基于網絡藥理學和分子對接法研究芫花抗炎作用機制

宗明月,張慶然,王璐瓊,辛 敏,趙 烽

(煙臺大學新型制劑與生物技術藥物研究山東省高校協同創新中心、分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學),山東 煙臺 264005)

芫花(DaphnegenkwaSieb.et Zucc.)為瑞香科(Thymelaeaceae)植物,史載于《山海經》中山經,已廣泛應用于中醫臨床超過2000年,主要分布于我國長江及黃河流域各省[1]。芫花含有多種化學成分,如黃酮類、木脂素類、香豆素類、瑞香烷型二萜類等[2],研究表明其藥理活性主要包括抗腫瘤[3]、抗炎和免疫調節等[4]。

中藥具有多靶點、多成分的特點,簡單的藥理學方法不能系統地揭示中藥化學成分在體內的作用機制[5]?？茖W技術的發展、多學科的相互交叉為中藥藥效評價提供了高效、快速的方法。靶點篩選借助計算機模擬分析、生物信息學和分子網絡數據等,從不同角度預測藥物發揮藥效的作用機制,成為藥效評價體系不可缺少的一部分[6]。而計算機輔助藥物設計具有直觀、合理和便捷等特點,并逐漸成為中藥與現代化進程連接的橋梁,其中分子對接[7]是通過模擬藥物與受體大分子的相互作用,尋找與靶蛋白結合密切的候選化合物,可以進一步明確芫花中主要抗炎藥效物質,并闡明其藥理作用機制,優選主要抗炎化學成分及靶點蛋白,為芫花的藥理作用及產品開發等提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 芫花活性成分的篩選和處理

TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/index.ph)數據庫檢索出芫花所含的化學成分共57個。根據藥代動力學參數進行初步篩選[8],挑選出口服生物利用度(oral bioavailability, OB)大于30%,類藥性(drug-likenesses, DL)大于0.18的化合物共14個組成化合物數據庫,化合物名稱及具體相關信息見表1。口服生物利用度是藥物吸收、分布、代謝、排泄特性中尤為重要的參數之一,是表明藥效分子及類藥性的關鍵指數。類藥性是指有良好的臨床療效藥物的物理化學性質及生物學特性。在Chemdraw中繪制14個待對接化合物的平面結構,見圖1。在SYBYL-X2.0中創建數據庫,將這些化合物導入后進行能量最小化處理,使每個化合物有最穩定的構象,最后加入到創建的數據庫中。

表1 芫花中所含有化學成分的相關信息

圖1 芫花中14個化合物的結構

1.2 芫花活性成分作用靶點的篩選

從TCMSP數據庫中篩選得到的14個化合物通過Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)[9]數據庫進行靶標預測。PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中下載14個化合物的2D結構的SDF文件導入Swiss Target Prediction 數據庫中, Organism選擇Homo Sapiens,系統默認每個化學成分輸出前15個靶標蛋白,包括蛋白名稱、基因名稱等信息。

1.3 芫花活性成分作用靶點KEGG通路富集

將藥物疾病共有靶點進行KEGG通路富集分析,引用String(https://string-db.org/)數據庫,得到靶標蛋白所參與的所有途徑,篩選出與靶標蛋白顯著參與的途徑(P<0.05),使用R 3.6.3,安裝并引用clusterProfiler包后,進行前20條通路的氣泡圖繪制,包括通路名稱、富集因子、富集分析的P值等.

1.4 芫花活性成分與作用靶點的分子對接

采用分子對接軟件SYBYL-X2.0中的Surflex-Dock模塊完成分子對接研究。根據富集的通路結果,選取富集到基因數目最多的抗炎通路中潛在的靶點蛋白。本研究的靶點均從RSCB Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)數據庫中獲取。其中下載了fms related receptor tyrosine kinase 3(FLT3,PDB:6IL3)、spleen associated tyrosine kinase(SYK,PDBID:3FQH)、glycogen synthase kinase 3 beta(GSK3B,PDB: 3GB2)、insulin like growth factor 1 receptor(1GF1R,PDBID:3F5P)、epidermal growth factor receptor(EGFR,PDB: 3BEL)、kinase insert domain receptor(KDR,PDBID:2XIR)、erb-b2 receptor tyrosine kinase 2(ERBB2,PDB:3PP0)、interleukin 2(IL2,PDB:1M49)、phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha(PIK3CA,PDB:3ZIM)、phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit delta(PIK3CD,PDB:6PYR)、phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1(PIK3R1,PDB:4A55)、protein kinase C alpha(PRKCA,PDB:4RA4)、protein phosphatase 2 catalytic subunit alpha(PPP2CA,PDB:3P71)的晶體結構。蛋白晶體前處理及結合口袋的定義:提取原配體分子,刪除水分子及其非相關的蛋白質構象,補充非完整的氨基酸殘基,為蛋白加氫,以原配體分子位置為中心,選擇半徑5埃范圍內為活性口袋,其他參數為默認值。

按默認參數進行分子對接后,分別得到每個化合物與各靶點蛋白的對接得分Score值, Score值越大,配體與受體結合越穩定。Score 值大于 5.0 表明化合物與靶點蛋白有較好的結合活性,大于 7.0 表明化合物與靶點蛋白的結合具有強烈的活性[10]。

1.5 芫花活性成分-靶點網絡的構建

初步篩選得到的芫花活性成分(其中預測不到靶點以及篩選不到靶點的化合物不考慮)與選取的通路中的潛在靶標蛋白輸入到Cytoscape3.7.2網絡可視化軟件中,構建成分-靶點(compound-target,C-T)網絡,基于邊數、節點、關聯性設置顏色、大小。

1.6 芫花活性成分與靶點蛋白相互作用分析

LigPlot+是LigPlot的GUI界面化軟件,是一款經典的配體與蛋白二維相互作用作圖軟件,可展示配體分子與受體蛋白之間的氫鍵、疏水等相互作用。本研究采用Ligplot 1.4.5 版本,將芫花活性成分與靶標蛋白Merg并且以PDB格式保存,導入軟件中,自動計算形成的氫鍵、疏水作用。

2 結果與分析

2.1 芫花活性成分作用靶點KEGG通路分析

運用Swiss Target Prediction數據庫篩選芫花活性成分的作用靶點蛋白,其中8號化合物羥光刺苞菊內酯未預測到靶點蛋白,其余13個化學成分共篩選出195個靶點蛋白,將重復出現的靶點蛋白刪除,共篩選得到95個靶標蛋白,使用KEGG通路富集分析得到30條代謝途徑。使用R 3.6.3,安裝并引用clusterProfiler包后輸出前20條顯著通路,通路分析見圖2。

顏色越紅表示顯著性越明顯,氣泡越大表示富集到的基因數目越多。

2.2 芫花活性成分與作用靶點的分子對接

20條通路中選擇了富集到基因數目最多的抗炎通路:PI3K-Akt signaling pathway(P< 0.05)。PI3K-Akt通路包含14個靶點蛋白,其中protein phosphatase 2 regulatory subunit B'alpha(PPP2R5A)沒有原配體,未深入研究。將芫花活性成分與PI3K-Akt通路中除PPP2R5A以外的13個靶點蛋白進行分子對接。使用對接結果中的Score 值的大小來評價配體與受體結合的穩定性,挑選出Score值等于或大于5的化合物。結果表明木犀草素、槲皮素、山萘酚、羥基芫花素、芫花素、龍膽山酮酚、7-羥基-6-甲氧基-3,7'-雙香豆素、芫根苷、角鯊烯為芫花發揮抗炎作用的關鍵化學成分,對接總分大于65(表2)。

表2 活性成分與靶標蛋白分子對接打分結果

2.3 芫花活性成分-靶點網絡的構建

初步篩選得到的芫花活性成分(其中預測不到靶點以及篩選不到靶點的化合物不考慮)與選取的通路中的潛在靶標蛋白輸入到Cytoscape3.7.2網絡可視化軟件中,構建成分-靶點(compound-target,C-T)網絡。根據度(degree)的大小篩選關鍵靶點及化學成分,整個網絡中節點的大小與此節點的度呈正比,即與此節點相連的邊越多,度越大,節點也就越大。如圖3所示,EGFR、SYK、KDR芫花調節PI3K-Akt通路的關鍵靶標蛋白;木犀草素、山萘酚、羥基芫花素、槲皮素、龍膽山酮酚、芫花素等為芫花調節PI3K-Akt通路的關鍵化學成分,與分子對接結果一致。其中,圓圈代表關鍵靶點,菱形代表關鍵化學成分。

圖3 化學成分-靶標網絡模型

2.4 芫花活性成分與靶點蛋白相互作用分析

芫花中關鍵化學成分(Score>65)和epidermal growth factor receptor(EGFR)的相互作用分析結果見表3,結果顯示木犀草素、槲皮素、山萘酚、羥基芫花素、芫花素與EGFR相互作用有很大的相似性,從表3中可以看出均與Met793、Gln791、Thr790、Lys745、Leu844、Ala743等氨基酸殘基發生了相互作用,而且氨基酸殘基相對位置相同,氨基酸類型相同(表3),推測這些殘基就是epidermal growth factor receptor(EGFR)的關鍵氨基酸殘基。

表3 關鍵化學成分與EGFR形成的氫鍵及疏水作用

3 討 論

磷酸肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)是生長因子超家族信號傳導過程中的重要分子, 可被多種細胞因子和理化因素激活,調節多種細胞功能[11]。磷酸化的 PI3K 可以通過PDK1/Akt途徑激活 NF-κB并促進誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達,也可以通過Akt/mTOR途徑促進 STAT3 的轉錄表達。抑制 PI3K 可以顯著抑制 NF-κB的活化,進一步降低iNOS、COX-2、IL-6、IL-1β的表達,從而減輕炎癥[12]。研究表明[13],PI3K及其下游靶標Akt的激活對于TNF-α誘導的NF-κB激活至關重要。本研究通過網絡藥理學以及分子對接相結合的方法篩選出芫花發揮抗炎的關鍵成分及靶點,通過相互作用進一步明確重要的氨基酸殘基。結果表明,PI3K-Akt信號通路可能是芫花發揮抗炎作用的主要信號通路,木犀草素、槲皮素、山萘酚、羥基芫花素、芫花素等是芫花發揮抗炎作用的關鍵成分,EGFR、SYK、KDR是其發揮抗炎作用的主要靶點。EGFR 常在腫瘤細胞過表達,但該受體也廣泛存在表皮細胞,可刺激表皮細胞生長,抑制其分化,抑制炎癥并加速創面愈合。磷酸化的EGFR將胞外信號傳入細胞內,激活下游一系列多功能化的信號通路,包括Ras/Raf/MEK/MAPK/JAK/STAT和PI3K/AKT,主要參與細胞的增殖、分化和存活[14]。王莉[15]通過動物實驗發現,芫花具有良好的抗炎效果,芫花根總黃酮可能是通過抑制早期炎癥因子IL-1β和TNF-α的分泌,以減少炎癥因子PGE2、NO等晚期炎癥因子的產生。越來越多的結果表明[16],植物化學成分(如木犀草素)可通過抑制PI3K/Akt途徑減少內皮細胞的炎癥反應。此外,亦有研究[17]證明槲皮素和山萘酚可以通過抑制脂多糖誘導的STAT-1和NF-κB通路的激活,以及iNOS的表達發揮抗炎作用。槲皮素在體外可有效抑制血管平滑肌細胞增殖,并抑制膠原的合成和分泌,其機制可能與槲皮素激活PI3K/Akt/NF-κB信號通路,上調磷酸化PI3K及Akt表達,進而抑制NF-κB向核內轉運有關[18]。芫花素可以通過降低IKK、IκB和NF-κB的磷酸化水平來抑制NF-κB通路的激活,并下調iNOS、COX-2和IL-6 mRNA的表達水平發揮抗炎作用[19]。以上結果與本研究中網絡藥理學預測相互佐證。并且,本研究基于計算機輔助平臺建立了芫花藥理作用靶點快速篩選方法,相對于傳統篩選,節約了大量時間和財力,同時為芫花藥效評價提供新思路,為芫花細胞和動物實驗提供理論支撐。更重要的是,在中藥新藥研究領域建立全新的理念和先進的研究手段,可為中藥現代研究提供新思路和新方法。