燕麥根腐病病原真菌分離鑒定及致病性研究

楊琰珊，姚拓，張建貴，白潔，撖冬榮，李琦，李昌寧，董凱，付衛剛

(甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

燕麥(Avenasativa)屬禾本科(Gamineae)燕麥屬(Avena)一年生糧飼兼用草本作物[1-2]；具有較強的抗逆性與適應性，在世界各地皆有分布[3]。燕麥富含蛋白質、維生素、脂肪等多種營養成分，營養價值較高[4]；可調節血脂、改善血液循環，具有獨特的醫療保健功能；其莖稈、葉柔嫩多汁，難以消化的纖維含量低，是農牧區的優良牧草，在畜牧業發展中占有舉足輕重的地位[5]。病害是飼用作物生產的主要限制因素之一，能影響作物的產量與品質[6]；燕麥病害在我國及世界燕麥種植區普遍發生，影響燕麥產業的健康穩定發展。

目前我國對于燕麥病害的研究多集中于燕麥植株地上病害，如由禾本科布氏白粉菌(Blumeriagraminis)引起的白粉病[7]、大麥堅黑粉菌(Ustilagohordei)引起的堅黑穗病[8-9]、燕麥內平臍蠕孢(Drechsleraavenacea)與細交鏈孢(Alternariaalternata)引起的葉斑病[10]、大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus)引起的紅葉病[11]等。但對燕麥根腐病的研究相對較少，燕麥根腐病是一種常見的土傳病害，該病主要由病原真菌引起；發病初期僅有個別須根感病出現病斑，植株不表現明顯癥狀；后期隨根部腐爛程度加劇，導致吸收水分與養分功能減弱，地上部分出現葉片發黃、萎蔫、枯萎等癥狀，嚴重時甚至死亡。根腐病病原主要以菌絲體或孢子形式在病殘體和土壤中越冬，成為翌年主要初侵染源，從植株根莖處或根部傷口處侵入，通過灌溉水或雨水進行傳播與蔓延[12]。

根腐病對多種植物有較強的危害性，研究發現：小麥根腐病能使小麥減產15%～25%，嚴重地塊則能減產30%～70%[13]；李雪萍[14]在甘肅省甘南州和青海省等青稞種植區調查發現，青稞根腐類病害的田間發病率均在5%～20%[14]；三七、白術、黃芪等以地下部位作藥用的植物受根腐病危害較大，嚴重影響其藥用價值與經濟價值[15]。根腐病病原多樣，且不同作物致病菌與致病菌的致病性存在差異，優勢病原也不盡相同。研究發現：小麥根腐病病原為麥根腐平臍蠕孢[13](Bipolarissorokiniana)、黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)、禾谷鐮刀菌(F.graminearum)、假禾谷鐮刀菌(F.pseudograminearum)與木賊鐮刀菌(F.equiseti)[16]，其中麥根腐平臍蠕孢為優勢病原，其致病力與菌落顏色深淺有關，顏色越深致病力越強[17]，黃色鐮刀與禾谷鐮刀在多地均有分離，且致病力較強[18]。青稞莖基腐病病原為燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)、木賊鐮刀菌(F.equiseti)、銳頂鐮刀菌(F．acuminatum)、柔毛鐮刀菌(F.flocciferum)和F.langsethiae[13]，其中麥根腐平臍蠕孢、燕麥鐮刀菌和木賊鐮刀菌的致病力較強[14]。辣椒根腐病的主要致病菌為半裸鐮刀菌(F.semitectum)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、輪枝鐮刀菌(F.verticillioides)和茄病鐮刀菌(F.solani)，其中尖孢鐮刀與茄病鐮刀為優勢病原且致病性較強，病情指數分別為67.22和66.27[19]。此外，我國對草莓[20]、苜蓿[21]、白及[22]、黃芪[23]等植物根腐病病原皆有研究。

我國對燕麥根腐病的研究見南志標[24]在《中國牧草真菌病害名錄》中對燕麥根腐病病原名稱有簡單報道，且具體分布及致病力強弱不詳。鑒于此，以燕麥根腐病病株為材料，對其病原菌進行分離、鑒定及致病性測定，以期明確燕麥根腐病病原菌種類，為燕麥根腐病的診斷和防治提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料來源

將采集于甘肅省通渭縣華家嶺燕麥主產區的燕麥根腐病病株帶回實驗室進行病原真菌分離鑒定及致病性測定，以確定燕麥根腐病的致病菌。

1.2 病原真菌的分離純化

采用組織分離法[25]，將燕麥根腐病病株根部病健交界處剪成0.5 cm的小段，將小段經75%酒精浸泡30 s后，放入1%次氯酸鈉中浸泡5 min，用無菌水多次沖洗，最后接于PDA培養基，25℃恒溫培養，待長出菌絲后挑取菌落邊緣處的菌絲接于新的PDA培養基上進行純化，反復多次，待純化好后，將菌株轉接于PDA試管斜面，保存于4℃培養箱待用。

1.3 致病性測定

采用水瓊脂平皿法[26]對分離真菌進行致病性測定，用柯赫氏法則驗證。

挑選顆粒飽滿、大小一致的燕麥種子，經75%酒精消毒30 s后，再用1%次氯酸鈉消毒8 min，用無菌水反復沖洗干凈，待用。

制備WA(水瓊脂)培養基：瓊脂12 g，水1 L，分別裝入1 L三角瓶中，121℃高壓滅菌30 min，倒入培養皿中，待用。

將培養好的真菌打成菌餅，接入準備好的WA培養基中心位置，將經消毒的燕麥種子均勻擺放于菌餅周圍，且與菌餅保持一定距離；每株培養皿內擺放10粒燕麥種子，每個真菌做3個重復，以不接菌作為對照；置于25℃光照培養箱中，8 d后統計發病情況，測定發病率與病情指數[26]。病害指數分級標準[26]見表1。

發病率=(發病株數/總株數)×100%

病情指數=100×∑(各級發病指數×各級代表值)/(調查總植株數×最高級代表值)

從發病植株根部再次分離病原菌，并與初接種的分離真菌做對比，確定分離真菌是否為致病菌。

表1 病害指數分級標準[26]

1.4 病原真菌的形態學觀察

將前期分離純化好保存于試管斜面的菌株接于PDA培養基，觀察其菌落形態、菌絲疏密情況、是否產生色素及色素顏色。挑取少量菌絲，制作臨時玻片，用無菌水做浮載劑；將做好的臨時玻片置于光學顯微鏡下，觀察分生孢子的形狀及大小、產孢細胞及厚垣孢子有無，并拍照。根據病原真菌形態特征，參照《真菌鑒定手冊》[27]及《鐮刀菌屬》[28]等資料進行形態學鑒定。

1.5 分子生物學鑒定

1.5.1 基因組DNA提取 采用Omega真菌DNA基因組試劑盒提取真菌DNA，將培養好的真菌菌絲置于研缽中加入液氮進行研磨，研磨后按試劑盒提供的方法步驟進行操作。將提取的DNA置于-20℃冰箱中保存，待用。

1.5.2 PCR擴增及測序 用真菌通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增。反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環，72℃延伸10 min。將PCR擴增產物取出5 μL，再用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，隨后將PCR產物送往公司進行測序。

1.5.3 系統發育樹構建 將測序獲得的序列在NCBI上進行BLAST比對，從GenBank數據庫中選出最相近的序列進行同源性比較；用Mega 7.0軟件構建基于ITS的系統發育樹，確定分離菌株與所選菌株的親緣關系。

2 結果與分析

2.1 病原真菌的分離純化

選取具有代表性的5株真菌，這5株真菌分離頻率較高，分別命名為Y2、Y5、Y13、Y18、Y31。

2.2 致病性測定

采用水瓊脂平皿法對5株真菌進行致病性測定，發現5株真菌均能使燕麥致病。其中Y5、Y18及Y31的發病率均為100%，Y2與Y13發病率分別為80.00%和96.67%。病情指數由高至低依次為：Y5(79.67%)>Y31(74.33%)>Y18(71.67%)>Y13(60.00%)>Y2(47.00%)(表2，圖1)。將每個處理發病根部進行病原菌再分離，并與初接菌做對比，發現再分離菌與初接菌為同一種菌，符合柯赫氏法則；因此，Y2、Y5、Y13、Y18、Y31為燕麥根腐病的致病菌(圖2)。

表2 分離真菌的致病性測定

圖1 病害指數分級Fig.1 Classification of disease index

圖2 平皿法致病性測定Fig.2 Plate method for pathogenicity determination

2.3 病原真菌鑒定

2.3.1 菌株Y2的鑒定 菌株Y2在PDA培養基菌絲呈白色，生長一段時間后邊緣呈蠟黃色，羊絨狀(圖3-A)，菌落背面呈土黃色(圖3-B)，邊緣整齊。大型分生孢子呈馬特型，頂細胞稍彎，兩端較鈍，通常有2～5個隔膜，大多數為3隔，量度為(25.34～36.42) μm×(4.67～5.21) μm；小型分生孢子呈卵形或橢圓形，0～1個隔膜，量度為(6.05～14.37) μm×(2.75～4.36) μm；產孢細胞為單瓶梗產孢且瓶梗較長；厚垣孢子為球形，通常對生或串生(圖3-C～F)。根據形態特征將Y2初步鑒定為茄病鐮刀菌(F.solani)。

菌株Y2經DNA提取、ITS引物擴增測序后，通過Gen-Bank數據庫對菌株Y2的堿基序列同已知物種序列進行同源性比對，結果表明Y2與數據庫中Fusariumsolani(登錄號為MH517680)序列同源性為100%。進一步構建基于ITS的系統發育樹，進行系統進化分析，結果表明菌株Y2與Fusariumsolani(登錄號為MH517680)聚為同一支，且自展值為99%(圖4)；結合形態學特征將Y2鑒定為茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)。

圖3 Y2的形態特征Fig.3 Morphological characteristics of Y2注：A：在PDA上菌落的正面形態；B：在PDA上菌落的背面形態；C：小型分生孢子與分生孢子梗；D、E：分生孢子；F：厚垣孢子

2.2.2 菌株Y5的鑒定 菌株Y5在PDA培養基氣生菌絲呈粉白色，中間為黃色，生長速度較快，菌絲較長，羊毛狀(圖5-A)；菌落背面初期呈紅色，邊緣為白色，后期呈深紅色(圖5-B)；邊緣整齊。未見小型分生孢子；大型分生孢子為鐮刀型，直且細長，4～6個隔膜，多為5個，足細胞明顯，頂細胞較細，量度為(40.25～58.73) μm×(3.52～5.64) μm，單瓶梗產孢；厚垣孢子較少，一般間生(圖5-C～F)。根據形態特征將Y5初步鑒定為禾谷鐮刀菌(F.graminearum)。

圖4 基于ITS構建Y2系統發育樹Fig.4 Construction of Y2 phylogenetic tree based on ITS注：分支上的數據表示Bootstrap檢驗的支持百分率，括號內為GenBank序列號；圖中標尺代表位點的堿基替代率，下同

圖5 Y5的形態特征Fig.5 Morphological characteristics of Y5

菌株Y5經DNA提取、ITS引物擴增測序后；通過Gen-Bank數據庫對菌株Y5的堿基序列同已知物種序列進行同源性比對，結果表明Y5與數據庫中F.graminearum(登錄號為MF800905)序列同源性為100%。進一步構建基于ITS的系統發育樹，進行系統進化分析，結果表明菌株Y5與F.graminearum(登錄號為MF800905)聚為同一支，且自展值為97%(圖6)；結合形態學特征將Y5鑒定為禾谷鐮刀菌(F.graminearum).

圖6 基于ITS構建Y5系統發育樹Fig.6 Construction of Y5 phylogenetic tree based on ITS

2.2.3 菌株Y13的鑒定 菌株Y13在PDA培養基上菌絲呈白色或淡粉色，中間帶有紫色，棉絮狀(圖7-A)；菌落背面初期呈紫色，邊緣為白色，后期為深紫色(圖7-B)；邊緣整齊。小型分生孢子呈卵形或紡錘形，數量較多，常串生或假頭狀著生，0～1個隔膜，量度為(3.17～14.76) μm×(1.85～3.32) μm。產孢細胞為復瓶梗產孢，大型分生孢子不易產生，2～4隔，量度為(18.54～20.36) μm×(3.12～4.50) μm；無厚垣孢子產生(圖7-C～F)。根據形態特征將Y13初步鑒定為串珠鐮刀菌(F.moniliformi)。

圖7 Y13的形態特征Fig.7 Morphological characteristics of Y13注：A、B：在PDA培養基上的正反面；C：小型分生孢子；D：大、小型分生孢子；E：小型分生孢子串狀著生；F：產孢細胞

菌株Y13經DNA提取、ITS引物擴增測序后，通過Gen-Bank數據庫對菌株Y13的堿基序列同已知物種序列進行同源性比對，結果表明Y13與數據庫中Gibberellamoniliformi(登錄號為JF499683)序列同源性為99%。進一步構建基于ITS的系統發育樹，進行系統進化分析，結果表明菌株Y13與G.moniliformi(登錄號為JF499683)聚為同一支，且自展值為92%(圖8)；G.moniliformi是串珠鐮刀菌(F.moniliformi)有性時期的名稱，因此，結合形態學特征將Y13鑒定為串珠赤霉菌(G.moniliformi)。

圖8 基于ITS構建Y13系統發育樹Fig.8 Construction of Y13 phylogenetic tree based on ITS

2.3.4 菌株Y18的鑒定 菌株Y18在PDA培養基上，菌絲為粉白色，略帶淺粉色，氈狀(圖9-A)，菌落背面呈深紅色(圖9-B)，邊緣整齊。大型分生孢子較多，呈鐮刀型，細長，兩端較尖，3～6個隔膜，量度為(22.59～48.83) μm×(2.65～4.86) μm。小型分生孢子為卵形、棒形或長橢圓形，可假頭狀著生，1～2個隔膜，量度為(7.85～18.05) μm×(1.57～3.37) μm(圖9-C～圖9-E)。厚垣孢子為球形，常串生(圖9-E)。根據形態特征將Y18初步鑒定為鐮刀菌。

圖9 Y18的形態特征Fig.9 Morphological characteristics of Y18注：A、B：在PDA培養基上的正反面；C：小型分生孢子；D：大型分生孢子；E：小型分生孢子假頭狀著生；F：厚垣孢子

菌株Y18經DNA提取、ITS引物擴增測序后，通過Gen-Bank數據庫對菌株Y18的堿基序列同已知物種序列進行同源性比對，結果表明Y18與數據庫中G.acuminata(登錄號為EF531234)序列同源性為99%。進一步構建基于ITS的系統發育樹，進行系統進化分析，結果表明菌株Y18與G.acuminata(登錄號為EF531234)聚為同一支，且自展值為81%(圖10)；有些鐮刀菌的有性時期為赤霉菌，因此，結合形態學特征將Y18鑒定為G.acuminata。

圖10 基于ITS構建Y18系統發育樹Fig.10 Construction of Y18 phylogenetic tree based on ITS

2.3.5 菌株Y31的鑒定 菌株Y31在PDA培養基上氣生菌絲從中間向邊緣由粉色漸變為白色，棉絮狀(圖11-A)；菌落背面為紅色或紅褐色，顏色由中間向邊緣逐漸變淺(圖11-B)；邊緣不整齊。大型分生孢子呈線型，直且細長，4～7個隔膜，多為5隔，量度為(30.06～44.41) μm×(3.51～5.24) μm。未看到小型分生孢子和厚垣孢子(圖11-C，圖11-D)。根據形態特征將Y31初步鑒定為燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)。

圖11 Y31的形態特征Fig.11 Morphological characteristics of Y31注：A、B：在PDA培養基上的正反面；C、D：大型分生孢子

菌株Y31經DNA提取、ITS引物擴增測序后；通過Gen-Bank數據庫對菌株Y31的堿基序列同已知物種序列進行同源性比對，結果表明Y31與數據庫中F.avenaceum(登錄號為EF531234)序列同源性為100%。進一步構建基于ITS的系統發育樹，進行系統進化分析，結果表明菌株Y31與F.avenaceum(登錄號為EF531234)聚為同一支，且自展值為80%(圖12)；因此，結合形態學特征將Y31鑒定為燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)。

圖12 基于ITS構建Y31系統發育樹Fig.12 Construction of Y31 phylogenetic tree based on ITS

3 討論

本研究從燕麥根腐病病株中分離并選取5株具有代表性的真菌，經致病性測定，分離菌株Y2、Y5、Y13、Y18、Y31均能使燕麥根部變色；對變色根部進行病原菌再分離，其形態特征與初接菌相一致，符合柯赫氏法則；即Y2、Y5、Y13、Y18、Y31為燕麥根腐病致病菌。采用傳統分類方法鑒定真菌有一定難度和不確定性；而分子生物學鑒定方法可以彌補傳統分類鑒定方法中的不足，對病原菌進行快速準確的鑒定[29-30]。rDNA-ITS是介于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之間的區域，該區域進化速度較編碼區快，被普遍用來進行真菌種間或種內遺傳相似性的分子系統研究[31-32]；具有高度保守性，是鑒定真菌較好的輔助手段[33]。本研究通過形態學特征與rDNA-ITS序列分析相結合，分別將Y2、Y5、Y13、Y18、Y31鑒定為茄病鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、串珠赤霉菌、G.acuminata、燕麥鐮刀菌。在我國僅有南志標[24]對燕麥根腐病病原做了簡單的名稱報道，報道燕麥鐮刀菌、大刀鐮刀菌(F.culmorum)、禾谷鐮刀菌、雪腐鐮刀菌(F.nivale)、長直喙鐮刀菌(F.orthoceras)、早熟禾鐮刀菌(F.poae)、藤草鐮刀菌(F.scripi)為燕麥根腐病病原，本研究從燕麥病株中只分離出燕麥鐮刀菌和禾谷鐮刀菌，而對于所報道的其余5種鐮刀菌未曾分離。其原因可能是不同地區、不同菌株的生存環境不同所致。此外，本研究發現茄病鐮刀菌、串珠赤霉菌、G.acuminata引起燕麥根腐病為國內首次報道。

本研究通過致病性試驗，明確了各菌株的致病性，特別是Y5(禾谷鐮刀菌)，對燕麥致病力最強，發病率為100%，病情指數為79.67。禾谷鐮刀菌是玉米苗期根病和小麥赤腐病的主要致病菌，對玉米和小麥致病力較強[34-35]；這與本研究結論相一致。原因可能是：禾谷鐮刀菌在侵染和擴展過程中可分泌產生細胞壁降解酶類，這些酶可降解植物細胞壁中的多聚碳水化合物，離解細胞壁，破壞原生質，毀壞整個細胞結構[36]；此外，禾谷鐮刀菌可產生單端孢霉烯毒素，其主要組分是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，它能抑制核酸復制與蛋白質合成，抑制線粒體功能，破壞細胞膜完整性，抑制種子萌發、根系生成、根莖及愈傷組織的生長[37]。Y18(G.acuminata)與Y31(燕麥鐮刀菌)對燕麥致病力較強，病情指數分別為71.67和74.33，朱海霞[38]研究發現燕麥鐮刀菌能使野燕麥、小麥及青稞中度感病，使蠶豆、豌豆、油菜輕度或不感病；原因可能是禾本科植物根際能夠分泌某種物質誘導燕麥鐮刀菌入侵，使其對禾本科作物致病力較強，而對其他作物無致病性或致病力較弱。Y2(茄病鐮刀)與Y13(串珠赤霉)使燕麥病情指數分別為47.00與60.00，茄病鐮刀菌為多種植物根腐病的優勢病原，但其致病力相對較弱或為中等[21]；串珠赤霉菌是甘蔗梢腐病與水稻惡苗病的主要病原，對甘蔗和水稻致病力較強[39]，與本結論相一致，這可能與它自身產生串珠鐮刀菌素、伏馬菌素及鐮刀菌酸等多種毒素[40]有關。此外，本研究采用水瓊脂平皿法測定其致病性，有研究發現分別采用水瓊脂法與盆栽法測定菌株致病性，前者高于后者，但發病率及致病性趨勢一致[14]；但也有研究發現兩者并無差異[19]。由于存在差異性，后期將通過盆栽法驗證其致病性。根腐病病原種類復雜，常由多種病原菌復合侵染引起病害，本研究僅采用單一菌株接種燕麥種子進行致病性測定，為更深入了解燕麥根腐病的發病機制，需利用多種致病菌同時接種開展進一步研究。

近年來，研究者針對植物根腐病的生物防治已有相關研究，主要通過利用有機肥、植物提取液或生防菌等手段對根腐病致病菌菌絲進行生長抑制[23]。本研究后期已篩選出對燕麥根腐病致病菌有生防作用的細菌，由于植物真菌病害是影響農業發展的主要問題[41]，因此，本研究為后續對燕麥根腐病防治研究奠定了基礎。

4 結論

(1)結合形態學和分子生物學的鑒定，Y2為茄病鐮刀菌(F.solan)、Y5為禾谷鐮刀菌(F.gramineae)、Y13為串珠赤霉菌(G.moniliformi)、Y18為G.acuminata、Y31為燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)。

(2)茄病鐮刀菌、G.acuminata、串珠赤霉菌引起燕麥根腐病為國內首次報道。

(3)水瓊脂平皿法致病性測定表明5株菌均能使燕麥致病，且禾谷鐮刀菌致病力最強，病情指數為79.69。