OsWD40過表達水稻在鹽脅迫下的生理響應

柏華美，黃梓軒，郭敏，鮑聆然，沈波

(杭州師范大學 生命與環境科學學院，浙江 杭州 311121)

文獻著錄格式：柏華美，黃梓軒，郭敏，等.OsWD40過表達水稻在鹽脅迫下的生理響應[J].浙江農業科學，2021，62(6)：1076-1079.

DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20210607

土壤鹽堿化是一個日益嚴重的全球性問題，其所造成的作物產量的損失對全球農業的威脅越來越大[1]。土壤中鹽分過多阻礙了作物的生長，引起發育變化和代謝的適應，表現為細胞膜損傷、Na+和Cl-積累導致的離子失衡、脂質過氧化增強，活性氧如超氧自由基、過氧化氫和羥基自由基的產生增加[2]。水稻是鹽敏感作物，鹽脅迫也是制約水稻生產的主要逆境脅迫因子之一。多年以來，學者圍繞水稻耐鹽品種的評價及選育、農藝栽培措施、細胞信號響應機制、脅迫生理及相關基因的挖掘進行了廣泛的研究，解析了水稻耐鹽的內在機理[2-6]。隨著轉基因技術的不斷成熟及新的耐鹽基因的不斷發現，通過轉基因技術獲得耐鹽植株日趨成熟，加快了水稻耐鹽種質改良的進程。Liu等[7]利用100 mmol NaCl處理轉OsVP1和OsNHX1基因水稻幼苗3周后，發現轉OsVP1和OsNHX1基因明顯促進了水稻根系生長、水分吸收和葉水勢，存活率分別為85.3%和100%，遠高于野生型水稻的38.7%；而且，過量表達OsNHX1的轉基因水稻可以在200 mmol NaCl脅迫下存活[8]。研究顯示，轉AtNHX1水稻植株在300 mmol高濃度NaCl處理下，能夠正常存活，而野生型水稻5 d內幾乎全部死亡，去除300 mmol NaCl脅迫條件的轉AtNHX1水稻的恢復生長實驗顯示，轉基因植株10 d內可以恢復正常生長，而野生型水稻則無法恢復，表明過表達AtNHXS1顯著提高了水稻的耐鹽性[9]。目前，利用基因工程技術培育耐鹽性轉基因水稻已經取得了較好的進展[10-12]。

鹽脅迫制約了水稻的生長、發育，培育耐鹽水稻品種已成為當務之急。本實驗利用本實驗室構建的轉OsWD40水稻株系，進行鹽脅迫處理，考察轉基因水稻對鹽脅迫的生理響應。

1 材料與方法

1.1 供試材料

OsWD40是本實驗室通過生物信息學和同源克隆的方法，找到的一個響應NaCl的基因。在本課題研究中，以轉OsWD40過表達T6代水稻株系(B3-5和B4-3)和受體日本晴(OryzasativaL. japonica.cv.Nipponbare)為實驗材料。

1.2 處理設計

水稻種植采用國際水稻研究所(IRRI)水稻營養液配方配制水培溶液[13]，經消毒、浸種、催芽、沙培后移入黑色小桶中水培，每3 d換一次全營養液。水稻在溫室大棚中長至四葉一心時，用含200 mmol NaCl的水稻營養液處理水稻，在0、12、24、48 h對葉片取樣，冷凍保存，用于生理生化指標測定。

1.3 指標測定

葉片相對含水量采用郭龍彪等[14]方法；葉片電導率使用DDS-307電導率儀測定；葉片葉綠素含量測定采用丙酮浸提法[15]；葉片可溶性糖含量測定采用蘇州科銘生物技術有限公司試劑盒；葉片總蛋白含量和過氧化氫酶(CAT)測定采用南京建成生物工程研究所試劑盒。所有數據測定均重復3次。

1.4 數據分析

所用數據為同一處理3次重復的平均值，采用SPSS軟件的ANOVA過程處理，顯著性檢驗采用鄧肯式新復極差法。

2 結果與分析

2.1 對葉片相對含水量的影響

轉基因水稻株系和日本晴的葉片相對含水量在處理開始時基本相同。隨著脅迫時間的延長，水稻葉片相對含水量呈降低趨勢，在處理后24、48 h時，轉基因水稻B3-5和B4-3的相對含水量分別是64%、62%和39%、47%，均高于日本晴的50%和33%。其中24 h時B3-5的相對含水量、48 h的B4-3的相對含水量與日本晴相比呈顯著差異，表明轉基因水稻株系B3-5和B4-3葉片具有較好的保水作用(圖1)。

同一時間柱上，無相同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖2～7同。

2.2 對葉片相對電導率的影響

隨著鹽脅迫時間的增加，轉基因水稻株系和日本晴的葉片電導率總體呈上升趨勢。脅迫處理12 h時，B3-5、B4-3的葉片相對電導率分別是30.6%和34.5%，而日本晴為42.0%；24 h時，B3-5、B4-3的葉片相對電導率分別是45.0%和52.2%，而日本晴為60.3%；至48 h時，葉片細胞質膜嚴重受損，日本晴和2個轉基因株系相對電導率均達最高值(圖2)。說明在200 mmol NaCl鹽脅迫處理下，在24 h時間范圍內，轉基因水稻株系B3-5和B4-3比日本晴具有較好的耐鹽性，能夠保持一定的細胞質膜功能。

圖2 NaCl處理對水稻葉片電導率的影響

2.3 對葉片葉綠素含量的影響

轉基因株系B3-5、B4-3和日本晴在12 h時葉綠素a的含量都比未處理時高，說明此時在鹽脅迫下水稻有一個適應過程，尚未影響葉綠素a的合成和積累。12 h之后3個品種的葉綠素a含量都呈快速下降的趨勢。48 h時，轉基因水稻株系的的葉綠素a含量顯著高于日本晴，特別是B4-3品種(圖3)。

圖3 NaCl處理對水稻葉片葉綠素a含量的影響

葉綠素b含量的差異在鹽脅迫24、48 h比較明顯，特別是48 h時，轉基因水稻株系的葉綠素b含量大于日本晴，其中B3-5的葉綠素b含量是日本晴的1.2倍，B4-3的葉綠素b含量是日本晴的1.6倍(圖4)。實驗結果表明，鹽脅迫24、48 h時，轉基因水稻株系與日本晴葉綠素a和葉綠素b的含量有較顯著的差異。

圖4 NaCl處理對水稻葉片葉綠素b含量的影響

2.4 對葉片總蛋白含量的影響

與脅迫開始時相比，鹽處理12 h時的葉片總蛋白含量呈整體上升的現象。鹽處理24 h時，日本晴水稻葉片總蛋白含量急劇下降，轉基因水稻株系B3-5和B4-3的葉片總蛋白含量均顯著高于日本晴，其中B3-5、B4-3葉片總蛋白含量分別是日本晴的1.9倍和2.2倍(圖5)。鹽處理48 h時，日本晴、B3-5、B4-3葉片總蛋白含量均有顯著下降，葉片總蛋白含量分別為0.46、0.53和0.93 g·L-1，表明轉基因水稻株系在鹽脅迫的24～48 h仍然具有較好的蛋白質合成能力。

圖5 NaCl處理對水稻葉片蛋白質含量的影響

2.5 對葉片可溶性糖含量的影響

隨著鹽處理時間的增加，日本晴和轉基因株系B3-5、B4-3葉片的可溶性糖含量有增加，在12、24 h時，日本晴的可溶性糖含量均高于B3-5和B4-3。但鹽脅迫48 h時，與日本晴相比，B3-5和B4-3的可溶性糖含量明顯上升，分別增加了66.6%和37.1%(圖6)。說明轉基因水稻株系具有較持久的可溶性糖合成能力。

圖6 NaCl處理對水稻葉片可溶性糖含量的影響

2.6 對葉片CAT活力的影響

在鹽處理的不同時間，轉基因株系B3-5和B4-3的CAT活性均高于日本晴，而日本晴隨著鹽脅迫時間進程，其CAT活性逐漸下降。從脅迫12 h到48 h，B3-5的CAT活性穩步增加，至48 h時，其CAT活性是日本晴的3.6倍；而B4-3的24 h CAT活性增加不明顯，但48 h時，其CAT活性是日本晴的2.1倍(圖7)。說明，轉基因水稻株系B3-5和B4-3在鹽脅迫條件下，可以保持較長時間的CAT活力來保持細胞機制的相對穩定的運行。

圖7 NaCl處理對水稻葉片CAT活力的影響

3 小結

根據世界糧農組織估計，全世界超過6%的土地受到鹽分的影響。如何在環境脅迫下提高作物產量，以應對日益增長的糧食需求，是研究人員急需解決的重要科學課題[16]。隨著植物分子生物學的迅猛發展，耐鹽基因的不斷發現，通過轉基因技術來獲得抗鹽植株已成為常規耐鹽育種之外的一種有效手段。

目前，與鹽分脅迫有關的生理指標如葉片相對含水量、電導率、抗氧化酶活性等，常被用于評價轉基因植物對鹽脅迫的抗性，這些生理指標主要反映了鹽脅迫條件下細胞膜的損傷程度、氧化代謝水平及滲透物質的調節能力。實驗表明，在鹽脅迫條件下，ZFP179過表達水稻具有較高的相對含水量和存活率、較低的電導率和丙二醛(MDA)含量，并可積累比野生型更多的可溶性糖[17]。與野生型相比，在150 mmol NaCl處理后3 d，過表達OsCaM1-1的轉基因水稻株系的相對含水量、相對生長率、光合色素含量以及過氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶等活性均較高[18]。而轉OsMYB6水稻150 mmol NaCl脅迫6 d后的恢復生長實驗顯示，野生型水稻全部死亡，轉基因水稻仍有43.9%的存活率；生理指標顯示，轉基因水稻具有較低的電導率和MDA含量，較高的CAT和超氧化物歧化酶(SOD)活性[12]。通過這些生理指標的測定，可知轉基因水稻的鹽脅迫耐受能力，證實轉基因水稻可以通過提高適應性的生理活動來增強水稻的耐鹽能力[19-23]。

本研究表明，鹽脅迫會影響轉基因水稻的生長發育生理。在200 mmol NaCl處理條件下，與非轉基因水稻相比，轉基因水稻株系葉片細胞質膜損傷程度較輕，細胞鎖水能力較強，表現為葉片相對含水量較高而電導率增加較緩；同時，轉基因水稻株系通過自身對鹽脅迫的響應，合成蛋白質、滲透調節物質及提高抗氧化酶代謝水平來改善對鹽脅迫的耐受性，表現為總蛋白含量、可溶性糖含量及CAT活力的提高。