淫羊藿苷脫糖產物制備及體外抗腫瘤活性

許曉蒙,孫發鑫,馮瑩瑩,郭文娜,袁 夢,許 卉

(煙臺大學新型制劑與生物技術藥物研究山東省高校協同創新中心、分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學),山東 煙臺 264005)

淫羊藿是典型的補陽中藥,始載于《神農本草經》,為小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim.)、箭葉淫羊藿(Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.)、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim.)或朝鮮淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)的干燥葉[1]。淫羊藿味辛、甘,性溫,歸肝、腎經,有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效,具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗抑郁、降血糖、提高免疫力等藥理活性,廣泛用于陽痿遺精、筋骨痿軟、風濕痹痛、麻木拘攣等癥[2-5]。現代化學與生物學研究發現,天然異戊二烯基黃酮醇類成分是淫羊藿的主要功效成分,其中以淫羊藿苷(icariin, ICA)天然含量最高,各版《中國藥典》都規定其為淫羊藿及相關制品的質量控制指標成分[6-8]。

圖1 淫羊藿苷相關化合物的化學結構

ICA是一種天然黃酮苷，極易水解生成淫羊藿次苷I(icariside I, ICA I)、淫羊藿次苷II(icariside II, ICA II)和淫羊藿素(icaritin, ICT)等脫糖產物,是ICA發揮生理活性的效應物質基礎[9-11]。研究發現,淫羊藿苷及其代謝產物能夠抑制人肺癌細胞的體外增殖,其機制與誘導腫瘤細胞S期阻滯和細胞凋亡有關[12]。在相關品種的質量控制中,淫羊藿苷脫糖產物相應受到重視。現行《中國藥典》對于羊脂油炒制的炙淫羊藿飲片,即在“含量測定”項下即明確規定:本品按干燥品計算,含淫羊藿苷和寶藿苷I(baohuoside I,即ICA II)的總量不得少于0.60%[1]。目前尚缺少針對ICA及其脫糖產物生物活性差異特性比較的系統研究。

本研究以天然含量豐富的ICA為原料,制備系列脫糖產物ICA I、ICA II和ICT,基于穩定、可控的腫瘤細胞體外增殖模型,評價ICA及其脫糖產物對幾種常見、高發人源腫瘤細胞的體外增殖抑制活性,定量比較這類成分的抗腫瘤活性差異,并篩選敏感作用瘤株,為中藥淫羊藿及其制品的質量控制和開發應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司),CO2培養箱(Thermo),離心機(Eppendorf),CKX31型倒置顯微鏡(菲律賓奧林巴士公司),酶標儀(DNM-9602 MICROPLATE READER),旋轉蒸發儀(鞏義市宏華儀器設備工貿有限公司),恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿有限公司),Aglient 1100 型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

淫羊藿苷(上海茁采生物科技有限公司,批號:20190506),淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II、淫羊藿素對照品(中國食品藥品檢定研究院),阿霉素(DOX,北京偶合科技有限公司),人肝癌細胞SMMC-7721、人乳腺癌細胞MCF-7、人肺癌細胞A-549、人結腸癌細胞HT-29(ATCC,中科院上海細胞庫),DMEM培養基(HyClone Laboratories),胎牛血清(NQBB International Biological Corporation),青霉素-鏈霉素溶液、胰酶消化液(Beyotime Biotechnology Co.Ltd),MTT、DMSO(Sigma-Aldrich),甲醇、乙腈(Fisher),超純水(實驗室自制),ODS(青島邦凱高新技術材料有限公司),蝸牛酶(上海萌椏生物科技有限公司),其他試劑均為國產分析純。

1.2 脫糖產物制備與測定

1.2.1 ICA I制備 稱取ICA 100 mg,置100 mL圓底燒瓶中,加適量無水乙醇溶解;加5%硫酸25 mL,置50 ℃水浴中攪拌反應,TLC監測。至反應結束后,加適量去離子水稀釋反應液,離心(9000 r·min-1, 10 min),去上清,下層沉淀加水洗至中性,行ODS柱色譜分離純化,以CH3OH-H2O混合溶劑進行梯度洗脫,HPLC監測,收集目標餾分,濃縮干燥,得黃色固體(58.9 mg)。

1.2.2 ICA II制備 稱取ICA 100 mg,置100 mL圓底燒瓶中,加適量DMSO溶解,加入100 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.1 molL-1,pH 6.0)、100 mg蝸牛酶,置37 ℃水浴中攪拌反應,TLC監測。至反應結束后,離心(9000 r·min-1,10 min),去上清,取下層沉淀加甲醇溶解后過濾,濾液濃縮干燥后進行重結晶純化(CH3OH-H2O),得黃色針狀晶體(51.2 mg)。

1.2.3 ICT制備 稱取ICA 100 mg,置100 mL圓底燒瓶中,加入2.5 mL硫酸溶液(5 mol·L-1,加9 mL 80%冰醋酸溶液,至于70 ℃水浴中攪拌反應,TLC監測。反應結束后離心(9000 r·min-1,10 min),去上清,沉淀以10倍超純水洗至中性,過濾后ODS柱色譜分離純化,以CH3OH-H2O混合溶劑進行梯度洗脫,HPLC監測,收集目標餾分,濃縮干燥,得黃色固體(24.1 mg)。

1.2.4 HPLC測定 色譜分離采用Agilent-TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),乙腈-水混合溶劑梯度洗脫(0～5 min,35∶65;5～10 min,35∶65→70∶30;10～45 min,70∶30),柱溫30 ℃,流速1 mL·min-1,檢測波長270 nm;待測試樣加流動相制成20～100 μg·mL-1的溶液進樣測定,進樣量20 μL。

1.3 體外細胞增殖活性測定

1.3.1 樣品制備 將ICA、ICA I、ICAII和ICT溶于DMSO(細胞培養級)中,分別配制成作用濃度為0.1、0.3、1.0、3.0、10.0和30.0 μmol·L-1的DMSO溶液,-20 ℃冰箱儲存備用。

1.3.2 細胞培養 將人源腫瘤細胞(SMMC-7721、MCF-7、HT-29、A-549)細胞于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養,培養介質為含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養液。1～2 d傳代一次,取對數生長期細胞,備用。

1.3.3 MTT法測定 取對數生長期的腫瘤細胞,制成細胞懸液,按2×104個/mL的密度接種至96孔板,每孔200 μL,于5% CO2、37 ℃細胞培養箱中孵育24 h后,加不同濃度試驗藥物(0.1、0.3、1、3、10、30 μmol·L-1)培養24 h,于每孔中加入10 μL MTT(終濃度500 μg/mL),繼續培養4 h(5% CO2、37 ℃),棄去上清,加入DMSO 150 μL,振搖至藍紫色甲瓚結晶完全溶解,以630 nm為參比波長,用酶標儀測定570 nm處的吸光度A570。試驗藥物各濃度均設置3平行復孔,同時進行空白組測定,并以阿霉素(DOX)作為陽性對照藥,濃度為(0.1、0.3、1、3、10、30 μmol·L-1)。根據吸光度測定結果,按(1-實驗組平均A570值/空白對照組平均A570值)×100%計算細胞生長抑制率(%),并經SPSS 25.0回歸分析,計算得抑制作用的半數抑制濃度(IC50)。

2 結 果

2.1 脫糖產物制備結果

以ICA為原料,通過不同反應和純化工藝條件,制備獲得三種脫糖產物。經與標準品在相同色譜條件下的HPLC圖譜對比分析(圖2),確證所制得的化合物分別為ICA脫除C-3-鼠李糖或C-7-葡萄糖所得的單脫糖產物ICA I、ICA II,以及同時脫除C-3-鼠李糖和C-7-葡萄糖所得的雙脫糖產物,即淫羊藿苷的苷元ICT。

圖2 三種脫糖產物純度檢查的HPLC圖譜

根據HPLC分析結果,在目標產物結構確證基礎上,進一步測定各脫糖產物的純度和收率,見表1。結果表明,利用本研究建立的脫糖反應及純化工藝條件,能夠制備滿足生物活性評價需要的淫羊藿苷脫糖產物。

表1 ICA脫糖產物制備收率及純度檢查結果

2.2 淫羊藿黃酮對腫瘤細胞體外增殖抑制作用

選擇四種常見、高發的人源腫瘤細胞開展體外實驗,包括人肝癌細胞SMMC-7721、肺癌細胞A-549、結腸癌細胞HT-29和乳腺癌細胞MCF-7細胞株,同時評價了ICA及其單脫糖ICA I、ICA II和雙脫糖產物ICT四種黃酮類成分的體外抑制作用強度及量效關系。

2.2.1 ICA及其脫糖產物對四種腫瘤細胞的體外增殖抑制作用 終濃度為0.1～30 μmol·L-1的ICA、ICA I、ICA II、ICT作用24 h后,對四種腫瘤細胞的平均增殖抑制率見圖3所示。除 ICA以外,ICA I、ICA II和ICT對四種腫瘤增殖的抑制率均具有濃度依賴性(P<0.05)。

圖3 ICA及ICA脫糖產物對四種腫瘤細胞體外增殖的影響

2.2.2 三種脫糖產物對四種腫瘤細胞IC50值 計算ICA I、ICA II和ICT對四種腫瘤細胞的IC50值，結果見表2。

表2 ICA I、ICA II、ICT對人源腫瘤細胞體外增殖抑制作用的

由表2可見,三種脫糖產物中,ICA II對四種腫瘤細胞的IC50值均為最低,表明其增殖抑制效果最顯著。此外,從ICA II對四種腫瘤細胞的IC50值對比可見,ICA II對人肝癌細胞SMMC-7721的IC50值最低,為1.26 μmol·L-1,表明SMMC-7721對ICA II的抑制作用最為敏感。由于ICA在0.1～30 μmol·L-1濃度范圍內對四種腫瘤細胞最大抑制率均小于50 %,故無法計算IC50值。

3 討 論

具有化學結構多樣性的天然產物始終是現代藥物發現的重要來源,多達半數以上的臨床藥物與天然產物有關,如青蒿素、紫杉醇、喜樹堿等。尤其在惡性腫瘤治療領域,傳統中藥的功效成分因具有高效、低毒、不易產生耐藥性等臨床優勢,日益引起研究關注[13-14]。利用天然活性成分為先導化合物衍生出低毒、高效的生物活性物質,在新藥研發領域發揮著巨大作用。現有研究發現,淫羊藿苷及其脫糖衍生物具有潛在抗腫瘤潛力[15],值得開展進一步的深入評價。本研究基于穩定、可控的腫瘤細胞體外增殖抑制模型,對包括脫糖代謝產物在內的淫羊藿黃酮類化合物進行抗腫瘤活性比較,并篩選發現敏感瘤株,以期為這類天然產物的合理開發應用以及淫羊藿相關產品的科學質量控制奠定基礎。

傳統中藥學認為淫羊藿味辛、甘,性溫,歸肝、腎經。據文獻報道,味辛、甘,性溫,歸肝經類中藥普遍具有抗腫瘤的功效[16]。劉鐵漢等[17]對大鼠口服ICA后的排泄物進行了檢測,發現ICA在大鼠腸道環境中轉化為ICA II后吸收入血,ICA II對人乳腺癌細胞MCF-7和人肝癌細胞HepG2的抗腫瘤活性優于其他黃酮類成分。本研究結果表明ICA II對人肺癌細胞(A-549)、乳腺癌細胞(MCF-7)、結腸癌細胞(HT-29)和肝癌細胞(SMMC-7721)的抗腫瘤活性明顯優于其他三種黃酮類物質,并通過比較ICA II對人肺癌細胞(A-549)、乳腺癌細胞(MCF-7)、結腸癌細胞(HT-29)和肝癌細胞(SMMC-7721)的抗腫瘤活性,發現ICA II對人肝癌細胞(SMMC-7721)具有更顯著的抗腫瘤作用。淫羊藿兼具保肝、護肝等功效,因此從傳統中藥中開發肝癌治療新藥角度來看,ICA II具有潛在的抗腫瘤藥用價值。

4 結 論

本研究以淫羊藿苷為原料合成了淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II,比較了淫羊藿苷及其三種脫糖代謝物之間的抗腫瘤活性差異,并篩選敏感腫瘤細胞株,最終確定淫羊藿次苷II相較于淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿素對腫瘤細胞的增殖抑制作用最強,且篩選出SMMC-7721為最敏感細胞株,為淫羊藿黃酮類化合物的抗腫瘤開發應用提供了實驗依據。