硼處理根瘤菌胞外多糖提取條件優化

陳永崗，師尚禮，張高寧，臧聰宇，馬卉錦，李自立，張輝輝，李興龍，周彤，陳建綱

(甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅蘭州 730070)

苜蓿是一種多年生優質豆科牧草，因其耐干旱、耐貧瘠、品質好和經濟價值高，被譽為“牧草之王”[1]。根瘤菌可與豆科植物形成共生關系，并在植物根部結瘤固氮[2]。苜蓿接種根瘤菌，是提高苜蓿產量和品質的重要措施[3-4]。但由于宿主和根瘤菌種類以及其他因素的影響，使根瘤菌的結瘤能力千差萬別，部分根瘤菌難以高效地與豆科植物結瘤固氮，達到應有的增產效果[5]。近年來，內生根瘤菌研究興起，通過根瘤菌對苜蓿的侵染、運移、定殖[5-6]，內生于次代種子，構建種子與根瘤菌共生體，以便于內生根瘤菌在種子萌發時優先結瘤固氮。因此如何提高根瘤菌接種效果一直是豆科植物固氮體系構建研究的熱點。

研究表明，根瘤菌產生的胞外多糖(EPS)可以減弱或規避根瘤菌侵染宿主時遇到的防御反應，保護自身免受宿主防御[7]，或在侵染過程中誘導菌體和宿主合成水解酶，引起宿主胞壁結構變化從而減弱宿主植物的防御反應，促進根瘤菌的侵染[8]。苗陽陽等[9]研究發現添加硼可以促進根瘤菌胞外多糖的合成，同時增強根瘤菌的侵染能力，提高根瘤菌在苜蓿各組織中的定殖數量[10]。缺硼會導致糖脂和多糖減少，膜厚度降低[11]，減弱根瘤菌的固氮能力[12]。根瘤菌與宿主間能否成功共生主要取決于其對宿主防御反應的阻礙或抵御的能力[13]。研究發現根瘤菌侵染宿主時可以通過分泌胞外多糖來阻遏宿主的防御反應[14]，促進根瘤菌的侵染。因此，提取高含量高純度的根瘤菌胞外多糖對于研究硼促進根瘤菌合成胞外多糖及侵染宿主的機制顯得尤為重要，同時也為深入研究根瘤菌胞外多糖的生物學功能奠定基礎。

胞外多糖的分離過程一般包括分離菌體、除蛋白、除色素、沉淀EPS等[15]。除蛋白常用三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶解法和Sevag法等[16]。傳統脫色方法是H2O2脫色和活性炭脫色[17]。樹脂吸附是20世紀發展起來的新脫色工藝，具有穩定性高、脫色效果好、時間短、速度、多糖保留率高等優點。羅璽等[18]通過大孔樹脂脫色法對顏色較深、雜質較多的靈芝多糖進行脫色處理，脫色率達到85%以上，脫色效果顯著，可將其應用到乳酸菌粗多糖的脫色。Zhou等[19]采用DEAE色譜分離法分離組分，并采用Sepharose CL-6B色譜對單一組分進一步純化，純化效果較好。

已有研究對細菌、乳酸菌和真菌等的胞外多糖提取條件進行了深入探討[20-22]，然而，硼處理苜蓿根瘤菌胞外多糖提取條件的優化鮮見報道。基于此，本研究以苜蓿根瘤菌12531f為研究對象，篩選適宜的硼濃度，并通過正交試驗優化硼處理根瘤菌胞外多糖的提取條件，為進一步深入研究根瘤菌胞外多糖的結構和生物學功能奠定良好的基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

根瘤菌：由草業生態系統教育部重點實驗室提供的熒光標記根瘤菌Ensifermeliloti12531f(12531f)。其原始菌株為E.meliloti12531(購自中國科學院微生物保藏中心，分離自中華苜蓿的根瘤菌)。

硼：購自于天津市凱通化學試劑有限責任公司，含量不少于99.5%。

YMA固體培養基配方：甘露醇10 g；K2HPO40.5 g；MgSO4·7 H2O 0.2 g；NaCl 0.1 g；酵母粉1g；調節pH為6.8～7.0，用蒸餾水定容至1 L。YMA固體培養基添加瓊脂：15～20 g/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 硼濃度梯度的設置以及培養基的配制 配制硼濃度梯度為0(CK)、0.05、1、5、10和100 mg/L。將硼酸置于無菌三角瓶中，在無菌操作臺殺菌30 min后，用無菌濾膜(0.22 μm)過濾3次，然后按濃度梯度加入已配制好的40 mL YMA液體培養基中，每個處理3個重復。以上操作均在無菌操作臺進行。

1.2.2 熒光標記根瘤菌的活化 將保存于甘油的根瘤菌12531f接種到YMA固體培養基，在培養箱28℃，培養24 h。

1.2.3 根瘤菌12531f適宜硼濃度的篩選 將上述活化后的菌株接種到50 mL YMA液體培養基，在28℃，180 r/min培養至D600nm=0.5～0.8，將該菌液取5 mL加入到上述不同濃度梯度的40 mL YMA液體培養基。將該菌液在28℃，180 r/min培養，在不同的時間段測定D600nm值，比較硼濃度與對照的大小，確定菌株12531f的適宜硼濃度。

1.2.4 適宜硼濃度對根瘤菌胞外多糖含量的影響 配制上述所選適宜硼濃度，加入配制好的40 mL YMA液體培養基中，對照不加硼液，每處理3次重復。將活化后在50 mL YMA液體培養基中培養至D600nm=0.5～0.8的該菌株菌液加入上述已配好的適宜硼濃度的40 mL液體培養基中，加入體積與2.3相同。然后在28℃，180 r/min培養72 h，在4℃下，10 000 r/min離心10 min，得根瘤菌上清液。

1)標準曲線的制作 葡萄糖標準曲線制作過程如下：取8支干凈的試管，分別編號1-8；按下表順序用移液槍分別加入100 μg/mL葡萄糖標準溶液和蒸餾水，然后加入1 mL 6%苯酚溶液，搖勻；再加入5 mL濃硫酸，在恒溫下放置5 min，至沸水浴中(此次試驗沸水浴是95℃)加熱15 min；取出后用水沖洗試管外壁，使其迅速冷卻到25℃后，用分光光度計測定485 nm波長下的吸光度；然后以吸光值為橫坐標，以葡萄糖濃度為縱坐標，利用Excel軟件繪制標準曲線，得標準曲線方程為：y=54.485 8x-0.010 24，R2=0.992 1；x為濃度(μg/mL)。

表1 葡萄糖標準曲線制作表

2)胞外多糖分泌量的測定(苯酚-硫酸法) 苯酚-硫酸法的原理是在H2SO4存在條件下，多糖可以水解成單糖，而單糖可以與苯酚反應生成橙黃色化合物，其可脫水形成衍生物糖醛，該橙黃色化合物在485 nm波長處有最大吸收峰，在10～100 mg其顏色變化與糖的含量成正比例，因此可以用比色法在485 nm波長下測定其中糖含量，利用葡萄糖的標準曲線，換算出糖的含量[23]。

胞外多糖提取參考文獻[15]的方法進行。具體實驗步驟如下：菌株培養方法同上，培養72 h后，在4℃下，離心10 min(15 000 r/min)，棄沉淀，收集上清液；各取離心上清液5 mL于10 mL離心管中，按Sevag液：上清液=1∶4加入Sevag液，振蕩30 min，離心10 min(6 000 r/min)，棄沉淀，反復處理3次；將上清液移到50 mL離心管中，加入3倍體積95%乙醇，4℃冰箱中浸提12 h，4℃離心45 min(10 000 r/min)，并收集沉淀，棄上清液；在超凈工作臺內風干，即得粗多糖，加入2 mL蒸餾水使其完全溶解，放入4℃冰箱，以備后用。

將上述樣品溶液，按標準曲線中的測定方法，測定樣品溶液的吸光值，按標準曲線回歸方程計算待測溶液的糖含量。

1.2.5 適宜硼濃度處理根瘤菌株12531f胞外多糖提取條件優化 1)TCA體積分數確定 取15個10 mL離心管加入上述制備的上清液2 mL，分別加入體積分數為1%、5%、10%、15%、20%的三氯乙酸溶液(3個重復)，反應12 h后，4℃，10 000 r/min，離心45 min，將上清液移至新的10 mL離心管中，加入三倍體積的95%的乙醇溶液，4℃冰箱中浸提12 h后，4℃，10 000 r/min，離心45 min，棄上清液。向沉淀中加入2 mL蒸餾水使粗制多糖溶解，然后移至新的10 mL試管中，加入1 mL 6%的苯酚溶液，搖勻，再加入5 mL的濃硫酸，放置5 min后置于沸水浴(95℃)中加熱15 min；取出并使其迅速冷卻到25℃，用分光光度計于485 nm測定吸光度。根據葡萄糖標準曲線計算根瘤菌胞外多糖的含量。

2)醇沉倍數確定 方法同上，在離心管中加入上清液后，加入上述所選最適體積分數的TCA溶液，反應12 h后，在4℃，10 000 r/min，離心45 min取上清液，將上清液移至新的10 mL離心管中分別加入1、2、3、4、5倍體積的95%乙醇溶液，每處理3個重復，用1.2.5方法，計算胞外多糖含量。

3)醇沉時間確定 方法同上，在離心管中加入上清液，加入體積分數10%的TCA溶液，反應12 h后，4℃，10 000 r/min，離心45 min獲取上清液，加入上述所選最適醇沉倍數的95%乙醇溶液，4℃冰箱中分別浸提6，12，24，36，48 h，每處理3個重復，用1.2.5方法，計算胞外多糖含量。

根據上述試驗結果，選取影響苜蓿根瘤菌胞外多糖提取的3個主要因素：TCA體積分數(A)、醇沉倍數(B)、醇沉時間(C)，以苜蓿根瘤菌胞外多糖含量為考察指標，進行L9(34)正交試驗(表1)。

表2 根瘤菌胞外多糖提取工藝優化L9(34) 正交試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 適宜硼濃度的篩選

適量的硼處理可以促進根瘤菌12531f的生長。20 min時，除0.05 和10 mg/L硼處理菌株生長速度與對照差異顯著(P<0.05)，其余處理與對照均差異不顯著(P>0.05)；60 min時，與對照相比硼處理菌株生長速度均不顯著(P>0.05)；100 min時，當硼濃度大于0.05 mg/L時，菌株生長速度均顯著大于對照(P<0.05)，其余處理與對照相比差異不顯著(P>0.05)；140 min時，當硼濃度為1 mg/L時菌株生長速度顯著高于對照(P<0.05)，其余處理與對照差異均不顯著(P>0.05)；180 min時，當硼濃度為1 mg/L時根瘤菌生長速度顯著高于對照(P<0.05)，其余處理除添加100 mg/L的硼處理生長速度顯著低于對照外，均與對照差異不顯著(P>0.05)(圖1)。

圖1 不同濃度硼處理下根瘤菌12531f菌株的D600nm Fig.1 Effects of different boron concentrations on D600nm in 12531f注：圖中CK、0.05、1、5、10和100表示培養基中添加0、0.05、1、5、10和100 mg/L硼；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

結合本課題組苗陽陽的試驗結果(1 mg/L硼處理根瘤菌12531f接種紫花苜蓿時，更有利于其在紫花苜蓿體內運移和定殖。)，確定本試驗中根瘤菌12531f菌株的適宜硼濃度為1 mg/L。

2.2 硼對根瘤菌12531f菌株胞外多糖含量的影響

1 mg/L硼處理菌株12531f，與對照相比可顯著提高胞外多糖含量(P<0.05)，提高25.9%(圖2)。

圖2 不同濃度硼處理下根瘤菌12531f菌株胞外多糖的含量Fig.2 Effects of boron concentration on the concentration of extracellular polysaccharides by rhizobia 12531f

2.3 硼處理根瘤菌12531f菌株產胞外多糖提取條件優化

2.3.1 三氯乙酸體積分數對胞外多糖含量的影響 隨三氯乙酸體積分數的增加，胞外多糖含量呈先上升后下降的趨勢，在三氯乙酸體積分數為10%時胞外多糖含量達最大。選擇此時的三氯乙酸體積分數(10%)進行后續試驗(圖3)。

圖3 不同三氯乙酸體積分數下胞外多糖的含量Fig.3 Effects of trichloroacetic acid volume fraction on the concentration of extracellular polysaccharide

2.3.2 醇沉倍數對胞外多糖含量的影響 隨醇沉倍數的增加胞外多糖含量呈先上升后緩慢下降的趨勢，當醇沉倍數為2倍時胞外多糖含量達最大。選擇2倍醇沉倍數進行后續試驗(圖4)。

圖4 不同醇沉倍數下胞外多糖的含量Fig.4 Effects of the volume of alcohol for precipitation on the concentration of extracellular polysaccharide

2.3.3 醇沉時間對胞外多糖含量的影響 隨醇沉時間的增加胞外多糖含量呈先緩慢上升之后又下降的趨勢，醇沉時間為24 h時胞外多糖含量達最高(圖5)。選擇24 h為醇沉時間進行后續試驗。

圖5 醇沉時間對胞外多糖含量的影響Fig.5 Effects of alcohol precipitation time on the concentration of extracellular polysaccharide

2.3.4 L9(34)正交試驗 在上述試驗結果的基礎上，通過正交試驗得到硼處理根瘤菌12531f菌株胞外多糖含量提取條件優化結果(表3)，各因素極差大小次序為A>B>C，各因素的變化對根瘤菌胞外多糖提取影響的大小次序為：三氯乙酸>醇沉倍數>醇沉時間；從各因素在不同水平下的胞外多糖均值含量可知，胞外多糖的最優提取條件為A2B3C2。表4方差分析中F值大小次序為FA>FB>FC，表明各因素對硼處理根瘤菌12531f菌株胞外多糖提取的影響情況與表3正交試驗分析結果一致，三氯乙酸體積分數對硼處理根瘤菌胞外多糖提取的影響顯著(P<0.05)，其余兩因素影響不顯著。

綜合上述分析，結合單因素試驗得硼處理根瘤菌12531f菌株胞外多糖提取的最優條件為：三氯乙酸體積分數為10%，醇沉倍數為3倍，醇沉時間為24 h。在此最優條件下進行驗證試驗，平行試驗3次得到硼處理根瘤菌12531f菌株胞外多糖含量平均值為33.23 μg/mL，與優化前相比胞外多糖含量提高了56.97%。

表4 正交試驗方差分析

3 討論

3.1 適宜硼濃度的篩選

D600nm值表示被檢測細菌所吸收的光密度值，在此波長下，同一種細菌菌懸液的濃度與被吸收的能量成定量關系。因此，可以用D600nm值表示所測細菌在特定試驗條件下含有的細菌相對數目，以此來反映細菌的相對生長量[24]。細菌的生長主要是指細胞繁殖而引起的細菌細胞數目的增多，包括細菌胞內所有物質的倍增[25]。本研究發現，與對照相比，硼濃度為1 mg/L時，根瘤菌12531f 菌株的D600nm增加最顯著，說明適宜濃度的硼可以加速細胞分裂，使細胞數目增加[9]。Montanari等[26]研究發現細菌遭遇環境脅迫時，會產生一系列的生理應激反應來響應環境脅迫，包括蛋白質復合物的重組，代謝物質變化以及細胞形態的變化，本研究表明硼脅迫引發了根瘤菌內響應機制，使體內某些代謝途徑或酶發生變化，繼而使生長加快。Lee等[27]也發現Lactobacillusplantarum受到堿脅迫時，菌體細胞會分散成單個菌落，菌體明顯變長，長絲狀菌體生長加快。鈣調蛋白是廣泛存在于真核生物體內的蛋白質，與細胞內很多酶的活性有關[28]，已有研究發現原核生物體內存在類鈣調蛋白，其與原核生物體內孢子形成，細胞分裂，異型細胞形成等有關[29]，硼對根瘤菌繁殖的影響可能與根瘤菌體內的類鈣調蛋白的作用有關。根瘤菌的繁殖和個體的生長依賴于胞內物質的合成和加倍，硼可以促進根瘤菌體內一些酶的活性[30]，繼而促進根瘤菌的繁殖和生長。

3.2 硼對根瘤菌12531f菌株胞外多糖含量的影響

根瘤菌產生的胞外多糖不僅可以富集環境中的營養元素，還參與根瘤菌與宿主植物相互作用時的信號交流，在促進根瘤菌侵染宿主、改變宿主植物的根毛細胞骨架結構、決定宿主專一性、參與自身抵御宿主防御系統反應等過程中扮演著不可替代的作用[31]。硼與根瘤菌胞外多糖和脂多糖(LPS)的形成有關[32]，適宜濃度硼可以引起菌絲生物量積累并可能引起糖代謝障礙以及菌體可溶性糖的分泌[33]，研究表明適宜濃度的硼可以顯著促進根瘤菌12531f菌株胞外多糖的含量。適宜濃度的硼通過影響微生物體內碳水化合物的能量代謝[34]，繼而影響根瘤菌體內胞外多糖的合成。同時適宜濃度硼可以調節根瘤菌體內某些代謝通路及其相關酶的活性，間接促進胞外多糖的分泌量[30]。

3.2 硼處理根瘤菌12531f菌株胞外多糖提取條件的優化

目前，根瘤菌胞外多糖提取工藝仍存在提取方法不純熟、提取量少、效率低等缺點，與其他脫蛋白方法相比，適宜的三氯乙酸可以提高胞外多糖提取過程中脫蛋白效率，減少胞外多糖的損失[35]。本研究表明，三氯乙酸體積分數為10%時，硼處理根瘤菌12531f菌株的胞外多糖提取含量最高。硼處理菌株12531f胞外多糖提取過程中，適宜的醇沉倍數降低了多糖的溶解度[36]，有利于多糖的析出，同時也有助于小分子和水溶性大分子色素的脫去并減少乙醇的浪費[37]，提高胞外多糖提取量及純度。醇沉時間在胞外多糖提取過程中也尤為重要，時間太短，胞外多糖不能夠充分析出，繼而影響胞外多糖提取量，時間太長會影響胞外多糖的純度[38]。

正交試驗法是在全面試驗組合中挑選出代表性強的少數試驗組合，并通過對其結果進行分析，推斷出最優因素水平組合，其優點是簡單易行、高效省時，具有較大的利用價值，但缺點是它僅對孤立試驗點進行分析，而無法找到整個區域上因素的最佳組合[39-40]。本試驗在提高胞外多糖含量時，從經濟成本和時間成本考慮，改變提取條件，分別進行單因素試驗和正交試驗，從而得到根瘤菌胞外多糖的最佳提取條件，所得產量相比優化前提高了56.97%。

4 結論

以苜蓿根瘤菌12531f菌株為研究材料，篩選出適宜硼濃度為1 mg/L。用此濃度硼處理根瘤菌12531f菌株，采用三氯乙酸提取為基礎，乙醇沉淀的方法提取胞外多糖，在三氯乙酸體積分數、醇沉倍數、醇沉時間各單因素試驗的基礎上，采用正交試驗得硼處理根瘤菌12531f菌株胞外多糖的最佳提取條件：三氯乙酸體積分數為10%、醇沉倍數為3倍、醇沉時間為24 h。在該條件下，試驗提取所得胞外多糖含量為33.23 μg/mL，較優化前胞外多糖含量提高了56.97%。