超高效液相色譜-串聯質譜法快速篩查中成藥中49種違法添加化學藥物

許曉輝，楊志敏，吳興強，吳福祥，張 文，馮 翀，王小喬*

(1.蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，甘肅 蘭州 730050;2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176)

中成藥是以中醫藥理論為指導，以中藥材為原料，按規定的處方和方法加工成具有一定劑型的藥物。近年來,藥品流通市場上存在打著天然中藥制劑的旗號，卻在中成藥中違法添加化學藥物以增強療效的現象[1-2]。由于中成藥的化學成分復雜，使得在其中違法添加化學藥物具有隱蔽性，不易被發現，若被患者長期服用會造成不可逆轉的健康損害，導致一系列不良反應，甚至危及生命安全。開展中成藥中違法添加化學藥物的監控對于保證中成藥的安全使用具有重要意義。

目前，采用液相色譜-質譜聯用技術監測中成藥中違法添加化學藥物的應用研究日漸增多，能夠監控的藥物類別也在增多[3-12]。國家藥品監管部門歷來嚴厲打擊中成藥中違法添加化學藥物，頒布了相關檢測標準與檢驗方法，如止咳平喘類(批準件編號2009031)、抗風濕類(批準件編號2009025)、降糖類(批準件編號2009029)、安神類(批準件編號2009024)、補腎壯陽類(批準件編號2009030)、降壓類(批準件編號2009032)等[13]。這些標準與檢驗方法大部分采用液相色譜和液相色譜-質譜聯用方法，對于復雜樣品中痕量組分的檢測常用三重四極桿質譜(QQQ)及多反應監測模式(MRM)，QQQ的MRM模式具有較高的靈敏度和選擇性。從監控現狀來看，違法添加化學藥物一般是多類別多組分同時添加，化合物數目達到幾十種甚至上百種，因此通常要求一針進樣實現多類別多組分化合物的監測，此時選用MRM會受循環時間限和離子駐留時間限的影響，導致檢測靈敏度和選擇性下降。動態多反應監測模式(d-MRM)[14-15]消除了以上限制，當組分離子從液相色譜洗脫時，d-MRM只監測組分離子，可根據保留時間自動分配采集時間和采集點數，能夠獲得所需的循環時間，保證每個峰均能獲得足夠的數據點和定量分析的準確度，對于共流出峰能最大限度利用離子駐留時間，在保持恒定循環時間的同時可增強分析物的信噪比，以顯著改善樣品負載循環時間，提高監測化合物的靈敏度和選擇性。

本文運用超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)的d-MRM模式建立了中成藥中違法添加化學藥物的測定方法，根據化合物的質譜響應、峰形以及加標回收率，最終篩選出8類49種目標藥物，包括止咳平喘類、抗風濕類、 降壓類、降糖類、 減肥類、輔助降血脂類、補腎壯陽類、鎮靜安神類。該方法前處理簡單，一針進樣可在15 min內實現49種藥物的同時測定，能夠為中成藥中違法添加化學藥物的監測提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

1290-6460超高效液相色譜-質譜聯用儀：配有電噴霧離子源(美國安捷倫有限公司)；MS105DU分析天平(梅特勒-托利多公司)；真空泵(天津市津騰實驗設備有限公司)；移液器(20 μL、100 μL、1 mL)、5810R離心機(德國Eppendorf公司)；Vortex-genie 2渦旋混合器(美國Scientific公司)；SBL-10DT超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)；甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)，甲酸、乙酸銨(色譜純，東京化成工業株式會社)。

對照品：除伐地那非二鹽酸鹽購自Dr.Ehrenstorfer GmbH，羥基豪莫西地那非、他達拉非、利血平購自北京曼哈格生物科技有限公司外；其他標準品均購自中國食品藥品檢定研究院，純度≥98.3%。供試樣品來源于涉案委托檢驗樣品、網購樣品、委托檢驗樣品等，樣品劑型為膠囊、片劑和顆粒劑。

1.2 色譜-質譜條件

色譜柱：C18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；流動相：A為0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～2.0 min，10%B；2.0～3.0 min，10%～35%B；3.0～4.0 min，35%B；4.0～5.0 min，35%～40%B；5.0～6.0 min，40%B；6.0～12.0 min，40%～85%B；12.0～14.0 min，85%B；14.0～14.1 min，85%～10%B；14.1～15.0 min，10%B。

電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，d-MRM掃描模式，霧化氣為N2，干燥氣流速為8 L/min，噴霧電壓為500 V，氣流溫度為325 ℃，毛細管電壓為4 000 V，鞘氣流速為12 L/min，鞘氣溫度為350 ℃；其他質譜條件見表1。

表1 49種藥物的主要質譜參數Table 1 The main mass spectral parameters of 49 drugs

*quantitative ions

1.3 溶液制備

1.3.1 對照溶液49種藥物標準儲備溶液：精密稱取10.0 mg各對照品，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成質量濃度均為1 mg/mL的儲備液，于4 ℃冷藏備用。混合標準中間溶液：分別準確吸取上述標準儲備溶液0.025 mL至25 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，配制成1 μg/mL的混合標準中間溶液，于4 ℃冷藏備用。混合標準使用溶液：精密移取上述混合標準中間溶液1.00 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，即得。

1.3.2 供試品溶液精密稱取樣品1 g，置于50 mL離心管中，精密加入10.00 mL乙腈，渦旋1 min，在300 W功率下超聲提取30 min，放冷至室溫，5 000 r/min離心10 min，上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾，續濾液作為待測液。

1.3.3 陰性樣品溶液取未檢出49種藥物的樣品，按照“1.3.2”步驟制成陰性樣品溶液，即空白基質樣品溶液。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的選擇

本文的49種目標藥物大部分在甲醇和乙腈中具有良好的溶解性，因此對比了分別以甲醇和乙腈為提取溶劑時的提取效果。結果表明，兩個提取溶劑的回收率均在85.0%以上。考慮到乙腈毒性小、價格低，因此選擇以乙腈為提取溶劑，并采用超聲輔助提取，提取溶液經離心后取上清液，過0.22 μm微孔濾膜。優化的前處理條件如“1.3.2”所示。

2.2 色譜條件的優化

由于49種藥物的極性相差較大，因此選擇適于極性化合物分離的C18色譜柱。在流動相的選擇上，由于甲酸可提高藥物在ESI+模式下的離子化效率，乙酸銨可穩定水相和改善峰形，因此考察了水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈以及0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液3種流動相的分離效果。實驗發現，以0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液為流動相時，大部分目標藥物的分離效果、檢測時間及靈敏度均較優，故本方法選其作為流動相。優化的色譜條件如“1.2”所示。

2.3 質譜條件的優化

由于目標藥物種類多，采用MRM采集模式時受循環時間限的影響，導致有些藥物的響應低。因此，將待測藥物分別配制成單個標準溶液，利用MassHunter采集軟件，以手動和自動兩種方式同時優化定性和定量離子、碰撞能量、裂解電壓等參數，建立MRM方法。為了建立d-MRM方法，首先在MRM方法下分析混合標準使用溶液，將所采集數據文件從MassHunter質譜采集工作站軟件導入自動生成d-MRM方法，包含化合物名稱、MRM離子對、碎裂電壓、碰撞能量、動態MRM的保留時間和保留時間增量窗口，對于軟件不能自動識別保留時間及保留時間增量窗口的化合物，在安捷倫定性軟件通過提取化合物的離子對手動識別。優化的質譜條件如“1.2”所示。

圖1 49種藥物的MRM總離子流圖(50 ng/mL)Fig.1 MRM of total ion chromatogram of 49 drugs(50 ng/mL)

以d-MRM 模式測定49種藥物的定性和定量離子對色譜圖，共有98個離子監測通道。圖1為49種藥物混合標準溶液(50 ng/mL)的總離子流圖，各化合物峰形對稱，每個檢測通道無干擾，定量準確可靠。

2.4 專屬性考察

取“1.3.3”陰性樣品溶液 2 μL，按“1.2”條件進樣并采集譜圖，得到陰性樣品溶液的 MRM 色譜圖(圖略)，均無干擾49種化學藥物的色譜峰。結果表明，樣品基質不干擾目標物的測定，方法專屬性好。

2.5 線性關系與檢出限

用空白基質樣品溶液稀釋混合標準使用溶液，得到質量濃度分別為0、2、5、10、20、30、40、50、60 ng/mL的標準曲線溶液，采用本方法進行測定。以待測藥物的質量濃度為橫坐標(x，ng/mL)，對應組分的定量離子對峰面積為縱坐標(y)，得到各藥物的線性回歸方程。將混合標準使用溶液加入空白基質中，加標濃度逐級遞減至1.0 ng/mL，按“1.3.2”方法處理后上機檢測，以3 倍信噪比計算各藥物的檢出限(LOD)。結果顯示，49種藥物在0～60 ng/mL范圍內線性關系良好，r2為0.993 2～0.999 5，檢出限為0.290～2.546 ng/g(見表2)。

表2 49種藥物的線性關系、檢出限、回收率與相對標準偏差Table 2 Linear relationships,limits of detection,recoveries and RSDs of 49 drugs

圖2 西地那非(A)與他達拉非(B) 陽性樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of positive samples for sildenafil(A) and tadalafil(B)

2.6 回收率與相對標準偏差

在陰性樣品中分別按15.0、35.0、70.0 ng/g 3個濃度添加混合標準中間溶液，平行制備3份樣品，按“1.3.2”方法進行處理后上機檢測，每份樣品重復測定3次。結果顯示，49種藥物的平均回收率為86.4%～107%，相對標準偏差(RSD)為0.80%～3.5%(見表2)。

2.7 實際樣品測定

采用本方法測定收集的20批樣品，發現陽性樣品5批，檢出的藥物為二甲雙胍、苯乙雙胍、格列苯脲、西地那非、他達拉非和西布曲明，檢出量分別為0.076 97、1.153、0.013 41、69 500、2 400、724.0 mg/kg。西地那非與他達拉非陽性樣品的總離子流色譜圖見圖2。

3 結 論

本研究通過優化前處理方法、色譜條件和質譜條件，采用動態多反應監測模式，建立了一種同時測定多類別違法添加化學藥物的UPLC-MS/MS檢測方法，并進行了方法學考察。運用建立的方法測定20批實際樣品，檢出了二甲雙胍、苯乙雙胍、格列苯脲、西地那非、他達拉非和西布曲明。該方法前處理簡單，靈敏度高，準確度好，專屬性強，適用于中成藥中違法添加化學藥物的檢測。