山莨菪堿抑制JAK2/STAT3的磷酸化緩解博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化及病理損傷①

羅靜莉 袁 利 明 玥 易建梅 張 靜 彭夏瑩四川省醫學科學院四川省人民醫院呼吸與內科危重癥科成都610072

肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是多種肺疾病的終末期改變,主要表現為進行性呼吸困難、肺換氣功能障礙、炎癥損傷、肺實質結構破壞等[1]。大部分PF患者病因未明,被稱為特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF),預后較差,其發病率和死亡率呈逐年增加的趨勢[2]。目前,IPF患者主要采用藥物治療、機械通氣、肺移植等手段來治療,但其治療效果并不十分理想[3]。因此,尋找更加安全有效的藥物改善患者的肺纖維化,成為了當前的研究熱點。山莨菪堿(anisodamine,ADM)是從山莨菪中提取的一種生物堿,具有明顯的外周抗膽堿作用,對胃腸道痙攣、血管痙攣、各種神經痛、眩暈等均有良好的治療效果[4]。近年來研究顯示,ADM還可以調節血流動力學、抗氧化、抑制細胞凋亡和細胞內鈣超載等作用,能抑制肝組織纖維化,但其在IPF中的作用及機制尚不清楚[5-6]。因此,本研究探討了ADM對IPF的作用及機制,旨在為臨床IPF的治療提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 儀器與試劑 多功能酶標檢測儀(iMark680)購自Bio-Rad公司；小動物肺功能測定儀購自北京悅宏達責任有限公司；ADM購自杭州民生藥業有限公司,國藥準字H33021706；博萊霉素(bleomycin,BLM)購自日本化藥株式會社高崎工廠,注冊證號H20090885；AG490(JAK2抑制劑)購自上海恒斐生物科技有限公司；TUNEL檢測試劑盒購自上海嶸崴達實業有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；轉化生長因子β(transforming growth factor,TGF-β)、α肌動蛋白(αsmooth muscle aorta, α-SMA)、 纖連蛋 白(Fibronectin)、Ki67、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved Caspase-3)、Caspase-3、原癌基因c-Myc、p-JAK2、JAK2、p-STAT3和STAT3單克隆抗體,均購于美國Santa Cruz公司；β-actin和辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)標記羊抗兔IgG購于DAKO公司。

1.1.2 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠60只,體重均為180～200 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,動物許可證號SCXK(京)2015-0001,飼養于本院動物中心實驗室,保持室溫恒定為25℃,模擬晝夜,自由攝食與飲水。

1.2 方法

1.2.1 動物造模及給藥 60只大鼠預飼養1周后,將其隨機分為對照組,BLM組,ADM高、中、低劑量組和AG490組各10只。除對照組外,所有大鼠均采用氣管內注射BLM誘導IPF模型[7]。腹腔注射2%的戊巴比妥鈉(0.2 ml/100 g)麻醉,常規消毒頸部皮膚,于頸部正中行一切口,暴露氣管,氣管內注射100μl BLM溶液(5 mg/kg),注入后將大鼠直立并旋轉數圈,使藥液均勻分布,對照組注入等體積生理鹽水。造模后經聽診器可聽到造模大鼠喉中哮鳴音,則為造模成功。造模后,ADM高、中、低劑量組腹腔注射ADM(劑量依次為1 mg/kg、0.5 mg/kg、0.25 mg/kg),1次/d,連續注射4周,AG490組腹腔注射5 mg/kg的AG490,1次/2 d,連續注射4周,對照組和BLM組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.2 各組大鼠肺功能檢測 分別于造模前、造模后1周和造模后4周,采用肺功能檢測儀檢測大鼠第0.3 s用力呼氣量(forced expiratory volume in 0.3 second,FEV0.3)與用力肺活量(forcedvital capacity,FVC)及其FEV0.3/FVC比值和最大呼氣流量(peak expiratory flow,PEF)。檢測后立即處死大鼠,分離血液,離心(3 500 r/min,10 min),取上清,置于-20℃冰箱暫存,分離肺組織,置于-80℃冰箱暫存。

1.2.3 HE染色及MASSON染色觀察大鼠肺組織病理學 取大鼠肺組織,采用4%多聚甲醛固定,進行常規的脫水、透明、包埋和切片,分別進行HE染色和MASSON染色,在光鏡下觀察組織的病理變化,每張切片隨機取5個視野拍照。

1.2.4 Western blot檢測各組大鼠肺組織纖維化相關蛋白表達 取大鼠肺組織勻漿,使用細胞裂解液提取組織總蛋白,采用BCA法進行蛋白定量,取50μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳,電轉膜至PVDF膜,室溫密封2 h,洗膜并加一抗(TGF-β、α-SMA和Fibronectin蛋白,稀釋比例均為1∶1 000),4℃孵育過夜,洗膜加HRP標記的二抗(稀釋比例均為1∶5 000)室溫孵育2 h,選用β-actin作為內參,電化學發光顯像,凝膠圖像處理系統分析對比條帶強弱。

1.2.5 TUNEL檢測大鼠肺組織細胞凋亡 取大鼠肺組織切片,進行TUNEL染色,嚴格按照試劑盒說明進行操作,顯微鏡下觀察組織細胞的凋亡情況。采用Western blot檢測肺組織Ki67、cleaved Caspase-3、Caspase-3和c-Myc蛋白的表達。

1.2.6 各組大鼠血清氧化應激因子的檢測 取各組大鼠血清,采用試劑盒檢測SOD、MDA和LDH水平,嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.2.7 Western blot檢測各組大鼠肺組織JAK/STAT信號通路的表達 取大鼠肺組織,采用Western blot檢測各組大鼠肺組織p-JAK2、JAK2、p-STAT3和STAT3信號通路的表達。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0軟件對所得數據進行分析,滿足正態的計量資料均以表示,采用單因素方差分析比較組間差異性,若組間比較有差異,采用SNK-q比較多組內兩兩組間差異性,且均以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ADM對各組大鼠肺功能的影響 與對照組相比,BLM組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC和PEF水平明顯下降(P＜0.05)；與BLM組相比,ADM中、高劑量組和AG490組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC和PEF明顯升高(P＜0.05),且隨著劑量升高,其作用更為明顯(P＜0.05),見表1。

2.2 ADM對各組大鼠肺組織病理變化的影響HE染色和MASSON結果顯示,對照組大鼠肺組織細胞結構完整,排列整齊；BLM組和ADM低劑量組大鼠肺組織肺泡結構紊亂,伴大量炎癥細胞浸潤,膠原蛋白大量沉積；ADM中、高劑量組和AG490組大鼠肺組織細胞結構較紊亂,炎癥細胞浸潤和膠原蛋白沉積明顯減少。見圖1。

2.3 ADM對各組大鼠肺組織纖維化相關蛋白表達的影響 與對照組相比,BLM組大鼠肺組織TGFβ、α-SMA和Fibronectin蛋白表達均明顯升高(P＜0.05)；與BLM組相比,ADM中、高劑量組和AG490組大鼠肺組織TGF-β、α-SMA和Fibron-ectin蛋白表達均明顯下降(P＜0.05),且隨著劑量升高,其作用更為明顯(P＜0.05)。見圖2。

表1 各組大鼠的肺功能Tab.1 Lung function of rats in each group of rats

表1 各組大鼠的肺功能Tab.1 Lung function of rats in each group of rats

Note:Compared with control group,1)P＜0.05；compared with BLM group,2)P＜0.05.

Groups Dose(mg/kg) Time FEV0.3(ml/s) FEV0.3/FVC(%) PEF(ml/s)24±9.21 28.65±3.32 1 weeks after modeling 4.69±0.53 81.82±9.13 28.74±3.46 4 weeks after modeling 4.71±0.54 81.59±9.07 28.71±3.37 BLM group 5 Before modeling 4.72±0.56 82.19±9.34 28.69±3.56 1 weeks after modeling 3.64±0.51 68.45±9.27 23.14±3.28 4 weeks after modeling 3.10±0.381) 60.82±7.121) 20.65±2.631)ADM group 0.25 Before modeling 4.71±0.53 81.68±8.94 28.68±3.40 1 weeks after modeling 3.72±0.48 71.50±8.87 24.06±3.27 4 weeks after modeling 3.14±0.29 62.71±7.33 21.22±2.70 0.5 Before modeling 4.70±0.55 82.06±9.21 28.73±3.41 1 weeks after modeling 3.81±0.44 72.12±8.83 24.86±3.28 4 weeks after modeling 3.64±0.452) 69.62±7.852) 24.29±2.852)1 Before modeling 4.72±0.55 81.69±9.12 28.73±3.42 1 weeks after modeling 3.93±0.47 72.82±8.95 25.17±3.36 4 weeks after modeling 4.17±0.482) 74.21±8.522) 26.83±2.172)AG490 group 5 Before modeling 4.72±0.53 81.46±8.98 28.65±3.34 1 weeks after modeling 3.87±0.42 71.68±8.76 25.02±3.27 4 weeks after modeling 4.02±0.462) 73.59±8.472) 25.76±2.232)Control group - Before modeling 4.68±0.52 82.

2.4 ADM對各組大鼠肺組織細胞凋亡的影響 與對照組相比,BLM組大鼠肺組織細胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)；與BLM組相比,ADM中、高劑量組和AG490組大鼠肺組織細胞凋亡率明顯下降(P＜0.05),且隨著劑量升高,其作用更為明顯(P＜0.05)。見圖3。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化(×400)Fig.1 Pathological changes of lung tissues in each group of rats(×400)

圖2 ADM對各組大鼠肺組織纖維化相關蛋白表達的影響Fig.2 Effect of ADM on expression of fibrosis-related proteins in lung tissues of rats in each group

2.5 ADM對各組大鼠肺組織細胞凋亡相關蛋白表達的影響 與對照組相比,BLM組大鼠肺組織Ki67和c-Myc蛋白表達明顯下降(P＜0.05),cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達均明顯升高(P＜0.05)；與BLM組相比,ADM中、高劑量組和AG490組大鼠肺組織Ki67和c-Myc蛋白表達明顯升高(P＜0.05),cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達均明顯下降(P＜0.05),且隨著劑量升高,其作用更為明顯(P＜0.05)。見圖4。

圖3 ADM對各組大鼠肺組織細胞凋亡的影響(×400)Fig.3 Effect of ADM on apoptosis of lung tissues in each group of rats(×400)

圖4 ADM對各組大鼠肺組織細胞凋亡相關蛋白表達的影響Fig.4 Effects of ADM on expression of apoptosis-related proteins in lung tissues of rats in each group

表2 ADM對各組大鼠血氧化應激水平的影響Tab.2 Effect of ADM on oxidative stress level of rats in each group

表2 ADM對各組大鼠血氧化應激水平的影響Tab.2 Effect of ADM on oxidative stress level of rats in each group

Note:Compared with control group,1)P＜0.05；compared with BLM group,2)P＜0.05.

Groups Dose(mg/kg) SOD(U/ml) MDA(mmol/ml) LDH(U/L)24.64 BLM group 5 17.59±2.271) 5.27±0.551) 2 192.33±282.271)ADM group 0.25 18.64±2.49 5.39±0.46 2 131.14±235.75 0.5 26.85±3.612) 3.64±0.592) 1 612.88±191.062)1 35.92±4.722) 2.07±0.612) 993.54±106.992)AG490 group 5 33.45±4.672) 2.24±0.652) 1 124.76±114.352)Control group - 46.27±4.43 2.14±0.38 836.0±1

圖5 ADM對各組大鼠肺組織JAK/STAT信號通路的影響Fig.5 Effects of ADM on JAK/STAT signaling pathway in lung tissues of rats in each group

2.6 ADM對各組大鼠血氧化應激水平的影響與對照組相比,BLM組大鼠血清SOD水平明顯下降(P＜0.05),血清MDA和LDH水平明顯升高(P＜0.05)；與BLM組相比,ADM中、高劑量組和AG490組大鼠血SOD水平明顯升高(P＜0.05),MDA和LDH水平明顯下降(P＜0.05),且隨著劑量升高,其作用更為明顯(P＜0.05)。見表2。

2.7 ADM對各組大鼠肺組織JAK/STAT信號通路的影響 與對照組相比,BLM組大鼠肺組織p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白表達均明顯升高(P＜0.05)；與BLM組相比,ADM中、高劑量組和AG490組大鼠肺組織p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白表達均明顯下降(P＜0.05),且隨著劑量升高,其作用更為明顯(P＜0.05)。見圖5。

3 討論

IPF是一種病因不明的進行性肺纖維化間質性疾癥,主要病理特征為成纖維細胞增殖、大量細胞外基質聚集、炎癥損傷和肺實質結構破壞,臨床主要表現為肺功能進行性喪失[8]。目前,臨床尚無治療IPF的特效藥物,建立理想的動物模型,研究IPF的發病機制,是藥物研發的基礎和保障。BLM、胺碘酮、百葉枯、野百合堿均為臨床常用的建立IPF動物模型的藥物,其中BLM誘導IPF模型方法簡單,應用最為廣泛[9]。因此,本研究采用BLM誘導大鼠IPF,研究ADM對IPF的作用及機制。ADM是一種抗膽堿藥物,具有廣泛的生物學作用,對于急性闌尾炎、高血壓腦病、肺部疾患、中毒等均有良好的臨床療效,但其對IPF的作用及機制尚不清楚[10]。本研究中,BLM誘導大鼠的FEV0.3、FEV0.3/FVC和PEF均明顯下降,肺組織出現明顯病理變化,經ADM作用后,FEV0.3、FEV0.3/FVC和PEF均明顯升高,肺組織出現病理變化明顯減輕,膠原沉積明顯減少,且隨著劑量增加,其作用逐漸增強,提示ADM可以呈劑量依賴性改善IPF大鼠的肺組織病理變化和肺功能。周映紅等[11]的研究顯示,ADM可以明顯改善重癥肺炎嬰幼兒的咳嗽、氣喘、氣促、呼吸困難等臨床癥狀,提示ADM可以改善IPF的肺組織結構和功能障礙,有望應用于臨床IPF的治療。

本研究中,ADM可以明顯降低BLM大鼠TGFβ、α-SMA和Fibronectin的蛋白表達。TGF-β是一種強有力的促纖維化生長因子,可以促進細胞外基質的合成,誘導成纖維細胞分化為肌成纖維細胞,在肝、腎、肺等多組織臟器的纖維化過程中均具有重要意義[12]。研究顯示,當TGF-β在胞膜與其受體結合后,可磷酸化Smad2和Smad3并形成三聚體,轉移到細胞核內,調節下游α-SMA、Fibronectin、基質金屬蛋白酶等的表達,誘導肺間質纖維化的產生[13-14]。GUAN等[15]的研究顯示,TGF-β是一個多功能的細胞因子,在纖維化疾病的發生發展中具有重要作用,可以誘導細胞上皮間質轉化,誘導肺纖維化的發生,提示ADM可以抑制TGF-β信號通路,抑制IPF的發生。本研究中,ADM可以抑制BLM誘導的大鼠肺組織細胞凋亡,促進肺組織Ki67和c-Myc蛋白表達,抑制cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達,提示ADM可以調節肺組織細胞增殖和凋亡相關蛋白的表達,抑制肺組織細胞凋亡。本研究中,ADM作用可以明顯升高血SOD水平,降低MDA和LDH水平,提示ADM可以降低IPF大鼠的氧化應激水平,清除機體過多的氧自由基。高巧營等[16]的研究顯示,ADM可以降低糖尿病大鼠氧化應激水平,調節凋亡相關蛋白Bcl-2/Bax的表達,保護腎組織損傷,提示ADM可以降低IPF大鼠氧化應激水平,清除體內過多的過氧化物,抑制肺組織細胞凋亡,保護肺組織損傷。

本研究中,AG490干預可以明顯改善BLM誘導大鼠的肺組織纖維化,降低肺組織中TGF-β、α-SMA和Fibronectin蛋白表達,抑制肺組織細胞凋亡。AG490是JAK2/STAT3信號通路的特異性抑制劑,提示BLM誘導大鼠的肺組織纖維化可能與JAK2/STAT3信號通路被阻斷有關。本研究中,ADM可以明顯降低肺組織JAK2和STAT3的磷酸化水平,提示ADM可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路,抑制肺組織的纖維化。JAK2為JAK蛋白家族中的一員,是一種非跨膜型酪氨酸激酶,當細胞因子與細胞受體結合后可磷酸化JAK2,進而磷酸化下游的STAT3,參與機體細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程[17]。已有研究顯示,JAK2/STAT3信號通路是細胞信號由胞膜向核內傳遞的主要途徑,TGF-β、干擾素家族等多種細胞因子均可以與膜上受體結合,激活JAK2/STAT3信號通路,將信號傳遞至核內,調控下游靶基因的表達[18-19]。TANG等[20]的研究顯示,TGF-β可以激活JAK2/STAT3信號通路,促進肝纖維化的形成,提示ADM可能通過阻斷JAK2/STAT3信號通路,抑制TGF-β的表達,抑制TGF-β誘導的纖維化,保護肺組織結構和功能障礙。

綜上所述,ADM可能通過阻斷JAK2/STAT3信號通路,抑制TGF-β信號通路,清除機體過多的氧自由基,抑制肺組織細胞凋亡和肺纖維化的形成,保護肺組織結構和功能障礙,為ADM的臨床應用提供了一定的理論依據。但本研究只是初步探討了ADM對IPF的作用及其可能的機制,具體的調節機制尚需進一步研究探索。