懸吊式外固定支具有限制動建立的兔膝骨關節炎模型

易強　謝利民　鄺高艷　萬云峰　李肇華　曹寅生

〔摘要〕 目的 運用不依賴加壓固定的體外關節制動造模方式，制備皮膚軟組織健康的兔膝骨關節炎模型。方法 選用雄性新西蘭大白兔18只，按照隨機數字表法隨機分為正常組、傳統Videman法造模組（簡稱Videman組）、懸吊式外固定法造模組（簡稱懸吊組），各6只。正常組不予任何處理，Videman組單純采用管型高分子石膏完全制動兔左膝關節于伸直位，懸吊組采用懸吊式外固定支具有限制動兔左膝關節于伸直位。6周后解除關節制動，觀察兔皮膚軟組織和左膝關節情況，用Bates-Jensen傷口評估工具（the Bates-Jensen wound assessment tool， BWAT）對皮膚軟組織健康情況進行評估，用Lequesne MG評分對左膝關節功能進行評估;空氣栓塞法處死動物，對左膝關節軟骨行大體觀察和HE染色病理學觀察，并用Pelletier評分及Mankin評分對軟骨損傷情況進行評估。結果 （1）皮膚軟組織健康情況比較，與正常組和懸吊組相比，Videman組BWAT評分升高（P<0.05）;懸吊組與正常組BWAT評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。（2）左膝關節功能比較，與正常組相比，Videman組和懸吊組Lequesne MG評分均顯著升高（P<0.01）;Videman組和懸吊組Lequesne MG評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。（3）正常組左膝關節軟骨大體觀察和HE染色觀察結果均正常，Videman組和懸吊組均見典型的軟骨破壞，符合膝骨關節炎病理學改變。與正常組相比，Videman組和懸吊組Pelletier評分及Mankin評分均顯著升高（P<0.01），達到輕中度骨關節炎的評分等級;Videman組和懸吊組Pelletier評分及Mankin評分比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。結論 懸吊式外固定支具有限制動膝關節于伸直位的造模方式可成功制備皮膚軟組織健康的兔膝骨關節炎模型，其造模效果與傳統Videman造模法效果一致，但對皮膚軟組織的保護能力強于后者。

〔關鍵詞〕 膝骨關節炎;懸吊;有限制動;動物模型;兔

〔中圖分類號〕R684;R274? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.02.014

〔Abstract〕 Objective To establish the model of knee osteoarthritis in rabbits with healthy skin and soft tissue by using the method of external joint braking with unpressurized fixation. Methods A total of 18 male New Zealand white rabbits were selected and randomly divided into the normal group， the traditional Videman model group （Videman group） and the suspension external fixation model group （suspension group） according to random number table method， with 6 rabbits in each group. The normal group did not do any treatment， the Videman group simply used tube type polymer gypsum to completely fix the left knee joint in the extension position， and the suspension group used suspension external fixator to restrict the movement of the left knee joint in the extension position. After 6 weeks， the joint external fixation was removed. The condition of skin soft tissue and the left knee joint were observed. The health status of skin soft tissue was evaluated by the Bates-Jensen wound assessment tool（BWAT）. The function of left knee joint was evaluated by Lequesne MG score. Then killed the rabbits by air embolization. The cartilage of the left knee joint was observed by gross observation and pathological observation by HE staining. The Pelletier score and Mankin score were usd to evaluate the cartilage injury. Results （1） Comparison of skin and soft tissue health， compared with the normal group and the suspension group， BWAT score in the Videman group was increased （P<0.05）; there was no statistically significant difference in BWAT scores between the suspension group and the normal group （P>0.05）. （2） Comparison of left knee joint function， Lequesne MG score in the Videman group and the suspension group was significantly higher than that in the normal group （P<0.01）; there was no statistically significant difference in Lequesne MG score between the Videman group and the suspension group （P>0.05）. （3） Gross observation and HE staining observation of left knee articular cartilage in the normal group were all normal， the Videman group and the suspension group all showed typical pathological changes of knee osteoarthritis. Compared with the normal group， Pelletier and Mankin scores in the Videman group and the suspension group were significantly increased （P<0.01）， reaching the scoring level of mild to moderate osteoarthritis; there were no statistically significant difference in Pelletier score and Mankin score between the Videman group and the suspension group （P>0.05）. Conclusion The rabbit model of knee osteoarthritis with healthy skin and soft tissue can be successfully established by the method of hanging external fixator with limited immobilization the knee joint to extension position， its modeling effect is consistent with that of traditional Videman modeling method，but the protection ability to the skin soft tissue is stronger than the latter.

〔Keywords〕 knee osteoarthritis; hanging; limited immobilization; animal model; rabbit

骨關節炎是一種多因素綜合所致的關節退化性疾病，可影響體內多關節，其中膝關節為高發病關節[1]，據估計，在60歲以上的成年人中，膝骨關節炎的男性發病率約為10%，女性發病率約為13%，是老年人口致殘的主要原因之一[2]。膝骨關節炎目前無特效治療藥物，其確切致病機制仍然未知[3-4]，研究[5]發現炎癥因子與膝骨關節炎的發生發展關系密切。因此，制備合理的動物模型是相關研究深入開展的重要基礎。膝骨關節炎造模方法多樣，其中傳統Videman造模法[6]是經典的誘導性體外關節制動動物膝骨關節炎造模法，該方法不受手術創傷和關節內操作的影響，可較好地模擬人類膝骨關節炎的發生、發展模式[7]，適用于藥物對膝骨關節炎動物模型炎癥遞質表達影響的研究[8]。既往研究[9-12]表明傳統Videman造模法通過體外關節的完全制動可成功制備膝骨關節炎動物模型，但實踐過程中發現其加壓固定的造模方式易致模型動物造模側下肢產生缺血性腫脹等皮膚軟組織損傷，而其產生的炎癥成為傳統Videman造模法誘導的膝骨關節炎模型的主要干擾因素[13-15]。因此，運用不依賴加壓固定的體外關節制動造模方式制備皮膚軟組織健康的動物膝骨關節炎模型十分必要。本研究對傳統Videman造模法加以改進，用懸吊式外固定支具有限制動膝關節于伸直位的造模方式建立皮膚軟組織健康的動物膝骨關節炎模型。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物及分組

選擇6月齡雄性新西蘭大白兔18只，體質量（2 750±250） g;由湖南太平洋生物科技有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（湘）2020-0005;飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心，實驗單位許可證號：SYXK（湘）2019-0009。適應性喂養1周，觀察無異常后按隨機數字表隨機分為正常組、傳統Videman法造模組（簡稱Videman組）、懸吊固定法造模組（簡稱懸吊組），每組6只。本實驗經湖南中醫藥大學動物實驗中心倫理委員會批準（倫理審查備案號：202007070001）。

1.2? 主要實驗材料

高分子繃帶（廣東省揭西縣泰洲醫療科技有限公司，201600163）;彈性繃帶（浙江安吉縣精誠醫用繃帶廠，20150001）;高分子繃帶（廣東省揭西縣泰洲醫療科技有限公司，201600163）;彈性繃帶（浙江安吉縣精誠醫用繃帶廠，20150001）;醫用高分子石膏（上海優加醫療用品有限公司，20200403）;透明膠帶（上海晨光文具股份有限公司，AJD97338）;細鐵絲網（江蘇元井匯有限公司，52775616729）;0.5 mm鐵絲;剪刀;尖嘴鉗。

1.3? 主要實驗試劑

4%多聚甲醛（北京蘭杰柯科技有限公司，批號BL600A）;10% EDTA脫鈣液（北京索萊寶生物科技有限公司，批號20200616）;蘇木素伊紅染液套裝（武漢谷歌生物科技有限公司，批號G1005）;無水乙醇（批號100092683）、二甲苯（批號100023418）、鹽酸（批號10011008）、氨水（批號10002118）、中性樹膠（批號10004160）均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.4? 主要實驗器械

脫水機（武漢俊杰電子有限公司，JJ-12J）;包埋機（武漢俊杰電子有限公司，JB-P5）;病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，RM2016）;凍臺（武漢俊杰電子有限公司，JB-L5）;組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，KD-P）;烤箱（天津市萊玻瑞儀器設備有限公司，GFL-230）;載玻片及蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司，10127105P-G）;正置光學顯微鏡（日本尼康公司，Nikon Eclipse E100）;成像系統（日本尼康公司，Nikon DS-U3）。

1.5? 動物模型的制備

正常組：不做任何處理。

Videman組：單純采用管型高分子石膏完全制動兔左膝關節于伸直位[6]。

懸吊組：將新西蘭大白兔左膝關節短暫固定于伸直位，用皮尺測量內踝關節上1.0 cm至大腿內側根部下0.5 cm的直線距離（一號數據），測量大腿內側根部水平的大腿周長（二號數據），測量內踝關節上1.0 cm處的小腿周長（三號數據），隨即解除固定;將高分子繃帶塑形成管型，其縱軸長度為一號數據長度，上端內周長為二號數據長度加0.5 cm，下端內周長為三號數據長度加3.0～4.0 cm;修剪管型高分子繃帶上下緣毛糙部分，并包繞數層透明膠帶使之光滑、圓鈍;將細鐵絲網緊密覆蓋管型高分子繃帶外表面，并用多層透明膠帶纏繞固定;制作直徑約為8.0 mm的細鐵絲環，使之固定于管型高分子繃帶上緣，取寬5.0 cm，長30.0 cm的彈性繃帶，將其穿過細鐵絲環;再次臨時固定模型兔左下肢于伸直位，將管型高分子繃帶自下而上套入模型兔左下肢，在模型兔大腿根部稍前方用彈性繃帶環繞軀干打結，調整彈性繃帶環的松緊度使管型高分子繃帶下緣位于踝關節上1.0 cm，上緣位于大腿內側根部下0.5 cm，使其左膝關節有限制動于伸直位。見圖1。

Videman組和懸吊組兔造模支具安裝完成后觀察30 min，如出現肢體遠端血運不良或軀干處彈性繃帶捆綁過緊應立刻拆除固定，等血運恢復后重新操作;6周造模期內如發現有造模支具固定失效，立刻予以重新固定。

1.6? 標本取材及處理

造模6周后用空氣栓塞法處死實驗兔，解剖暴露兔左膝關節，切取股骨頭全層關節軟骨，以4%多聚甲醛液固定48 h后，放入10% EDTA脫鈣液中脫鈣處理，脫鈣完成后石蠟包埋，縱行切片，每個標本切3張，間隔100 μm切片，切片厚度為5 μm，將組織切片置于60 ℃恒溫箱中烘烤1 h。依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、75%乙醇5 min，自來水洗，蘇木素染色3～5 min，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍，水洗，依次將切片放入85%、95%的梯度乙醇脫水，于伊紅染液中染色5 min;依次將切片放入無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、無水乙醇Ⅲ5 min、二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ5 min透明化處理，中性樹膠封片。最后進行顯微鏡鏡檢及圖像采集分析。

1.7? 指標觀察與檢測

1.7.1? 一般觀察? 每日檢查并維護造模支具防止其固定失效;造模6周時取下造模支具，觀察兔外觀形態并拍取照片;觀察統計3組兔的存活率。

1.7.2? 皮膚軟組織Bates-Jensen傷口評估工具（the

Bates-Jensen wound assessment tool， BWAT）評分? 造模6周時用BWAT[16-17]對實驗兔皮膚軟組織的健康情況進行評估，BWAT評分包含13個項目。BWAT對9個特征（壞死組織類型、壞死組織數量、肉芽組織、上皮化程度、滲液類型、滲液數量、周圍皮膚顏色、水腫、硬結）進行主觀評估，評分等級為1～5分，其中1分表示該特征健康，5分表示該特性最不健康;其余4個特征（大小、深度、邊緣、破壞程度）的等級為0～5分，0分表示“不存在”。總得分范圍為9～65分，皮膚軟組織受壓病變程度和總分數呈正相關性。

1.7.3? 膝關節Lequesne MG評分? 造模6周時采用 Lequesne MG[18]評分評估實驗兔左膝關節功能，包括疼痛刺激反應（0～3分）、步態改變（0～3分）、關節活動（0～3分）、關節腫脹（0～2分），總得分范圍為0～11分，膝關節功能障礙程度和總分數呈正相關性。

1.7.4? 左膝關節軟骨大體觀察及Pelletier評分? 造模6周時對解剖完成的兔左膝關節標本行肉眼下觀察并拍取左股骨髁關節面照片。采用Pelletier評分[19]評估軟骨損傷情況：（1）0分：關節面光整，色澤如常;（2）1分：關節面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗;（3）2分：關節面糜爛，軟骨缺損深達軟骨表、中層;（4）3分：關節面潰瘍形成，缺損深達軟骨深層;（5）4分：軟骨剝脫，軟骨下骨暴露。軟骨損傷程度和分數呈正相關性。

1.7.5? 左膝關節軟骨HE染色觀察? 在200倍光學顯微鏡下觀察造模6周時實驗兔左膝關節軟骨HE染色標本，每張切片選擇3個視野。

1.7.6? 左膝關節軟骨Mankin評分? 參照Mankin評分[20]進行分數統計，滿分14分，軟骨退變程度和分數呈正相關性。分級標準：正常（0～2分），輕度退變（3～7分），中度退變（8～11分），重度退變（12～14分）。

1.8? 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件對所有數據進行統計分析。計量資料以“x±s”表示，若滿足正態分布和方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，進一步采用LSD法進行兩兩比較;若不滿足正態性和方差齊性，采用非參數檢驗，如Kruskal-Wallis法;P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 一般觀察

（1）6周造模期內，Videman組有3只兔予以重新固定，原因為造模中后期兔左下肢肌肉萎縮致加壓固定的管型高分子石膏滑脫及管型高分子石膏被啃咬破壞致固定失效。懸吊組有1只兔予以重新固定，原因為管型高分子繃帶邊緣與彈性繃帶連接處被啃咬破壞致模具脫落。

（2）造模6周時拆除造模支具，正常組兔左下肢毛發松軟，左膝關節屈伸自如;Videman組兔左下肢毛發稀疏凌亂，左膝關節完全僵直;懸吊組兔左下肢毛發松軟，左膝關節完全僵直。

（3）實驗第6周末正常組、Videman組、懸吊組兔存活率均為100%。

2.2? 皮膚軟組織BWAT評分

BWAT評分結果顯示，正常組為（9.166±0.408）分，Videman組為（12.833±2.483）分，懸吊組為（9.333±0.516）分。與正常組和懸吊組相比，Videman組BWAT評分較高（P<0.05）;懸吊組與正常組BWAT評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。

2.3? 膝關節Lequesne MG評分

Lequesne MG評分結果顯示，正常組為（0.000±0.000）分，Videman組為（7.333±0.816）分，懸吊組為（7.500±1.048）分。與正常組相比，Videman組和懸吊組 Lequesne MG評分均顯著升高（P<0.01）;Videman組與懸吊組 Lequesne MG評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3。

2.4? 左膝關節軟骨大體觀察及Pelletier評分

造模6周時Videman組和懸吊組兔左膝股骨內側或外側髁關節面軟骨變薄，色澤灰暗，表面向下凹陷形成潰瘍。正常組兔左膝股骨內側及外側髁關節面光整，軟骨色澤正常。見圖4。

Pelletier評分結果顯示，正常組為（0.000±0.000）分，Videman組為（2.500±0.547）分，懸吊組為（2.666±0.516）分。與正常組相比，Videman組與懸吊組Pelletier評分均顯著升高（P<0.01）;Videman組與懸吊組Pelletier評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖5。

2.5? 左膝關節軟骨標本HE染色觀察及Mankin評分

造模6周時的Videman組和懸吊組兔左膝關節軟骨HE染色標本可見淺表區不平整，存在破裂或缺失，表層軟骨細胞減少，軟骨基質及膠原纖維增生，深層軟骨細胞數目異常，表現為細胞簇聚或數目減少，為典型的骨關節炎病理學改變。正常組兔左膝軟骨HE染色標本組織觀察情況正常。見圖6。

Mankin評分結果顯示，正常組為（0.666±0.516）分，Videman組為（8.000±1.095）分，懸吊組為（8.166±1.471）分。與正常組相比，Videman組與懸吊組Mankin評分均顯著升高（P<0.01）;Videman組與懸吊組Mankin評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖7。

3 討論

3.1? 實驗動物選擇

兔是骨關節炎造模的常用動物之一[21]，最近研究[22]結果表明雌激素可能對膝骨關節炎的發展具有保護作用，為排除雌激素對本實驗的干擾，故選用雄性兔作為實驗對象。由于幼年兔軟骨的自發愈合特性較強[23]，本實驗選擇6月齡的兔以保證骨骼的成熟[24]。

3.2? 改進造模原因

體外關節制動動物膝骨關節炎造模法如傳統Videman造模法[25]用管型固定物把實驗動物膝關節固定于伸直位，經過5～6周的完全性體外關節制動，膝關節軟骨的會發生與骨關節炎臨床病理改變相似的關節退變[26]。但實踐中發現傳統Videman法加壓固定的造模方式因管型固定物需與兔造模側下肢緊密接觸，易致兔皮膚軟組織產生壓迫性損傷，導致其會陰感染[11]、下肢缺血性腫脹[10，27]、壓瘡[9，12]等，甚至由壓瘡引發全身炎癥反應綜合征[28]。在膝骨關節炎發病過程中，關節組織會產生并釋放如白細胞介素1、白細胞介素6、腫瘤壞死因子等炎性因子，進行膝骨關節炎發病機制的研究需要測定相關炎性因子在血漿含量[29-30]，而模型動物皮膚軟組織損傷時也會導致血漿中白細胞介素1、白細胞介素6和腫瘤壞死因子等炎性因子的含量異常[31-32]，故當膝骨關節炎模型動物有皮膚軟組織損傷時，其血漿中與膝骨關節炎發病機制相關的炎性因子檢測結果將出現誤差。由于傳統Videman造模法加壓固定的造模方式有以上不足，因此，本研究對其加以改進，探索以不依賴加壓固定的體外關節制動造模方式制備皮膚軟組織健康的膝骨關節炎動物模型。

3.3? 改進優勢分析

（1）不同于傳統Videman造模法加壓固定和完全制動的造模方式，本造模法的固定方式為懸吊固定，依靠綁扎在模型兔軀干的彈性繃帶將周徑稍大于兔下肢的管型固定物懸吊在其下肢上，制動方式為有限制動，通過管型固定物限制兔膝關節的屈伸范圍在0°～10°。懸吊固定使整個外固定支具重量由兔四肢分擔，不會出現造模側下肢負重過大影響髖部活動的現象。有限制動的情況下，管型固定物不會對動物模型造模側下肢形成環形加壓，能有效防止壓迫性皮膚軟組織損傷出現。（2）傳統Videman造模法固定支具的制作方式是在體制作，而本造模法為離體制作，固定支具離體制作完成后統一安裝可大幅度縮短不同動物個體之間的造模時間差。（3）據統計，傳統Videman造模法外固定支具的安裝、拆卸耗時較長[11]，特別是拆卸，常耗時數十分鐘。本造模法安裝調試過程可控制在5 min內，拆卸時剪斷懸吊帶，向下取出管型固定物，數秒鐘便能完成;其快速安裝、拆卸的特點使得在大批量造模時能更頻繁地檢查固定支具覆蓋范圍內皮膚軟組織的健康情況，及時預防或消除造模導致的不必要損傷。（4）對比傳統Videman造模法，本造模法拆卸外固支具時不破壞其管型固定物的完整性，能避免劃傷模型兔皮膚，且整個造模過程可單人操作，無需麻醉。（5）本造模法兔造模側下肢與管型固定物間有較大間隙，空氣可通過間隙進行流通，其透氣性能優于傳統Videman造模法。

綜上所述，通過懸吊式外固定支具有限制動膝關節于伸直位的造模方式可成功制備皮膚軟組織健康的兔膝骨關節炎模型，其造模效果與傳統Videman造模法一致，但對皮膚軟組織的保護能力強于后者，可能更適用于藥物對膝骨關節炎動物模型炎癥遞質表達影響的研究。

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