輔助降血脂青稞酵素含片的制備及其降血脂效果評(píng)價(jià)

劉延嶺，鄧 林，陶瑞霄

（四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 都江堰 611830）

青稞是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，主要分布在我國(guó)西藏、青海、四川、云南等地，是藏族人民的主要糧食。青稞營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，特別是β-葡聚糖含量是普通小麥平均含量的50倍[1-3]。β-葡聚糖具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健功能，既可通過(guò)減少腸道黏膜與致癌物質(zhì)的接觸，從而間接抑制致癌微生物作用的方式來(lái)預(yù)防結(jié)腸癌，又可通過(guò)降血脂和降膽固醇物質(zhì)合成的方式預(yù)防心血管疾病[4-7]。

酵素是指以一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、谷物、中草藥等為原料[8]，經(jīng)多種有益菌發(fā)酵而得，含有豐富的維生素、酶、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營(yíng)養(yǎng)成分的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品[9-12]。酵素產(chǎn)品市場(chǎng)前景較好，而目前以青稞為原料的酵素產(chǎn)品相對(duì)較少，因此，開(kāi)發(fā)以青稞為原料發(fā)酵而成、具有保健功能的酵素產(chǎn)品具有一定的市場(chǎng)價(jià)值。

本研究采用高溫蒸料法處理青稞原料，通過(guò)青稞（原料）發(fā)酵，提高了熟化過(guò)程中β-葡聚糖含量。此外采用先乳酸菌發(fā)酵后紅曲霉發(fā)酵的方式，提高了紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物莫納可林的含量。兩種處理不僅為混合發(fā)酵提供了新的方法，同時(shí)強(qiáng)化了青稞酵素降血脂的保健功能，相較于現(xiàn)有降血脂的保健品，其適用范圍更廣，功能性更強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

青稞：市售；乳酸菌（Lactobacillus）、紅曲霉菌（Monascus purpureus Went）：由中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所保存。

1.1.2 儀器與設(shè)備

ZT1-02型電熱蒸煮鍋，興平市中通試驗(yàn)裝備有限公司；SYQ-DSX-280B型手提式滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DS-1型高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；SXX-103型凈化工作臺(tái)，中國(guó)蚌埠凈化設(shè)備廠；PYX-DH型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；LRH-250型生化培養(yǎng)箱，廣州深華生物技術(shù)有限公司；XS-212-202型雙目電子顯微鏡，蘇州勝視電子設(shè)備有限公司；DHR95型可視手持折光儀，德國(guó)S+H（中國(guó)）有限公司；PHS-3D型pH計(jì)，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 輔助降血脂青稞酵素含片的制備

1.2.1.1 工藝流程

青稞→浸泡→磨漿→蒸料→冷卻→發(fā)酵→噴霧干燥→壓片

1.2.1.2 操作要點(diǎn)

篩選：選擇麥粒飽滿、硬度適中的青稞原料，篩選除雜后用循環(huán)水沖洗。

浸泡：將洗凈的青稞用2倍質(zhì)量的無(wú)菌水浸泡5 h，至青稞吸水膨脹率為60%，撈出備用。

磨漿：將浸泡后的青稞與同質(zhì)量的無(wú)菌水過(guò)膠體磨，磨漿后過(guò)90目篩得到青稞漿料。

蒸料：將青稞漿料于一定溫度下高壓蒸煮30 min。

冷卻：將蒸料后的青稞漿料冷卻至20℃，得青稞料液。

發(fā)酵：在冷卻后的青稞料液中加入其質(zhì)量5.0%乳酸菌種子液（種子液含菌數(shù)1×106CFU/mL），靜置厭氧發(fā)酵6 d至發(fā)酵液pH為4.0，得到前發(fā)酵液。采用液體振蕩發(fā)酵法向前發(fā)酵液中加入一定量的紅曲霉菌種子液（種子液含菌數(shù)1×106CFU/mL），在一定的溫度振蕩頻率下繼續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵8 d至發(fā)酵液黏度為4 500～5 000 cP，發(fā)酵結(jié)束。

噴霧干燥：將發(fā)酵液置于噴霧干燥設(shè)備中進(jìn)行噴霧干燥。

壓片：將干燥后的青稞酵素在壓片機(jī)中按0.5 g每片進(jìn)行壓片。

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 青稞蒸煮溫度對(duì)紅曲霉發(fā)酵的影響

分別取于100、110、120、130、140℃下蒸煮得到的料漿，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，取100 mL發(fā)酵醪，接入其質(zhì)量5.0%的紅曲霉菌（種子液含菌數(shù)1×106CFU/mL），在振蕩頻率100 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中于30℃發(fā)酵8 d，測(cè)定成品中β-葡聚糖和莫納可林的含量。

1.2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)紅曲霉發(fā)酵的影響

取蒸料溫度于120℃下得到的料漿，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，取100 mL發(fā)酵醪，接入其質(zhì)量5.0%的紅曲霉菌（種子液含菌數(shù)1×106CFU/mL），在振蕩頻率100 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，分別于20、25、30、35、40℃發(fā)酵8 d，測(cè)定成品中β-葡聚糖和莫納可林的含量。

1.2.2.3 振蕩頻率對(duì)紅曲霉發(fā)酵的影響

取蒸料溫度于120℃下得到的料漿，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，取100 mL發(fā)酵醪，接入其質(zhì)量5.0%的紅曲霉菌（種子液含菌數(shù)1×106CFU/mL），在振蕩頻率50、100、150、200、250 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中于30℃分別發(fā)酵8 d，測(cè)定成品中β-葡聚糖和莫納可林的含量。

1.2.2.4 接種量對(duì)紅曲霉發(fā)酵的影響

取蒸料溫度于120℃下得到的料漿，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，取100 mL發(fā)酵醪，分別接入其質(zhì)量4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%的紅曲霉菌（種子液含菌數(shù)1×106CFU/mL），在振蕩頻率100 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中于30℃發(fā)酵8 d，測(cè)定成品中β-葡聚糖和莫納可林的含量。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取蒸煮溫度、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速和接種量為主要考察因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以發(fā)酵醪中的莫納可林含量作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，β-葡聚糖含量作為次要評(píng)價(jià)指標(biāo)，其權(quán)重系數(shù)分別為60%和40%。根據(jù)綜合評(píng)分對(duì)其進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析，其中綜合評(píng)分=莫納可林含量/莫納可林含量最大值×100×60%+β-葡聚糖含量/β-葡聚糖含量最大值×100×40%。試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 不同β-葡聚糖和莫納可林含量制品的降血脂效果評(píng)價(jià)

1.2.4.1 評(píng)價(jià)方法

采用脂代謝紊亂模型——預(yù)防性給受試物法，按最優(yōu)發(fā)酵條件所制得的樣品（X）和直接混合同等劑量β-葡聚糖和莫納可林所制得的樣品（Y）進(jìn)行對(duì)比。

基礎(chǔ)飼料為市售普通飼料。高脂飼料由78.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油和0.2%膽鹽混合而成。受試飼料1由80%高脂飼料、20%樣品X混合而成。受試飼料2由80%高脂飼料、20%樣品Y混合而成。小鼠平均質(zhì)量130～140 g。

1.2.4.2 主要實(shí)施步驟

用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)大鼠7 d后，空腹過(guò)夜取尾血，測(cè)血清總膽固醇（TC）、血清甘油三酯（TG）、血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），根據(jù)TC水平隨機(jī)分為4組，每組10只。

在X、Y兩個(gè)樣品的基礎(chǔ)上，另設(shè)一個(gè)高脂模型對(duì)照組和一個(gè)基礎(chǔ)飼料對(duì)照組。經(jīng)口給予受試物，灌胃量10 mL/kg BW。連續(xù)給予30 d。

試驗(yàn)期內(nèi)兩個(gè)受試組給予受試飼料1和受試飼料2，高脂模型對(duì)照組給予高脂飼料，基礎(chǔ)飼料對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料。于試驗(yàn)結(jié)束禁食16 h后取血，測(cè)血清TC、TG、HDL-C三項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.5 測(cè)定項(xiàng)目與方法

β-葡聚糖含量：按NT/Y 2006—2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測(cè)定》[13]中的方法進(jìn)行測(cè)定。

莫納可林含量：將不同條件下的發(fā)酵原液置于60℃干燥至恒重，研磨過(guò)80目篩，取5 g樣品，用100 mL乙醇索氏提取器提取1 h，減壓濃縮至5 mL，過(guò)濾，清液為待分析樣品。采用高效液相色譜法[14]測(cè)定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以測(cè)定3次得到的xˉ±s表示。采用Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 蒸煮溫度對(duì)紅曲霉發(fā)酵的影響

熟化可以讓組織變軟，利于后期發(fā)酵，但由于熟化溫度不夠，淀粉等大分子物質(zhì)也會(huì)分解不完全，對(duì)于青稞產(chǎn)品，則不利于β-葡聚糖的累積。由圖1可見(jiàn)，隨著蒸煮溫度的升高，β-葡聚糖含量和莫納可林含量均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，且在110～120℃時(shí)隨著溫度的升高，其含量增長(zhǎng)較快，說(shuō)明在此階段溫度的升高對(duì)青稞中有效成分溶出的影響很大，但從120～130℃增速緩慢，130～140℃增速趨于平緩，說(shuō)明此階段有效成分已經(jīng)趨于飽和，再升高溫度影響不大，且會(huì)增加成本。

圖1 蒸煮溫度對(duì)紅曲霉發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of cooking temperatures on fermentation of Monascus purpureus Went

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)紅曲霉發(fā)酵的影響

由圖2可見(jiàn)，β-葡聚糖含量和莫納可林含量隨著發(fā)酵溫度的升高，呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，其中當(dāng)發(fā)酵溫度為35℃時(shí)，β-葡聚糖和莫納可林的含量達(dá)到最大，分別為6.12%和2.96 mg/g。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)紅曲霉發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of fermentation temperatures on fermentation of Monascus purpureus Went

2.1.3 振蕩頻率對(duì)紅曲霉發(fā)酵的影響

由圖3可知，隨著振蕩頻率的增大，β-葡聚糖和莫納可林含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。紅曲霉菌為好氧型絲狀霉菌，發(fā)酵液中的氧氣含量直接影響紅曲霉的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，因此在發(fā)酵過(guò)程中不斷通入氧氣有利于其生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的蓄積，但是轉(zhuǎn)速過(guò)高時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定的剪切力，殺傷紅曲霉，造成其代謝產(chǎn)物產(chǎn)量下降[15]。當(dāng)振蕩頻率為150 r/min時(shí)，β-葡聚糖和莫納可林的含量達(dá)到最高值，分別為6.15%和2.95 mg/g。

圖3 振蕩頻率對(duì)紅曲霉發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of oscillatory frequency on fermentation of Monascus purpureus Went

2.1.4 接種量對(duì)紅曲霉發(fā)酵的影響

由圖4可見(jiàn)，隨著接種量的增大，β-葡聚糖和莫納可林含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，其中在接種量為6%時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)β-葡聚糖含量為6.27%，莫納可林含量為3.12 mg/g。這可能是由于在接種量小時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富適合微生物的生長(zhǎng)繁殖，但是其基數(shù)小，不利于次級(jí)產(chǎn)物的積累，接種量大時(shí)，受限于霉菌本身的特性，次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量只會(huì)在最大值處波動(dòng)，且后期的代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)莫納可林的積累產(chǎn)生阻遏作用。

圖4 接種量對(duì)紅曲霉發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of inoculation amounts on fermentation of Monascus purpureus Went

2.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，為獲得最佳紅曲霉菌發(fā)酵條件，選取蒸煮溫度、發(fā)酵溫度、振蕩頻率和接種量為主要考察因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以發(fā)酵醪中的莫納可林含量作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，β-葡聚糖作為次要評(píng)價(jià)指標(biāo)，其權(quán)重系數(shù)分別為60%和40%。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

由表2可見(jiàn)，最優(yōu)條件為A2B2C2D2，即蒸煮溫度120℃，發(fā)酵溫度30℃，振蕩恒溫培養(yǎng)箱的搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，接種量6%。由極差R值可以看出，4個(gè)因素影響順序由大到小為：A＞C＞B＞D，即蒸煮溫度＞振蕩恒溫培養(yǎng)箱的搖床轉(zhuǎn)速＞發(fā)酵溫度＞接種量，并且蒸煮溫度為最主要影響因素。

在此最佳條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，得到β-葡聚糖和莫納可林的含量達(dá)到最高值，分別為6.32%和3.15 mg/g。

2.3 不同β-葡聚糖和莫納可林含量制品的降血脂效果評(píng)價(jià)

β-葡聚糖和莫納可林含量制品飼養(yǎng)小鼠后的降血脂效果見(jiàn)表3和表4。

由表3與表4分析可知，高脂飼料組小鼠的體重、TG和TC顯著高于基礎(chǔ)飼料組（P＜0.05），受試飼料1、受試飼料2與基礎(chǔ)飼料組相比，各指標(biāo)間的顯著差異性各有不同。但從整體上看，受試飼料2組在降低小鼠甘油三酯、總膽固醇以及提高高密度脂蛋白膽固醇上不如受試飼料1組好，說(shuō)明采用最優(yōu)發(fā)酵條件所制得的產(chǎn)物制作的青稞酵素含片，比直接混合β-葡聚糖和莫納可林效果好。

表3 不同β-葡聚糖和莫納可林含量制品對(duì)小鼠體重的影響Table 3 Effects of differentβ-glucan and monacolin contents products on body weights of mice 單位：g

表4 不同β-葡聚糖和莫納可林含量制品對(duì)小鼠甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇的影響Table 4 Effects of differentβ-glucan and monacolin contents products on TG,TC and HDL-C contents of mice 單位：mmol/L

3 結(jié)論

（1）采用先乳酸菌發(fā)酵后紅曲霉發(fā)酵的方式，通過(guò)乳酸菌發(fā)酵對(duì)環(huán)境的改變，為紅曲霉提供最適發(fā)酵條件，提高了紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物莫納可林含量。其次級(jí)代謝產(chǎn)物莫納可林有降膽固醇、降血脂的作用。因此，發(fā)酵過(guò)程引入紅曲霉進(jìn)行發(fā)酵，將會(huì)強(qiáng)化青稞的降血脂功能。

（2）乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物可促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)，增進(jìn)吸收；同時(shí)，也有一定的降血脂功能。最重要的是，乳酸菌發(fā)酵可調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，為紅曲霉的生長(zhǎng)提供有利的環(huán)境，所以，利用乳酸菌和紅曲霉發(fā)酵是必要的。同時(shí)，這種前者發(fā)酵產(chǎn)物作為后者發(fā)酵條件的工藝是一種新的嘗試，為混合發(fā)酵提供了新的方法。

（3）紅曲霉發(fā)酵的最佳條件為：蒸煮溫度120℃，發(fā)酵溫度30℃，振蕩恒溫培養(yǎng)箱的搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，接種量6%。在此工藝下得到的β-葡聚糖和莫納可林的含量達(dá)到最高值，分別為6.32%和3.15 mg/g。在此條件下制作的青稞酵素含片，比直接混合β-葡聚糖和莫納可林的降脂效果好。