采收期對膜莢黃芪葉茶生物活性成分的影響

黃保婷，陳垣，郭鳳霞,2，楊豆豆

(1.甘肅農業大學農學院/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室/甘肅省中藥材規范化生產技術創新重點實驗室/甘肅省藥用植物栽培育種工程研究中心，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070)

黃芪為蒙古黃芪(Astragalusmembranaceusvar.mongholicus)或膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus)的干燥根，具有補氣升陽、利水消腫，益衛固表、生津養血、行滯通痹之功效[1]，是我國傳統中藥之一。根據中國中藥化學成分數據庫，黃芪主要含有多糖、黃酮、多酚、蛋白質、氨基酸及微量元素等有效成分[2-4]，其中黃芪多糖具有抗腫瘤、抗氧化、增強機體免疫功能、調節血糖、保護心血管等作用[5-6]。黃芪總黃酮和多酚也具有一定的抗氧化作用[7-8]。黃芪的基原植物為豆科多年生草本藥用植物，兼具生態、藥用和飼用功能，目前主要開發其藥用功能。

中藥材根據藥用部位不同，其最佳采收期也有差異[9]，黃芪藥材根適宜采收期為秋末初冬[10]。最佳采收期采收時，其有效成分含量最高、外觀形狀和色澤最佳，品質最優。果盛期黃芪地上部分產量最高，黃芪甲苷含量最高[9]。黃芪因具有醫療和保健雙重作用，已被增補列入我國藥食同源中藥材，即在限定劑量范圍內既是藥品又是食品的中藥材物質，其需求量隨著人們保健意識的增強愈來愈大。膜莢黃芪野生資源已趨瀕危，藥源主要由人工栽培，其傳統藥用部位為根部[1]。然而，膜莢黃芪植株高大，枝葉繁茂，栽培過程中大量的莖葉被遺棄，造成生物資源的浪費和對環境的污染。黃芪莖葉有一定藥理作用[11]，葉茶是合理利用藥用植物葉資源的有效途徑，但至今有關膜莢黃芪葉資源開發利用相關的研究報道較少。因此，探尋膜莢黃芪葉資源開發利用途徑具有重要意義，本研究將成藥期不同生長時期采收的黃芪葉制作成葉茶，通過測定和比較各時期葉茶生物活性成分，為黃芪的綜合開發利用提供科學依據，以提高膜莢黃芪葉資源的利用價值。

1 材料和方法

1.1 試驗材料來源

供試原料采自甘肅會寧縣膜莢黃芪成藥栽培田，該區屬于東南季風氣候西北部邊緣區(N 35° 40′,E 105° 21′ )，平均海拔1 970 m。經甘肅農業大學陳垣教授鑒定為豆科植物膜莢黃芪。

儀器：電子分析天平，型號：FA1004，四川中浪科技有限公司。超聲波清洗器，型號：SB25-12DTD,寧波新芝生物科技股份有限公司。湘儀冷凍離心機，型號：H-2050R，浙江賽德儀器設備有限公司。電熱恒溫水浴鍋，型號：DK-98-II-s6，天津泰斯特儀器有限公司。島津UV-2450分光光度計，島津企業管理(中國)有限公司。電熱鼓風干燥箱，型號：101-1AB，天津市泰斯特儀器有限公司。優普系列超純水器，型號：UPD-1-201，四川優普超純科技有限公司。JFSD-100粉碎機，上海嘉定糧油儀器有限公司。

藥劑：濃硫酸、苯酚、無水乙醇、葡萄糖、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、D(+)- 無水葡萄糖：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。甲醇：分析純，天津市富宇精細化工有限公司。福林酚：分析純，北京索萊寶科技有限公司。沒食子酸：批號：110831-201605。蘆丁標準品：批號：100080-201811。

1.2 葉收獲及葉茶制備

膜莢黃芪成藥栽培于2018年3月18日移栽，4月開始陸續返青，6月上旬出現花序并開始現蕾，7月上旬花蕾逐漸開放，7月中旬進入結果期。本研究從5月30日開始采摘新鮮黃芪葉，每隔15 d采收1次，至7月15日共采收4次。每次采收后，精選無病蟲害健康的葉片按照綠茶加工工藝制成黃芪葉茶[12]，備用于生物活性成分測定。

1.3 膜莢黃芪葉茶多糖含量測定

葉茶多糖含量的測定按照葡萄糖標準曲線的繪制進行[12]，即首先配制100 mg/L的標準葡萄糖工作溶液，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL置于20 mL具塞試管中，用蒸餾水補足至1.0 mL。然后向試管中分別加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，混合均勻后，快速加入5.0 mL硫酸溶液，靜置10 min，待反應液充分混合后，將試管置于30℃水浴中反應20 min，然后在490 nm處測定系列標準溶液的吸光度。以葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線(圖1)，得回歸方程：y= 0.249x- 0.034，相關系數R2=0.999。

測試葉茶樣品制備：將0.2 g葉茶樣品置于50 mL具塞離心試管中，用5 mL水浸潤樣品，緩慢加入20 mL無水乙醇，震蕩使混合均勻，置于超聲波提取器提取30 min。提取結束后，于4 000 r/min離心10 min，棄去上清液。不溶物用10 mL 80%乙醇溶液洗滌、離心。用水將不溶物轉入圓底燒瓶，加入50 mL水，超聲提取30 min，重復2次。冷卻至室溫后過濾，將上清液轉移至200 mL容量瓶中，殘渣洗滌2～3次，洗滌液轉移至容量瓶中，加水定容至200 mL。測定時吸取1.00 mL樣品測定液于20 mL試管中，用于測定吸光度。以不加試樣的測定液為空白對照。將測得試樣溶液的吸光度代入標準曲線的回歸方程，計算出多糖含量。

圖1 葡萄糖溶液標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose solution

1.4 膜莢黃芪葉茶總黃酮含量測定

黃芪葉茶總黃酮含量按照標準曲線制備法進行[13]：吸取1.0，1.2，1.4，1.6，1.8和2.0 mg/mL蘆丁標準溶液，分別置于25 mL 具塞比色管中，用60%乙醇溶液補充至5.0 mL，加50 g/L的亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加入100 g/L的硝酸鋁溶液1.5 mL，搖勻，放置6 min，最后加入200 g/L的氫氧化鈉溶液4 mL，用60%乙醇溶液定容，搖勻，放置15 min。以試劑空白調節零點，在波長510 nm處測定吸光度。以吸光度值對應含量繪制標準曲線(圖2)，得回歸方程：y=0.294x+0.005,相關系數R2= 0.999。

葉茶樣品制備[14]：將0.1 g樣品與3 mL 95%乙醇在50℃下混合，超聲提取3次，每次30 min，然后以4 000 r/min離心10 min，將上清液轉移到10 mL容量瓶中。在510 nm下測量反應的混合物。將吸光度值用蘆丁標準曲線轉換為含量。

圖2 蘆丁溶液標準曲線Fig.2 Standard curve of rutin solution

1.5 膜莢黃芪葉茶多酚含量測定

葉茶多酚含量測定按照標準曲線制備進行[15]：吸取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 μg/mL的沒食子酸標準液各1 mL，置于帶刻度的試管內，分別依次加入10%的福林酚試劑5.0 mL，搖勻，待反應8 min后，加入7.5%的碳酸鈉溶液4.0 mL，搖勻。室溫下靜置1 h，在765 nm波長下用分光光度計測定吸光值并制作標準曲線(圖3)。得回歸方程：y= 0.478x+0.047，相關系數R2= 0.999。

測試樣品制備[14]：將0.1 g粉末樣品在70℃下用3 mL 70%甲醇懸浮，通過超聲波提取3次，每次10 min，然后以3 500 r/min離心10 min，將上清液轉移到10 mL容量瓶中。使用島津UV-2450分光光度計在760 nm下測量反應混合物。將吸光度值用沒食子酸表示的標準曲線轉換成含量。

1.6 膜莢黃芪葉茶浸出物含量測定

浸出物含量按照GB/T 8305-87[16]的基本標準進行，稱取 (3±0.001) g黃芪葉茶粉碎樣品，置于500 mL干燥錐形瓶中，加入沸騰蒸餾水450 mL，立即置于沸水浴中，浸提45 min，每隔10 min震蕩1次。浸提后乘熱減壓過濾，濾液移入500 mL容量瓶中，殘渣用少量沸騰蒸餾水洗滌2～3次，合并濾液，冷卻后用蒸餾水稀釋至刻度線。測定時準確吸取濾液50 mL，注入蒸發皿后置于沸水浴上蒸干水分，然后置于105℃恒溫烘箱烘干、稱重，再置于烘箱干燥至恒重，冷卻后稱量。每個試樣做2個平行樣。

圖3 沒食子酸標準曲線Fig.3 Standard curve of gallic acid

1.7 數據統計分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行方差分析和相關分析，多重比較選用LSR法。

2 結果與分析

2.1 采收期對膜莢黃芪葉茶多糖含量的影響

采收期對膜莢黃芪葉茶多糖含量有影響，隨采收時間延后葉茶多糖含量呈上升趨勢。在4個不同時期采收的葉茶多糖含量為4.98%～7.80%。其中，7月15日采收的葉茶多糖含量最高，5月30日采收的多糖含量最低，兩者差異顯著(P<0.05)，6月15日和6月30日采收的葉茶多糖含量差異性不顯著，但兩者均與5月30日和7月15日采收的葉茶多糖含量差異性達顯著水平(P<0.05) (表1)。

2.2 采收期對膜莢黃芪葉茶總黃酮含量的影響

在5月30日至6月30日隨生長期的延后，膜莢黃芪葉茶總黃酮含量逐漸增高，7月后顯著下降，總黃酮含量在15.73%～17.06%，6月30日采收的黃芪葉茶總黃酮含量最高，7月15日采收的葉茶總黃酮含量最低，兩者差異顯著(P<0.05)，相差1.32%。

2.3 采收期對膜莢黃芪葉茶多酚含量的影響

不同采收期的膜莢黃芪葉茶總多酚含量略有不同(P>0.05)，其中6月15日采收的黃芪葉茶多酚含量最高，5月30日采收的黃芪葉茶多酚含量最低，兩者差異不顯著(P>0.05)，相差1.139%。分期4次采收葉茶多酚含量變幅為3.88%～5.79%，變異系數11.28%(表1)。

2.4 采收期對膜莢黃芪葉茶浸出物含量的影響

膜莢黃芪葉茶中水和醇溶性浸出物含量均隨采收期延后呈逐漸上升趨勢，其中，水溶性浸出物含量的升高程度達顯著水平(P<0.05)，但醇溶性浸出物含量的升高程度未達到顯著水平(P>0.05)。4次采收水浸出物含量變幅為46.50%～50.67%，變異系數2.63%；醇浸出物含量46.84%～48.84%，變異系數1.40%。5月30日采收的葉茶浸出物含量最低，7月15日采收的葉茶浸出物含量最高(表1)。

表1 不同采收期的黃芪葉茶有效成分

2.5 采收期對膜莢黃芪葉茶總抗氧化活性物質及總浸出物含量的影響

黃酮類、多酚類和多糖類均是在生物體內具有較強抗氧化性的生物活性物質，水溶性和醇溶性浸出物反映出一定的營養成分，膜莢黃芪葉茶所檢測的總抗氧化成分隨采收期延后呈現先增高后下降的趨勢，6月30日采收的葉茶抗氧化活性成分含量最高(29.46%)，較返青期5月30日采摘的葉茶提高13.32%，較6月15日采摘的葉茶提高4.31%，其差異均達到極顯著水平(P<0.01)；較7月15采摘的葉茶提高2.18%，兩者差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

在5月下旬至7月中旬采收，膜莢黃芪葉茶總浸出物含量隨采收時間延后呈持續波動增高的變化趨勢(圖4)。葉片營養成分隨植株個體由營養生長向生殖生長過渡處于持續積累中。7月15日采收的葉茶總浸出物含量最高，較6月30日采摘的葉茶提高1.93%，較6月15日采摘的葉茶提高2.55%，但差異性均未達到顯著水平(P>0.05)；較5月30采摘的葉茶提高4.75%，且兩者差異性達到顯著水平(P<0.05)。

圖4 不同采收期膜莢黃芪葉茶總抗氧化活性成分和總浸出物含量變化動態Fig.4 Dynamic changes of the total antioxidant components and the total extract contents in leaf tea from Astragalus membranaceus harvested at different stages

4次采收的葉茶平均黃酮含量為16.49%，平均多糖含量為51.34%，平均多酚含量為5.23%，平均水浸出物含量為48.83%，95%的置信區間為47.76%～50.67%，平均醇浸出物含量為47.62%，95%的置信區間為47.06%～48.18%，醇溶性浸出物含量更為穩定。

2.6 膜莢黃芪葉茶生物活性成分間的相關與回歸分析

相關分析顯示 (表2)，在測定的5種生物活性成分中，水浸出物和醇浸出物與總黃酮含量相關性均未達顯著水平(P>0.05)，與多酚含量的相關性很弱。多糖含量與水浸出物含量呈極顯著正相關(P<0.01)，與醇浸出物和多酚含量呈正相關，與黃酮含量呈負相關，但相關性均未達顯著水平(P>0.05)。水浸出物與醇浸出物含量與多酚含量分別呈現正相關，但相關性均未達顯著水平(P>0.05)。水浸出物與醇浸出物含量間也呈正相關(P>0.05)(表2)。

表2 膜莢黃芪葉茶生物活性的相關分析

對膜莢黃芪葉茶水浸出物含量與多糖含量的線性回歸分析顯示(圖5)，兩指標呈極顯著直線回歸關系，直線回歸方程為y= 42.487+0.989x(R2=0.818**，P<0.05)，即在一定范圍內，可由水浸出物含量估測多糖含量，估測結果可靠。

圖5 膜莢黃芪葉茶水浸出物含量與多糖含量間的直線回歸分析(n=8)Fig.5 Linear regression between polysaccharide content and water extracts in leaf tea from Astragalus membranaceus harvested at different stages (n=8)

3 討論

3.1 采收期對膜莢黃芪葉茶具有顯著影響，影響程度隨生物活性成分而異

生物活性物質是指生物體內產生且對生命活動具有影響的微量或少量化學成分。浸出物和黃酮是茶葉內含有的重要營養物質，黃酮類和多酚在抗氧化和抗衰老方面具有重要作用，其含量的高低影響著茶葉品質[14,17]。由于植物生長發育階段和生理狀態的不同，造成生物活性成分多糖、黃酮等的轉化和積累量在各器官的分布不同[18]。本研究中，成藥期6月后膜莢黃芪進入旺盛營養生長期，繁茂的枝葉為其葉產品的開發奠定了良好的葉資源基礎，植株生長發育過程中，葉片的大小和健康狀況受外界氣候條件和自身的生理狀態影響較大，7月中旬前膜莢黃芪病蟲為害少，7月下旬至8月中旬盛夏季受外界高溫及干旱脅迫導致植物葉片失水，嚴重影響葉片外觀質量，故本研究在5月下旬至7月中旬分4次采收葉片制成葉茶，通過測定葉茶主要生物活性成分，發現采收期對膜莢黃芪葉茶內在和外在品質均具有很大影響，不同生長期葉茶生物活性成分含量隨采收時間和活性成分的不同而異，多糖和浸出物含量隨采收期延后逐漸增加，黃酮、多糖和多酚含量總計依次為6月30日(29.46%)>7月15日(28.83%)>6月15日(28.25%)>5月30日(26.00%)；水和醇溶性浸出物含量總計依次為7月15日(98.65%)>6月30日(96.78%)>6月15日(96.19%)>5月30日(94.17%)。還可能是隨著日照時數延長，光強增大，氣溫升高，膜莢黃芪進入營養旺盛期，營養物質積累量增大，但7月后溫度的持續升高導致干熱脅迫，使葉功能活性下降，這與田間觀察的結果一致。因此，膜莢黃芪葉茶最佳采收期為6月30日至7月15日。此期采摘茶品質較好、主要生物活性成分含量基本達到最高值。這一現象在甜柿葉茶和苦丁茶等茶產品中均有體現[19-21]。

3.2 膜莢黃芪葉茶具有較多的生物活性成分，活性成分間具有內在關聯

本研究中，分4次采收的膜莢黃芪葉茶中，總黃酮、多糖和多酚含量合計為28.14%，水溶性浸出物平均含量為48.83%，醇溶性浸出物含量穩定性更強，平均含量為47.62%，水和醇溶性浸出物含量均遠高于《藥典》標準(水浸出物不得少于17.0%)。兩種浸出物合計為96.45%，說明膜莢黃芪葉茶含有較多的生物活性成分。在5月30至7月15日分4次采收葉茶的平均黃酮含量為16.49%，較唐文文等[10]對黃芪根的測試結果高出8.70%。另外，平均多糖含量為51.34%，平均多酚含量為5.23%。膜莢黃芪這些活性成分間還具有一定的關聯，浸出物含量高有利于多糖和多酚含量的積累，但不利于黃酮類物質的積累。

4 結論

膜莢黃芪葉茶生物總活性成分隨采收試驗延后逐漸增多，在5月下旬至7月中旬采收總生物活性含量差異不顯著，說明生物活性總含量穩定性較強，但各活性成分含量隨采收期的延后表現出很大的差異性，黃酮含量隨采收期延后呈先極顯著增高后又下降趨勢，6月30日葉茶總黃酮含量最高(17.06%)。多糖和浸出物含量均隨采收期延后呈顯著遞增趨勢，7月15日采收的葉茶多糖含量最高(7.80%)。6月采收的多酚含量保持在穩定高的水平(5.50%～5.65%)。這些生物活性成分間具有一定的內在關聯，浸出物含量與多糖含量呈直線回歸關系(y=42.487+0.989x(R2=0.818**，P<0.05)，兩者呈極顯著正相關(R2= 0.905**，P<0.05)。以上結果表明膜莢黃芪綠葉期長，更適宜葉茶的開發。綜合考慮各生物活性，以6月30日至7月15日為最佳采收期。