基于低共熔溶劑的分散液液微萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法測定馬肉中非甾體抗炎藥

鄭書展，任彩霞，張春艷，王曉敏，盛萬里

(呼和浩特海關技術中心，內蒙古 呼和浩特 010020)

非甾體抗炎藥(NSAIDs) 在抗炎、止痛、退熱和抗凝血等方面療效顯著，是目前動物養殖業中使用最廣泛的獸藥種類之一[1]。常見的非甾體抗炎藥有苯基丁氮酮、氟尼辛、萘丁美酮、萘普生、托芬那酸、乙酰氨基酚等。近年的研究表明這類抗炎藥具有明顯的毒副作用，會引起胃腸道、血液、腎臟系統等的不良反應，其中較常見的是腸胃潰瘍類嚴重副作用[2]。NSAIDs可在動物肌肉、牛奶、肝臟和脂肪中積累，會通過食物鏈對消費者健康構成威脅[3]。其殘留問題已引起各國食品安全監管部門的重視，美國、歐盟、日本等國家均對該類抗炎藥的最大殘留量進行了限定[4]。

馬肉肉質鮮嫩，脂肪較少，有獨特的鮮香味道，是一類營養價值較高的肉類食品[5]。20世紀60年代以來中國馬肉產量逐漸提高，到2010年，中國已成為世界馬肉最大生產國。近年來，我國馬肉進口量也呈上升趨勢，以我國進口蒙古國馬肉唯一指定口岸二連浩特為例，2017年進口2.3萬噸，2018年進口達2.9萬噸[6-7]。然而在馬的飼養過程中存在非法使用非甾體抗炎藥的情況，2013年歐洲“馬肉風波”中，歐盟檢測結果顯示有0.5%的待測馬肉檢出含有苯基丁氮酮[8]。而苯基丁氮酮會引起人類再生障礙性貧血，國際上已嚴禁用于食用動物中。為有效監控馬肉品質，有必要建立更為快速、高效的馬肉中非甾體抗炎藥殘留的檢測方法。

目前，非甾體抗炎藥殘留的檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法、氣相色譜-串聯質譜法、毛細管電泳法、薄層色譜法和分光光度法等[9-16]。其中，液相色譜-串聯質譜法因靈敏度和選擇性高在NSAIDs殘留分析中最為常用。非甾體抗炎藥的樣品前處理方法主要有固相萃取[17-19]、液-液萃取[20]和固相微萃取等[21-22]，但這些前處理方式存在操作繁冗、時間長、溶劑用量大、不環保、成本高等不足。分散液液微萃取(Dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)是一種集采樣、富集、分離于一體的樣品前處理技術，具有萃取溶劑用量小、成本低、富集效果好、操作簡便和環境友好等優點，已在殘留檢測中受到廣泛關注[23-24]。各類新型DLLME萃取劑不斷涌現[25]，其中低共熔溶劑(Deep eutectic solvent,DES)由于其毒性低、可降解、原料豐富、價格低廉、制備簡單的特點得到較多應用[26-30]，例如，Dil等[31]開發了基于DES的人尿中甲芬那酸含量的測定方法：Shishov等[32]將DES用于牛奶中非甾體抗炎藥的測定。然而，現有文獻均聚焦于液態樣品的前處理，目前尚無基于DES的分散液液微萃取技術用于動物肌肉等固態樣品中非甾體抗炎藥的檢測報道。

本研究以廉價易得的氯化膽堿和苯酚為原料經過簡單混合合成疏水性DES，并將其作為萃取溶劑，建立了分散液液微萃取結合超高效液相色譜-串聯質譜技術測定馬肉中10種非甾體抗炎藥的方法。該方法操作簡單、準確高效、環保節約，為拓展獸藥殘留檢測的樣品前處理技術提供了新的思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1260-6460超高效液相色譜-串聯質譜儀(美國安捷倫公司)，ST16R冷凍離心機(美國Thermo公司)，Vortex-Genie 2渦旋振蕩器(美國Scientific Industries)。苯基丁氮酮、氟尼辛、萘丁美酮、萘普生、雙氯芬酸、舒林酸、酮洛芬、托芬那酸、吲哚美辛、乙酰氨基酚標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司，純度均大于98%。氯化膽堿(ChCl，分析純，麥克林公司)，苯酚(分析純，天津風船化學試劑科技公司)，抗壞血酸(分析純，阿拉丁公司)，乙腈(色譜純，安譜公司)，實驗用水為Milli-Q 超純水，含10 mmol/L抗壞血酸的20 mmol/L醋酸銨緩沖液(乙酸調至pH 3.5)。

1.2 標準溶液的配制

將各標準品用乙腈稀釋成1.0 μg/mL的標準儲備液，于冰箱4 ℃避光保存。臨用前以乙腈混合逐級稀釋成低濃度混合標準工作溶液，使用時以乙腈稀釋成所需濃度的標準工作液。

表1 低共熔溶劑的合成Table 1 Synthesis of deep eutectic solvents

1.3 DES的制備

按照表1中的比例分別稱取氯化膽堿和氫鍵供體，置于50 mL具塞試管中，其中DES-1～DES-5采用60 ℃加熱攪拌方式，DES-6～DES-9采用室溫渦旋振蕩混合，直至得到透明澄清的均一液體。

1.4 樣品前處理

取代表性馬肉樣品約500 g，用組織搗碎機充分搗碎混勻，裝入潔凈容器作為試樣，置于-18 ℃冷凍避光保存。稱取2.5 g攪碎均勻的試樣，加入5 mL含抗壞血酸的醋酸銨緩沖液，混勻振蕩10 min，加入1.0 g氯化鈉和0.8 mL低共熔溶劑，混勻1 min，再加入0.8 mL分散劑乙腈，渦旋混勻1 min，10 000 r/min離心5 min。取上清液，用少量乙腈定容至1.0 mL，過濾膜后待測定。

1.5 色譜-質譜條件

色譜條件：Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)柱，流動相：A為含5 mmol/L乙酸銨+0.1% 甲酸的水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0.0～3.0 min，20%～60%B；3.0～4.0 min，60%～90%B；4.0～4.5 min，90%～20%B；4.5～7.0 min，20%B；流速：0.2 mL/min；進樣量：5 μL。

質譜條件：三重四極桿質譜，電噴霧(ESI)電離源，采用正離子模式，多反應監測(MRM)模式;干燥氣溫度為325 ℃；干燥氣流量為10 L/min；霧化氣壓力為137.9 kPa；毛細管電壓為4 000 V。其他參數見表2。

表2 10種非甾體抗炎藥的質譜參數Table 2 MS/MS parameters of ten non-steroidal anti-inflammatory drugs

*quantitative ion

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的優化

不同于液態樣品的處理方式，肌肉等固態樣品需先用溶劑提取后再進行分散液液微萃取。本實驗考察了不同pH值(pH 3.5、5.0、7.5、9.5)的20 mmol/L醋酸銨緩沖溶液對馬肉樣品中10種藥物的提取效率。結果顯示，10種藥物在酸性條件下的提取效率明顯高于中性和堿性條件，這是由于非甾體藥物中多含有N、O、S等雜原子和酰胺鍵、羧基鍵等，在酸性條件下易離子化，有利于提高化合物在水中的溶解度。文獻[33]報道紅細胞的存在會導致苯基丁氮酮氧化分解，使用10 mmol/L抗壞血酸可避免分解，本文最終選擇提取溶劑為含10 mmol/L抗壞血酸的20 mmol/L醋酸銨緩沖溶液(乙酸調至pH 3.5)。

圖1 不同萃取劑對NSAIDs萃取效率的影響Fig.1 Effect of various extraction agents on extraction efficiencies of NSAIDs

2.2 DES萃取劑的選擇

氯化膽堿無毒安全、價格低，廣泛用作DES的氫鍵受體[27]。本研究使用氯化膽堿按照表1合成了9種DES，按照“1.4”方法對10種目標物進行分散液液微萃取。結果顯示，DES-1、DES-2、DES-3的水溶性較好，不能形成兩相系統，無法萃?。籇ES-4、DES-5的黏度較大，不利于在水相中分散，操作難度大；以苯酚為氫鍵供體合成的DES-6、DES-7、DES-8、DES-9作為萃取劑時，可通過加入少量分散劑實現快速萃取，其中氫鍵受體和氫鍵供體比例為1∶2制得的DES-7萃取效率最佳(見圖1)。進一步考察了DES-7用量(0.3、0.5、0.8、1.0 mL)對目標物萃取效果的影響，發現其用量為0.3 mL時難以收集DES層，測定結果不穩定；隨著DES-7用量的增加，待測物的萃取效率均呈上升趨勢，用量為0.8 mL時可獲得較好結果，繼續增加用量萃取效率無顯著變化，因此選擇DES-7萃取劑用量為0.8 mL。

2.3 分散劑的選擇

常用分散劑包括乙腈、丙酮、四氫呋喃、甲醇等，考察結果顯示乙腈、丙酮、四氫呋喃均能使DES萃取劑在水相中分散成細小液滴，增大萃取劑與待測物的接觸面積。上述3種分散劑形成兩相系統的分散能力：四氫呋喃>乙腈>丙酮，但對待測物的萃取效率：乙腈>四氫呋喃 >丙酮，綜合考慮選擇乙腈作為分散劑?？疾炝艘译嬗昧?0.3、0.5、0.8、1.0、1.5 mL)對目標物萃取效果的影響，發現萃取效率隨乙腈體積的增加而增大，乙腈用量為0.8 mL時萃取效率達到最大值，此后則隨乙腈用量的增加而減小。這是因為乙腈用量少時分散效果差，萃取劑未能均勻分散于水相中，導致萃取效率低；當乙腈用量過大時，會影響待測物在水相中的溶解度，導致萃取效率降低，因此實驗選擇分散劑乙腈的最佳用量為0.8 mL。

2.4 鹽加入量的影響

氯化鈉可通過鹽析作用降低非甾體藥物在提取液中的溶解度，同時還能促進萃取劑在水相中的分散，因此鹽的加入能夠促進待測物在DES萃取劑相的分配。考察了氯化鈉加入量分別為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 g時10種非甾體抗炎藥的萃取效率，結果表明，隨著氯化鈉加入量的增加，待測物的萃取回收率逐漸提高，其中舒林酸和吲哚美辛在氯化鈉加入量為1.5 g時的回收率最高，其他8種待測物在氯化鈉加入量為1.0 g時回收率最高。綜合考慮選擇氯化鈉加入量為1.0 g。

2.5 基質效應

由于肌肉基質復雜，蛋白質、脂肪、磷脂和內源性代謝物等對待測物檢測有顯著干擾并影響結果的準確性[34]。采用提取后加入法計算絕對基質效應，公式為：基質效應(ME)=(空白基質中待測物質的響應值/乙腈中待測物質的響應值)×100%，ME>1為基質增強效應，ME<1為基質抑制效應。結果表明，苯基丁氮酮為中等強度的基質增強效應，ME=1.46；其余9種待測物為基質抑制效應，ME為0.40～0.71。為消除基質效應帶來的定量偏差，本實驗采用基質匹配標準工作溶液進行定量。

2.6 方法學考察

2.6.1 標準曲線及檢出限在基質溶液中添加混合標準工作溶液，采用本方法進行測定，以各組分的峰面積為縱坐標(y)，質量濃度為橫坐標(x，ng/mL)，在優化實驗條件下考察了10種非甾體抗炎藥的線性關系。結果顯示，苯基丁氮酮、萘普生、托芬那酸、乙酰氨基酚的線性范圍為5.0～100 ng/mL，其余6種藥物的線性范圍為0.1～10 ng/mL，相關系數(r2) 均大于0.996。根據3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD) ，10倍信噪比(S/N=10) 計算定量下限(LOQ)，得到10種非甾體抗炎藥的LOD為0.05～2.0 μg/kg，LOQ 為0.10～5.0 μg/kg(見表3)。

表3 10種NSAIDs的線性范圍、線性方程、相關系數、方法檢出限及定量下限Table 3 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients(r2) ，the method detection and quantitation limits of ten analytes

2.6.2 回收率與相對標準偏差選取陰性馬肉樣品，分別添加3個濃度水平的非甾體抗炎藥混合標準溶液，混合均勻后按本方法進行前處理和檢測，每個濃度水平平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差(RSD)。表4結果顯示，在5.0、10、25 μg/kg 3個加標水平下，10種NSAIDs的平均回收率為73.5%～94.6%，RSD為1.1%～ 8.1%，方法能夠滿足馬肉中多種非甾體抗炎藥的測定要求。圖2為陰性馬肉低水平(5.0 μg/kg)加標樣品的MRM圖。

2.7 實際樣品檢測

應用本方法對蒙古國進口5批冷凍馬肉和農貿市場銷售2份馬肉樣品進行檢測，均未檢出10種非甾體抗炎藥。選取1個蒙古國進口冷凍馬肉樣品，按5.0 μg/kg水平添加NSAIDs混合標準溶液，按照本方法進行提取并測定，得到加標回收率為78.3%～93.2%，符合質控要求，方法可用于實際樣品分析。

表4 馬肉樣品中10種非甾體抗炎藥的平均回收率及相對標準偏差(n=6)Table 4 Average recoveries and RSDs of 10 NSAIDs in horse meat(n=6)

2.8 與標準方法的對比

將本方法與現行標準SN/T 2190-2008[9]和GB/T 20754-2006[10]方法進行比較，見表5。與傳統的液液萃取法和固相萃取法相比，本方法的有機溶劑用量明顯減少，大大降低了實驗成本以及對環境和操作人員的危害；操作簡單，萃取與凈化一步完成，耗時短、效率高；檢測靈敏度與標準方法相當或有所提高。

表5 本方法與標準方法的對比Table 5 Comparison between the method in this paper and the standard methods

3 結 論

本文建立了一種基于低共熔溶劑的分散液液微萃取/超高效液相色譜-串聯質譜技術測定馬肉中10種非甾體抗炎藥的方法，以廉價易得的氯化膽堿和苯酚經過簡單混合合成低共熔溶劑，減少了溶劑用量，節約了分析成本，降低了環境污染，且前處理操作簡單快捷，在保證提取效率的同時縮短了萃取時間。方法檢出限為0.05～2.0 μg/kg，平均回收率為73.5%～94.6%，RSD小于10%。該方法穩定可靠，滿足動物源性食品質量監測的需求，為DES在獸藥殘留檢測中的應用提供了新的思路。