已有以GABA能系統(tǒng)為靶點(diǎn)的抗抑郁藥物進(jìn)入臨床研究，如GABAA受體復(fù)合物的正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑：Brexanolone［30］和 SAGE-217［31］等。總之，GABA 能系統(tǒng)在抑郁發(fā)生機(jī)制和抗抑郁機(jī)制中起著重要作用，本研究結(jié)果為之提供了新的證據(jù)。

本研究尚存在一定的缺陷。首先，用于LC-MS分析的樣本量較少，未來需要增加樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果。其次，用于LC-MS分析的樣本在造模后經(jīng)歷了行為學(xué)測(cè)試，是否對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響尚不能明確。以往類似研究是在做完各種行為學(xué)測(cè)試后再進(jìn)行各種生化指標(biāo)的檢測(cè)［16］。未來需要分別用不同的大鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試和生化指標(biāo)檢測(cè)，以排除造模后行為學(xué)測(cè)試對(duì)腦內(nèi)生化指標(biāo)檢測(cè)的影響。最后本研究只是初步發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激可能導(dǎo)致大鼠前額葉皮質(zhì)GABA能系統(tǒng)異常，而給予抗抑郁治療后能逆轉(zhuǎn)上述異常，但GABA能系統(tǒng)在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中的具體作用還需要進(jìn)一步研究，比如可以從GABA能PV神經(jīng)元、SST神經(jīng)元及催化Glu轉(zhuǎn)化為GABA的GAD與抑郁癥發(fā)病機(jī)制的關(guān)系等多個(gè)角度進(jìn)行深入驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示前額葉皮質(zhì)GABA異常參與慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁發(fā)生，艾司西酞普蘭可以扭轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為和焦慮樣行為，并可扭轉(zhuǎn)前額葉皮質(zhì)的GABA異常。

作者貢獻(xiàn)：丁楷模進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，對(duì)結(jié)果的分析與解釋，撰寫論文；丁楷模、李素霞進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；丁楷模、李冰玥進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；丁楷模、李冰玥、張咪咪進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；丁楷模、李國海、李素霞進(jìn)行論文及英文的修訂；李國海、李素霞負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；李素霞對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。