海綿共附生真菌Penicillium sp.YZ-7的次級代謝產物

王魯敏,肖翠平

(煙臺大學化學化工學院,山東 煙臺 264005)

海綿(Marine sponge)是地球上最原始的無脊椎動物,其獨特的空腔結構和濾食性生活方式,使其擁有“微生物資源庫”的美譽[1]。近年來,越來越多的研究表明從海綿中分離得到活性物質需要微生物參與,有的甚至由微生物直接產生[2-4]。目前海洋微生物次級代謝產物已逐步形成系統的研究體系,從海洋微生物中分離得到的化合物數量正在急劇增加[5]。近年來研究人員從海洋真菌中分離得到了大量結構新穎的化合物,這些化合物往往具有廣泛的生物活性,如:抗病毒[6]、抗腫瘤[7]、抗污損[8]等。本文以分離自黃渤海潮間帶繁茂膜海綿(Hymeniacidonperleve)的一株共附生真菌Penicilliumsp.YZ-7為研究對象,對其次級代謝產物進行分離純化,分離得到9個化合物(結構式見圖1),并以海洋污損細菌為抗污損活性篩選模型對化合物進行抗污損活性初步評價。

圖1 化合物1—9的結構式

1 實驗部分

1.1 儀器試劑

超導核磁共振波譜儀AVANCE III 500(德國Bruker公司;高分辨質譜儀P776(美國Waters公司);旋轉蒸發儀R206(上海申生科技有限公司);ODS反相硅膠(日本YMC公司);Sephadex LH-20凝膠(美國GE公司);氘代試劑(Cambridge Isotope Laboratories, Inc.);其他有機試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 菌株分離與培養

分離鑒定:菌株YZ-7通過組織接種法分離自黃渤海潮間帶繁茂膜海綿Hymeniacidonperleve,經ITS序列比對及形態學分析,確定種屬為Penicilliumsp.。菌種保存于中國科學院煙臺海岸帶研究所生物學與生物資源利用重點實驗室-80 ℃冰箱。

菌株培養:取適量凍存在-80 ℃的50%甘油中的菌種于裝有20 mL培養基的50 mL三角瓶中,28 ℃搖床震蕩培養48 h獲得種子培養液。然后以1%的接種量轉接到裝有150 mL培養基的250 mL三角瓶中,28 ℃搖床震蕩培養48 h。然后以0.001接種量接種到裝有300 mL真菌培養基(培養基配方:蛋白胨5.0 g,酵母浸粉2.0 g,葡萄糖20.0 g,磷酸氫二鉀1.0 g,氯化鎂0.5 g,海水1000 mL,調節pH值至7～8)的1000 mL三角瓶中,共接種100瓶,于28 ℃靜態培養30 d。

1.3 提取與分離

代謝物提取:培養結束后,過濾分別得到發酵液上清液和菌絲體。發酵液上清液用乙酸乙酯萃取3次,得到發酵液乙酸乙酯提取物;菌絲體用甲醇浸泡24 h,提取3次,得到菌體甲醇提取物。合并得到粗浸膏46.3 g。

代謝物分離:總粗提物經減壓硅膠柱層析(100～200目),用石油醚-丙酮體系50∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶5梯度洗脫,經TLC分析,合并為8個組分(組分A—H)。組分C(151.1 mg)經硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1),得到2個亞組分C1和C2。其中,亞組分C1(36.5 mg)經硅膠柱層析,以二氯甲烷為洗脫劑洗脫得到化合物1(22.0 mg)。組分D(175.6 mg)經ODS反相硅膠柱層析(甲醇∶水=80∶20～100∶0,V/V),得到3個亞組分D1—D3。亞組分D1和D2經硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=8∶3)得到化合物2(10.6 mg)和化合物3(15.2 mg)。組分E(105.1 mg)經ODS反相硅膠柱層析(甲醇∶水=70∶30～100∶0,V/V),再經過反復的硅膠柱層析(二氯甲烷∶丙酮=5∶1,石油醚∶乙酸乙酯=1∶2)最終得到化合物4(12.8 mg)。組分F(2.2 g)經ODS反相硅膠柱層析(甲醇∶水=60∶40～100∶0,V/V),得到3個亞組分F1、F2和F3。亞組分F1(1.2 g)經Sephadex LH-20凝膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇=1∶1),得到2個次組分F11和F12。次組分F11和F22分別經硅膠柱層析(二氯甲烷∶乙酸乙酯=1∶1,二氯甲烷∶甲醇=40∶1)最終得到化合物5(12.6 mg)、化合物6(9.2 mg)和化合物7(15.0 mg)。組分H(1.6 g)經Sephadex LH-20凝膠柱層析(甲醇洗脫),得到2個亞組分H1和H2。H1和H2再經過硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇=10∶1～1∶1梯度洗脫)最終得到化合物8(15.3 mg)和化合物9(18.6 mg)。

1.4 抗海洋污損細菌測試

將污損細菌菌株蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis、葉氏假交替單胞菌P.elyakovii、銅綠假單胞菌P.aeruginosa接種于海水LB培養基中,37 ℃搖床活化24 h,然后將菌懸液稀釋至106 CF/mL。采用濾紙片法[9]來半定量地對分離得到的化合物的抗菌活性進行篩選,樣品用DMSO溶解,陰性對照組為DMSO,陽性對照組為氯霉素。每個濾紙片上的樣品量為100 μg/片,每次3個平行,濾紙片直徑6.0 mm。37 ℃生化培養箱培養24 h后用十字交叉法測量抑菌圈的大小。

2 結果與分析

2.1 化合物結構鑒定

化合物1:無色固體,ESI-MS:m/z396[M]+, 379[M-OH]+。1H-NMR(500 MHz, CDCl3):δH5.59(1H, m, H-6), 5.41(1H, m, H-7), 5.24(1H, dd,J=15.6, 7.8 Hz, H-23), 5.19(1H, dd,J=15.6, 7.8 Hz, H-22), 3.66(1H, m, H-3), 1.06(3H, d,J=6.6 Hz, H-21), 0.97(3H, s, H-19), 0.94(3H, d,J=6.8 Hz, H-28), 0.86(3H, d,J=7.1 Hz, H-27), 0.85(3H, d,J=7.2 Hz, H-26), 0.66(3H, s, H-18);13C-NMR(125 MHz, CDCl3):δC141.4(s, C-8), 139.8(s, C-5), 135.6(d, C-22), 132.0(d, C-23), 119.6(d, C-6), 116.3(d, C-7), 70.5(d, C-3), 55.7(d, C-17), 54.6(d, C-14), 46.3(d, C-9), 42.8(s, C-13), 40.8(d, C-24), 40.8(t, C-4), 40.4(d, C-20), 39.1(t, C-12), 38.4(t, C-1), 37.0(s, C-10), 33.1(d, C-25), 32.0(t, C-2), 28.3(t, C-16), 23.0(t, C-15), 21.1(t, C-11), 21.1(q, C-21), 20.0(q, C-26), 19.6(q, C-27), 17.6(q, C-28), 16.3(q, C-19), 12.1(q, C-18)。化合物1核磁數據與文獻[10]對照基本一致,被鑒定為麥角甾醇,分子式為C28H44O。

化合物2:無色晶體,APCI-MS:m/z429[M+H]+。1H-NMR(500 MHz, CDCl3):δH6.52(1H, d,J=8.5 Hz, H-7), 6.26(1H, d,J=8.5 Hz, H-6), 5.24(1H, dd,J=15.3, 7.6 Hz, H-23), 5.16(1H, dd,J=15.3, 8.3 Hz, H-22), 3.98(1H, m, H-3), 1.02(3H, d,J=6.6 Hz, H-21), 0.93(3H, d,J=6.9 Hz, H-28), 0.90(3H, s, H-19), 0.85(3H, d,J=6.9 Hz, H-27), 0.83(3H, s, H-18), 0.83(3H, d,J=6.8 Hz, H-26);13C-NMR(125 MHz, CDCl3):δC135.4(d, C-6), 135.2(d, C-22), 132.3(d, C-23), 130.7(d, C-7), 82.2(s, C-5), 79.4(s, C-8), 66.4(d, C-3), 56.2(d, C-17), 51.7(d, C-14), 51.1(d, C-9), 44.6(s, C-13), 42.8(d, C-24), 39.7(d, C-20), 39.3(t, C-12), 37.0(s, C-10), 36.9(t, C-4), 34.7(t, C-1), 33.1(d, C-25), 30.1(t, C-2), 28.6(t, C-15), 23.4(t, C-11), 20.9(q, C-21), 20.6(t, C-16), 20.0(q, C-27), 19.6(q, C-26), 18.2(q, C-19),17.6(q, C-28), 12.9(q, C-18)。化合物2核磁數據與文獻[11]對照基本一致,被鑒定為(22E,24R)-5α,8α-epidioxy-ergosta-6,22-dien-3β-ol,分子式為C28H44O3。

化合物3:白色固體,APCI-MS:m/z427[M-H]-。1H-NMR(500 MHz, CDCl3):δH5.22(2H, m, H-22 and 23), 4.25(1H, brs, H-7), 3.98(1H, m, H-3), 3.34(1H, d,J=2.7 Hz, H-6), 1.16(3H, s, H-19),1.04(3H, d,J=6.6 Hz, H-21), 0.94(3H, d,J=6.8 Hz, H-28), 0.86(3H, d,J=7.0 Hz, H-27), 0.84(3H, d,J=7.0 Hz, H-26), 0.61(3H, s, H-18);13C-NMR(125 MHz, CDCl3):δC135.6(d, C-22), 134.5(s, C-8), 132.0(d, C-23), 126.9(s, C-9), 68.6(d, C-3), 67.1(d, C-7), 65.6(s, C-5), 62.6(d, C-6), 53.7(d, C-17), 49.6(d, C-14), 42.8(d, C-24), 42.1(s, C-13), 40.4(d, C-20), 39.2(t, C-4), 38.0(s, C-10), 35.7(t, C-12), 33.1(d, C-25), 30.9(t, C-1), 30.2(t, C-2), 29.0(t, C-16), 23.8(t, C-15), 23.4(t, C-11), 22.8(q, C-19), 21.0(q, C-21), 20.0(q, C-27), 19.6(q, C-26), 17.6(q, C-28), 11.3(q, C-18)。化合物3核磁數據與文獻[12]對照基本一致,被鑒定為(22E,24R)-5α,6α-epoxy-ergosta-8,22-dien-3β,7α-diol,分子式為C28H44O3。

化合物4:紅色固體,EI-MS:m/z538[M]+。1H-NMR(500 MHz, 丙酮-d6):δH12.88(2×1H, s, 4,5-OH), 12.12(1H, s, 2-OH), 7.33(1H, s, H-6), 7.11(1H, s, H-8), 6.80(1H, s, H-3), 2.39(3H, s, 7-CH3);13C-NMR(125 MHz, 丙酮-d6):δC190.9(s, C-10), 182.1(s, C-9), 165.4(s, C-2), 164.1(s, C-4), 162.0(s, C-5), 148.5(s, C-7), 133.9(s, C-8a), 132.2(s, C-10a), 123.4(d, C-1), 122.7(d, C-6), 120.5(s, C-8), 113.4(s, C-9a), 110.0(s, C-4a), 107.6(d, C-3), 21.0(q, 7-CH3)。化合物4核磁數據與文獻[13]對照基本一致,被鑒定為醌茜素,分子式為C30H18O10。

化合物6:無色晶體。1H-NMR(500 MHz, CD3OD):δH7.04(2H, d,J=8.6 Hz, H-2,6), 6.73(2H, d,J=8.6 Hz, H-3,5), 3.35(2H, t,J=7.5 Hz, H-7), 2.70(2H, t,J=7.5 Hz, H-8), 1.92(3H, s, H-2′);13C-NMR(125 MHz, CD3OD):δC171.8(s, C-1′), 155.5(s, C-4), 129.8(s, C-1), 129.3(d, C-2,6), 114.8(d, C-3,5), 41.0(t, C-7), 34.2(t, C-8), 21.1(q, C-2′)。化合物6核磁數據與文獻[15]對照基本一致,被鑒定為N-乙酰基酪胺,分子式為C10H13NO2。

化合物7:無色晶體。1H-NMR(500 MHz, CDCl3):δH8.24(1H, brs, 1-NH), 7.63(1H, d,J=7.7 Hz, H-4), 7.41(1H, d,J=8.2 Hz, H-7), 7.24(1H, td,J=8.1, 1.1 Hz, H-6), 7.16(1H, td,J=8.0, 1.0 Hz, H-5), 7.06(1H, d,J=2.3 Hz, H-2), 3.63(2H, dd,J=12.7, 6.6 Hz, H-11), 3.00(2H, t,J=6.7 Hz, H-10), 1.95(3H, s, H-2′);13C-NMR(125 MHz, CDCl3):δC170.1(s, C-1′), 136.4(s, C-8), 127.4(s, C-9), 122.2(d, C-2), 122.0(d, C-6), 119.5(d, C-5), 118.7(d, C-4), 113.0(s, C-3), 111.3(d, C-7), 39.8(t, C-11), 25.3(t, C-10), 23.4(q, C-2′)。化合物7核磁數據與文獻[16]對照基本一致,被鑒定為N-乙酰基色胺,分子式為C12H14N2O。

化合物8:無色晶體。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6):δH4.40(2H, d,J=5.6 Hz, C2,5—O—H), 4.32(2H, t,J=5.7 Hz, C1,6—O—H), 4.13(2H, d,J=7.0 Hz, C3,4—O—H);13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6):δC71.8(d, C-3, 4), 70.2(d, C-2, 5), 64.3(t, C-1, 6)。化合物8核磁數據與文獻[17]對照基本一致,被鑒定為己六醇,分子式為C6H14O6。

化合物9:無色晶體。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6):δH4.48(1H, d,J=5.5 Hz,), 4.44(1H, t,J=5.4 Hz), 4.34(1H, t,J=5.8 Hz), 4.22(1H, d,J=6.3 Hz), 4.15(H, d,J=7.4 Hz);13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6):δC71.9(d, C-3), 71.0(d, C-2), 70.6(d, C-4), 64.2(t, C-1), 63.4(t, C-5)。化合物9核磁數據與文獻[18]對照基本一致,被鑒定為木糖醇,分子式為C5H12O5。

2.2 抗海洋污損細菌活性評價

按照實驗部分1.4所述方法對分離得到的化合物1—9進行抗海洋污損細菌研究。從表1可以看出化合物1、3、4、5、6、7對這三種污損細菌均有一定的抑制作用,化合物3和4對三種污損細菌有中等強度的抑制作用,化合物2和8對三種污損細菌沒有抑制作用。

表1 化合物1—9的抗菌活性

3 結 論

從繁茂膜海綿共附生青霉屬真菌Penicilliumsp.YZ-7分離得到9個化合物,3個麥角甾醇類化合物、醌茜素、1個二酮哌嗪、2個酰胺類化合物、2個糖醇。以海洋污損細菌為抗污損活性篩選模型對化合物進行抗污損活性初步評價,發現化合物(22E,24R)-5α,6α-epoxy-ergosta-8,22-dien-3β,7α-diol和醌茜素對三種污損細菌有中等強度的抑制作用。