溫度和乳酸菌添加劑對燕麥青貯發酵品質及有氧穩定性的影響

琚澤亮，趙桂琴，柴繼寬

(甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

燕麥(Avenasativa)分布于世界40多個國家，主要集中在N 40°以北地區，包括亞洲、歐洲和北美，因此，這一地帶也被稱為北半球燕麥帶[1]。目前，燕麥世界種植面積約為250萬hm2，總產量超過4.3億噸[2]。在我國，燕麥在北部和西部地區廣泛種植，黃土高原是主要產區之一，包括陜西、甘肅和山西省的部分地區[3-4]。在這些地區，燕麥是糧飼兼用作物，主要用作牲畜飼草料，在7月中下旬，燕麥處于灌漿至乳熟期時收獲，調制成青貯飼料。但是，由于晝夜溫差大、日照時間較長，加之青貯基礎設施尚不完善，燕麥青貯常常面臨高溫和強輻射問題。燕麥青貯飼料通常被露天堆放在水泥地面上，這可能會降低青貯包膜的氣密性和對輻射和高溫的抵抗能力[5-6]，并最終導致干物質含量在整個發酵和有氧飼喂過程的大量損失，尤其是在夏季和初秋。該地區7～10月的積溫和輻射分別為1 809.2℃和1 147.6 kwh/m2[3]。前人的研究表明，在青貯之前使用乳酸菌接種劑接種可顯著提高青貯飼料的發酵質量[7]。但是，當在不同的條件(包括儲存溫度、氣候和包裝密度等)下對飼草青貯進行評估時，乳酸菌添加劑對青貯發酵的影響結果可能會不一致。在高溫條件下，用商業乳酸菌接種對青貯飼料發酵質量幾乎沒有改善作用[8]。此外，發酵過程中的溫度變化可能不僅僅歸因于季節變化，還存在晝夜溫差和天氣變化等。因此，儲藏溫度對青貯飼料發酵質量的影響值得研究。

青貯是一個利用微生物厭氧發酵的復雜過程，受到多種因素的影響，添加劑可以有效改善青貯飼料的發酵品質[9]。在高溫條件下利用溫帶或熱帶飼草及農作物調制青貯飼料會使制成的青貯飼料中乳酸濃度降低，pH值和丁酸含量升高[10-12]。但燕麥是喜冷涼作物，多種植于二陰山區，Chen等[13]發現在青藏高原地區，乳酸菌添加劑可顯著降低燕麥和箭筈豌豆混合青貯的丁酸積累量，使得青貯飼料進行更多的乳酸發酵，而丙酸的施用可顯著改善青貯飼料的有氧穩定性，但有關利用乳酸菌添加劑調制燕麥青貯飼料的發酵特性和有氧穩定性方面的研究較少。

因此，本研究利用商業乳酸菌添加劑和耐高溫乳酸菌劑進行燕麥青貯調制，并設置不同的貯藏溫度，探討乳酸菌添加劑和溫度對燕麥青貯發酵品質及有氧穩定性的影響，為改善黃土高原夏秋燕麥青貯發酵質量提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

青貯燕麥原料為隴燕3號燕麥(Avenasativacv.Longyan No.3)，由甘肅定西民祥牧草有限公司提供。燕麥在灌漿至乳熟期刈割，經大型飼草揉搓機揉絲后，不斷用水分測定儀測量含水量，待含水量達到65%～70%時進行青貯調制。燕麥原料的主要化學成分及微生物組成見表1。

表1 燕麥青貯原料化學成分及微生物組成

1.2 試驗設計

試驗設無添加(CK)，商業青貯添加劑Synlac I(SLI，亞芯生物科技有限公司)和人工篩選菌株LactobacillusrhamnosusHT1(HT1，由華南農業大學提供)3個添加處理。乳酸菌添加劑添加量以青貯料鮮重為基準，添加量均為105cfu/g FM，對照添加等量清水，與青貯原料充分混勻，裝入30 cm×20 cm的聚乙烯青貯袋，每袋500 g，裝填密度為210 kg/m3DM，用真空包裝機(SINBO Vacuum Sealer,Hong Tai Home Electrical Appliance Co.Ltd.)抽氣、密封，真空包裝機型號DZ-280/2SD，真空泵功率0.18 KW，真空極限0.045 Mpa，各袋抽氣時間均為1 min，熱封時間3 s。每個處理分為3組，每組6次重復，置于溫度分別為25°C(T1)，35°C(T2)和45°C(T3)的恒溫培養箱中保存，60 d后采樣測定青貯飼料的化學成分、微生物組成及有氧穩定性。

1.3 指標測定

1.3.1 營養指標測定及微生物分析 稱取100 g樣于105℃滅酶15 min后65℃烘干至恒重。烘干樣粉碎后過40目篩并置于自封袋中密封保存，用于各指標測定。干物質(dry matter，DM)采用烘箱干燥法測定；pH采用PHS-3C型數顯酸度計測量；總氮(total nitrogen，TN)采用凱氏定氮法測定，粗蛋白(crude protein，CP)含量為總氮含量的6.25倍；氨態氮(ammonia nitrogen，NH3-N)采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定；水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)采用蒽酮比色法測定；中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)與酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)采用Van soest法測定。

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)、好氣性細菌(aerobic bacteria)、霉菌(mold)和酵母菌(yeast)分別采用MRS培養基、普通瓊脂培養基和虎紅瓊脂培養基計數，培養基配方參照琚澤亮等[14]的研究。

1.3.2 發酵品質分析 取20 g青貯樣，加入180 mL去離子水于4℃冰箱浸提24 h，四層紗布過濾后用定性濾紙精濾，0.22 μm濾膜過濾，用來測定pH、乳酸及揮發性脂肪酸。采用安捷倫1260高效液相色譜和G1321B紫外熒光檢測器測定乳酸(lactic acid，LA)及揮發性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs，包括乙酸，丙酸和丁酸)。色譜條件[15]：SB-AQ C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)；流動相A(甲醇)：流動相B[0.01 mol/L(NH4)2HPO4，pH=2.70] = 3∶97，流速1 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長210 nm，柱溫25℃。

1.3.3 有氧穩定性 將青貯飼料放入30℃的絕緣聚苯乙烯泡沫箱中，并用紗布覆蓋，分別在0、3、6和9 d測量青貯飼料的pH值變化[16]。

1.4 統計分析

在進行統計分析之前，對微生物數量值進行對數轉換(即每克材料菌落形成單位以10為底的對數)。 采用Excel 2019對數據進行初步整理，以SPSS 20.0軟件的GLM模型對所有數據進行方差的最小二乘法分析，數據分析按隨機區組實驗設計，階乘排列處理因素(3個添加劑處理(3個貯藏溫度)，固定因子為重復、添加劑種類、貯藏溫度及添加劑種類和貯藏溫度的交互作用。當檢測到顯著差異時，結合Duncan法進行多重比較(P<0.05)。試驗誤差以標準誤(Standard error)表示。

2 結果與分析

2.1 燕麥青貯前化學成分及微生物組成分析

燕麥青貯前DM含量為321.4 g/kg FM，具有適宜青貯的水分含量。WSC、CP和NDF含量分別為183.5、128.1和556.1 g/kg DM，而ADF則低至289.5 g/kg DM，表明燕麥原料具有較好的營養品質。新鮮燕麥原料pH值為6.02，附生乳酸菌的數量少于5 log10cfu/g FM，好氣性細菌、霉菌和酵母菌的數量分別為7.64、3.65和3.30 log10cfu/g FM(表1)。

2.2 溫度和乳酸菌添加劑對燕麥青貯發酵質量的影響

乳酸菌添加劑和貯藏溫度的互作效應對WSC、LA、乙酸、丙酸、丁酸、LA/AA、VFA、NH3-N含量以及LAB、好氣性細菌、霉菌和酵母菌數量均有影響，但對DM和pH值影響不顯著(P>0.05)(表2)。

表2 溫度和乳酸菌添加劑處理下燕麥青貯過程中的化學成分和pH值

在T1處理下，與對照組相比，乳酸菌添加處理提高了WSC、LA含量及LA/AA值、LAB數量(P<0.05)，降低了乙酸、NH3-N含量及好氣性細菌和酵母菌數量(P<0.05)，同時，其霉菌和酵母菌數量低于1.00 log10cfu/g FM，未檢測到丙酸和丁酸。兩個乳酸菌添加劑處理組相比，SLI比HT1處理擁有更高(P<0.05)的WSC、LA、乙酸和VFA含量，NH3-N含量和好氣性細菌數量更低，發酵質量更好(表3)。

在T1和T2處理下，所有青貯飼料的pH值均較低(<4.0)，而T3處理下pH值較高(4.14～4.28)。與對照組相比，乳酸菌添加劑對T2處理下各指標的影響與T1處理中相似，DM、WSC、LA含量和LAB數量增加，而乙酸、丙酸、丁酸、VFA、NH3-N含量及好氣性細菌、霉菌和酵母菌數量減少。在T3處理下，與SLI和對照相比，HT1處理組pH(4.14)和NH3-N含量(28.9 g/kg TN)最低，DM、WSC、LA、AA和VFA含量最高，表明在高溫下HT1處理效果更佳。

表3 溫度和乳酸菌添加劑處理下燕麥青貯過程中乳酸及揮發性脂肪酸的含量

與青貯之前的燕麥原料相比，所有青貯飼料中的WSC含量均顯著降低，pH值也相應降低(表1，表2)。隨著儲存溫度的升高，WSC顯著下降，與T1的對照相比，在T2和T3的對照中WSC含量分別下降了13.08%和23.39%。乳酸菌添加劑可顯著增加WSC含量，尤其在T3處理中，SLI和HT1分別較對照增加了46.88%和78.37%，在3種儲存溫度處理中增幅最大，同時，HT1的WSC含量在所有處理中最高(74.2 g/kg DM)。LA含量顯示出相似的結果，與T1(29.6 g/kg DM)相比，T2(13.9 g/kg DM)和T3(11.6 g/kg DM)的對照較低(P<0.05)。乳酸菌添加劑顯著增加了LA含量，在T1處理中SLI(92.1 g/kg DM)和HT1(82.0 g/kg DM)均達到最高值，T2處理中SLI的增幅最大(為對照的2.27倍)，T3處理中HT1增幅最大(為對照的4.67倍)。

NH3-N含量隨儲存溫度的升高而增加，隨著儲存溫度分別從25℃升高到35℃和45℃，對照組NH3-N含量分別增加了18.83%和103.98%。3個儲存溫度下，乳酸菌添加劑均降低了NH3-N含量。SLI與對照相比，NH3-N含量分別降低了88.06%(T1)、13.39%(T2)和10.66%(T3)；同時，HT1在高溫下降低NH3-N含量效果更明顯，與對照相比，T1、T2和T3分別降低了77.98%、77.23%和62.42%。

表4 溫度和乳酸菌添加劑處理下燕麥青貯過程中主要微生物類群數量

乳酸菌添加劑還可以減少好氣性細菌的數量(表4)，隨著儲存溫度的升高，與SLI相比，HT1的好氣性細菌數量降低幅度更大。隨著溫度的升高，對照的酵母數量減少。盡管乳酸菌添加劑顯著減少了酵母數量，但SLI處理在高溫下呈上升趨勢，而HT1在控制酵母數量上效果更佳。

2.3 溫度和乳酸菌添加劑對燕麥青貯發酵有氧穩定性的影響

在有氧階段，所有處理的青貯飼料前3 d的pH值均出現輕微波動。但在6 d后，25℃(T1)的青貯飼料pH值急劇增加(平均從3.87增至6.11)，其次是T2處理(平均從3.86增至4.97)，最后是T3處理(平均從4.22增至4.99)。不同處理之間pH值變化也不同。在T1下，有氧處理6～9 d后，與對照組相比，乳酸菌添加劑處理使pH顯著(P<0.05)增加；但在T2和T3下，兩個乳酸菌添加劑的效果不同。有氧處理6 d后，SLI處理與對照相比對pH值無顯著影響(P>0.05)，而HT1使T2和T3下pH分別顯著(P>0.05)降低18.56%和26.66%。有氧處理9 d后，SLI僅在T3時使pH顯著(P<0.05)下降10.10%，而HT1導致T2和T3下pH值分別減少了31.72%和35.81%(圖1)。

圖1 燕麥青貯料有氧階段的pH值Fig.1 Changes in pH value of oat silages after exposure to air注：不同小寫字母表示同一時間下不同處理間差異顯著(P<0.05)，SE：標準誤

3 討論

在青貯過程中，較低的WSC和DM含量可能會導致梭狀芽孢桿菌發酵，并使動物對青貯飼料的采食率大大降低[17]，表明原料的WSC和DM含量對青貯發酵程度影響很大。本研究中，燕麥原料的WSC和DM含量分別為183.5 g/kg DM和321.4 g/kg FM，高于Shao等[18]的報道。這可能是由黃土高原較大的晝夜溫差和較長的日照時間造成的。溫度和日照會影響植物養分積累，較高的溫度和較長的日照時間有利于光合作用，夜間較低的溫度可以降低呼吸損耗，從而減少有機物的降解[19]。對照在25℃下發酵良好，pH值為3.93，NH3-N含量為37.7 g/kg TN，霉菌數量小于1.00 log10cfu/g FM，表明燕麥較高的WSC含量是青貯發酵成功的重要因素。對于發酵良好的青貯飼料，原料在青貯前必須有較高的WSC含量和足夠的LAB數量[20]。優質青貯取決于植物附生LAB的數量，不同植物附生乳酸菌數量和種類差異較大，在牧草上，抑制梭狀芽孢桿菌活性的最小LAB數量為5 log10cfu/g FM[19,21]。本研究中，燕麥原料附生LAB數量為4.43 log10cfu/g FM，低于5 log10cfu/g FM。但對照青貯飼料在常溫下(25℃)具有良好的發酵質量，這可能是因為青貯調制時對原料進行了揉絲和真空密封處理。Johnson等[22]發現秸稈揉絲處理的青貯飼料和未經處理的玉米青貯飼料相比，具有較小的纖維直徑，LA含量顯著增加(P<0.05)。青貯60 d，所有青貯飼料中的好氣性細菌、酵母和霉菌數量均減少，也驗證了真空密封減少了微生物和氧氣含量。

適宜的乳酸菌添加劑會在青貯發酵開始后成為優勢菌，從而迅速降低pH值，抑制梭狀芽胞桿菌的生長。當pH值高于4.5時梭狀芽胞桿菌會將蛋白質和碳水化合物發酵成丁酸[20]。同時，pH的降低可以抑制病原性微生物的生長，避免蛋白質被降解為NH3-N[18]。本研究中，與添加劑處理相比，25℃和35℃貯藏的對照青貯飼料中丙酸、丁酸和NH3-N含量更高，WSC含量更低，45℃的對照青貯飼料具有最高的NH3-N含量，表明燕麥原料附生的LAB不能與其他青貯微生物快速競爭，而丙酸桿菌和梭狀芽胞桿菌在青貯過程早期活性較高。Kim和Adesogan[23]研究表明，儲存在40℃的玉米青貯飼料具有比20℃更高的pH和NH3-N含量。

青貯飼料發酵涉及微生物和酶活性，根據青貯飼料發酵進程的溫度曲線，常溫和嗜熱乳酸菌在青貯的不同階段均具有活性[16,24-25]。因此，青貯接種劑的開發應考慮不同菌株對溫度的適應性[26-27]。本研究中，與對照組相比，SLI在45℃下對青貯飼料pH、丙酸、丁酸和VFA含量沒有顯著影響，說明一些LAB無法在高溫下生長，證實了高溫是限制LAB接種效果的重要因素之一。Chen等[8]也發現在高溫下將LAB接種到牧草上對提高發酵質量沒有影響。本研究中，隨著溫度的升高，青貯飼料pH值顯著升高和VFA含量下降，對照中好氣性細菌、霉菌和酵母菌數量也降低，這表明除LAB外，一些梭菌也被高溫抑制。與SLI和對照青貯飼料相比，HT1處理組在高溫下WSC、LA、乙酸和VFA含量更高，LAB數量和NH3-N含量更低，說明HT1在高溫時對燕麥青貯發酵質量的提高更有效。這與Chen等[8]的報道一致。

青貯飼料的有氧腐敗是一個復雜的過程，由多種因素共同作用，包括溫度、微生物活性和乳酸菌接種等[24]，青貯飼料有氧穩定性受溫度影響很大。Wilkinson和Davies[28]發現，好氧降解是由好氣性細菌、酵母和霉菌利用青貯飼料中的WSC和乳酸進行生長繁殖引起的，導致pH升高、釋放大量熱量、營養物質可利用性下降。因此，較大的pH值變化和較高的不良微生物數量表明青貯飼料的有氧穩定性差。在本研究中，所有青貯飼料在有氧處理前3 d保持穩定，25℃貯藏的青貯飼料在6 d后pH值急劇升高，表明變質速度加快。這可能歸因于青貯后飼料中較高的WSC和LA含量。Huisden等[29]也報道了類似的結果，LA或糖含量較高的青貯飼料在暴露于空氣時不穩定。青貯飼料含有較多乙酸、丁酸和其他VFA時具有良好的有氧穩定性[30]。本研究中，貯藏在35℃的青貯飼料pH增幅低于25℃(圖1)，可能是由于T2處理中青貯飼料VFA和NH3-N含量較高，抑制了酵母的生長，與T1相比，其酵母菌數量顯著降低。同時，貯藏在45℃的青貯飼料具有更好的需氧穩定性也說明了這一點，這與Liu等[16]的結果一致。

4 結論

隨著貯藏溫度的升高，燕麥青貯飼料pH值和NH3-N含量顯著增加，飼料品質惡化。LactrhamnosusHT1在高溫下可以顯著提高燕麥青貯飼料的發酵品質和有氧穩定性，降低了NH3-N含量及雜菌數量，并在有氧階段使青貯飼料保持較低的pH值。因此，在黃土高原地區的夏季和初秋，用HT1調制燕麥青貯飼料可提高發酵品質及有氧穩定性。