豐富環境對腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能和缺血半暗帶區葡萄糖代謝的影響

周文美，陶陶，吳霜，王廷龍，楊正奕，張瑩

1.貴州醫科大學附屬醫院康復醫學科，貴州貴陽市 550001；2.貴州省人民醫院康復醫學科，貴州貴陽市 550002；3.貴州醫科大學附屬人民醫院康復醫學科，貴州貴陽市 550002；4.貴州省食品藥品檢驗所，貴州貴陽市550004

缺血性腦卒中通常由栓塞或血栓性動脈阻塞引起，導致腦血流量減少，引起缺氧和目標腦區域葡萄糖供應中斷，細胞出現能量代謝減慢、壞死和凋亡[1]。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)是缺血性腦卒中的繼發損傷，由于側支循環建立，在缺血中心區周圍的半暗帶，細胞仍可維持部分代謝活力[2]。防止缺血半暗帶區演變為梗死區，恢復神經細胞活性，是缺血性腦卒中治療研究的熱點。

豐富環境是一種非侵入性干預方法，它依賴于自愿的身體活動、無壓力的調節、社會互動和對新刺激的引入，已被證實可以促進腦缺血后神經發生和功能恢復[3]。缺氧誘導因子?1α (hypoxia inducible factor?1α,HIF?1α)是機體缺血缺氧時觸發內源性保護機制的始動因子和共同途徑，能通過調控下游葡萄糖轉運蛋白?1(glucose transporter 1,GLUT1)和6?磷酸果糖?2?激酶/果糖?2,6?雙磷酸酶3 (6?phosphofructo?2?kinase/fruc?tose?2,6?bisphosphatase?3,PFKFB3)的表達，改善葡萄糖代謝[4?6]。豐富環境可上調CIRI 大鼠腦組織HIF?1α表達，參與大腦神經功能保護[7?8]。

本研究觀察豐富環境對大鼠CIRI模型神經功能的療效，觀察腦組織病理結構改變，檢測缺血半暗帶區ATP、ADP 和AMP 含量，以 及HIF?1α 及其下游GLUT1、PFKFB3 mRNA 和蛋白的表達，探討豐富環境對CIRI大鼠的腦保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF 級成年雄性Sprague?Dawley 大鼠72 只，體質量240～260 g，購于貴州醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產批準號SCXK(黔)2018?0001。本實驗在貴州醫科大學分子生物學重點實驗室和貴州省食品藥品檢驗所進行，所涉及的動物操作嚴格遵循動物倫理學的相關規定和準則。

采用隨機數字表法，分為假手術組、模型組和豐富環境組，各24只。

1.2 主要試劑與儀器

HIF?1α 兔多克隆抗體、β?actin 兔多克隆抗體：博奧森公司。PFKFB3 兔單克隆抗體：ABCAM 公司。GLUT1兔多克隆抗體：PROTEINTECH公司。PCR逆轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒：TAKA?RA 公司。線栓：北京西濃科技有限公司。ATP 標準品(93.0%)、ADP 標準品(85.3%)、AMP 標準品(92.7%)：中國食品藥品檢定研究院。山羊抗兔抗體：THERMO FISHER公司。

LC?20AT 高效液相色譜儀：日本島津公司。實時熒光定量PCR 儀：美國ABI 公司。ND2000 型超微量紫外分光光度計：美國THERMO FISHER公司。所有引物均由上海生工設計和合成。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立[9]

大鼠術前禁食12 h。大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸正中切口，分離右側頸外、頸總和頸內動脈，依次結扎頸外和頸總動脈近心端，微動脈夾暫時夾閉頸內動脈。經頸總動脈近分叉處剪口，將直徑約0.26 mm 的線栓(前端燒熔成半球形，18 mm處有標記)插入頸內動脈，至感受到輕微阻力，插入深度(距頸總動脈分叉口)約18.0 mm。60 min后，緩慢退出線栓。

假手術組大鼠行相同手術步驟，但不插入線栓。

術后24 h 采用改良神經損害嚴重程度評分(modi?fied Neurological Severity Scores,mNSS)[10]進行神經功能評估。取7～12分大鼠進行后續實驗，不合格大鼠剔除，按隨機抽樣原則抽取備用大鼠補齊。

1.3.2 豐富環境和標準環境設置[11]

豐富環境組于造模后立即飼養在豐富環境中。85×50×75 cm 金屬網格籠，籠內有爬梯、鏈條、不同形狀管道、色塊、積木、球類和跑輪等玩具，每3 天重新布置環境1 次；每天持續播放舒緩音樂及多色光照射2 h，每籠飼養6只。

假手術組和模型組均飼養在標準環境中。25×15×20 cm 塑料籠，籠內僅放置墊料，每籠飼養2 只大鼠。所有動物籠內飼料、墊料和水均一致，12 h 明暗循環條件，共飼養28 d。

1.3.3 mNSS

于造模前(0 d)及造模后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d，每組各取8只大鼠由一名不了解實驗分組的研究者對各組大鼠行mNSS評定。評分越高，損傷越嚴重。

1.3.4 取材

各組于造模后1 d、28 d，行mNSS 評定后，10%水合氯醛3.5 ml/kg 腹腔注射麻醉后，斷頭處死大鼠，冰板上快速取出腦組織，預冷PBS 緩沖液洗凈，切取缺血半暗帶區腦組織[12]，假手術組取對應部位，液氮速凍6 min 后，-80 ℃冰箱保存，用于mRNA、蛋白，以及ATP、ADP、AMP 檢測。剩余腦組織4%多聚甲醛固定，用于HE染色。

1.3.5 HE染色

各組取3 只，腦組織4%多聚甲醛液固定24 h 以上，石蠟包埋，切片厚4 μm，常規HE 染色，光學顯微鏡下觀察病理改變。

1.3.6 逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應(reverse transcrip?tion real?time quantitative polymerase chain reaction,RT?qPCR)

各組取6只大鼠腦缺血半暗帶區組織，Trizol溶液提取總RNA，紫外分光光度計測定濃度和純度，將RNA 逆轉錄成cDNA，用SYBR Green 試劑盒進行實時熒光定量多聚酶鏈式反應，計算2-ΔΔCt值。引物序列如下。

HIF?1α：上游5'?AGA GTG GTA CTC ACA GTC GG?3'；下游5'?CCC TGC AGT AGG TTT CTG CT?3'。

GLUT1：上游5'?AGA GTC CAT CCC ATC CAC CA?3'；下游5'?CCT GCC AAA GCG ATT AAC AA?3'。

PFKFB3：上游5'?ATT GAA TAT GCC GTC TCC?3'；下游5'?CAC AAG ATA CAC ACA TGG?3'。

β?actin：上 游5'?ATT TGG CAC CAC ACT TTC TAC?3'；下 游5'?ATC TGG GTC ATC TTT TCA CGG?3'。

1.3.7 Western blotting

各組6 只大鼠腦缺血半暗帶區組織，充分研磨成勻漿，離心取上清液，紫外分光光度計下測量蛋白濃度。10%SDS?PAGE 電泳分離，轉膜2 h 后，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入HIF?1α(1∶1000)、GLUT1(1∶1000)、PFKFB3(1∶3000)和β?actin(1∶5000)一抗，4 ℃搖床孵育過夜，次日洗膜后加二抗(羊抗兔IgG，1∶3000)室溫孵育1 h，滴加ECL 液顯色。以β?actin為內參，利用Image J 軟件分析各條帶相對灰度值，測量3次，取均值。

1.3.8 高效液相色譜法

各組取3 只，稱取缺血半暗帶區腦組織500 mg，冰上用0.4 mol/L HCLO4制成10%勻漿。超聲粉碎后，低溫離心取上清液。加3 mol/L K2CO30.1 ml中和，離心、過濾后制成試品溶液，-80 ℃儲存。

采用高效液相色譜法測定ATP、ADP、AMP 含量。色譜條件：Waters Bridge R C18 反相色譜柱(4.6×150 mm,5 μm)。流動相：0.2 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉35.8 g、磷酸二氫鉀13.6 g、四丁基溴化氨1.61 g)，95%甲醇搖勻。檢測波長259 nm，流速1.0 ml/min，柱溫20 ℃，進樣量10 μl。

精密稱取標準ATP 10.18 mg，ADP 10.87 mg，AMP 10.07 mg，超純水溶解，稀釋后ATP、ADP、AMP 的濃度分別為48.37 μg/ml、46.36 μg/ml、46.67 μg/ml。梯度稀釋(2、2.5、5、10、50、100 倍)，取各濃度梯度對照品溶液10 μl 進樣，得到標準曲線，計算樣本ATP、AMP、ADP濃度，并進一步計算能量負荷(energy charge,EC)[13]。

每個樣本進樣3次。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以()表示，多組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 mNSS

各組造模前及假手術組各時間點mNSS 評分均為0，行為無異常；造模后1 d，模型組和豐富環境組均出現行走時向一側傾倒或轉圈，感覺、平衡異常等神經功能缺失癥狀，mNSS 評分高于假手術組(P ＜0.05)；術后14 d 開始，豐富環境組mNSS 評分較模型組降低(P ＜0.05)。見表1。

表1 各組各時間點mNSS比較

2.2 HE染色

假手術組腦組織結構清晰，神經細胞規則排列，胞核居中，胞核胞質染色均勻一致。術后1 d，模型組和豐富環境組腦組織出現明顯梗死區，可見細胞水腫，神經元脫失或出現核固縮邊緣化、核仁消失，組織疏松呈空泡樣排列和拉網狀改變。術后28 d，模型組和豐富環境組水腫、神經元脫失、核固縮、空泡等病理改變減少，豐富環境組細胞水腫等病理改變較模型組改善。見圖1。

圖1 各組腦病理改變(HE染色，bar=50 μm)

2.3 RT?qPCR

術后1 d，模型組和豐富環境組HIF?1α、GLUT1和PFKFB3 mRNA 均較假手術組增高(P＜0.05)，但兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。術后28 d，模型組和豐富環境組HIF?1α、GLUT1 和PFKFB3 mRNA 表達雖有下降，但仍高于假手術組(P＜0.05)，豐富環境組各mRNA表達高于模型組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組HIF-1α、GLUT1和PFKFB3 mRNA表達(2-ΔΔCt)

2.4 Western blotting

術后1 d，模型組和豐富環境組HIF?1α、GLUT1和PFKFB3 蛋白量均較假手術組增高(P＜0.05)，但兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。術后28 d，模型組與豐富環境組HIF?1α、GLUT1和PFKFB3蛋白量降低，但仍高于假手術組(P＜0.05)；豐富環境組各蛋白量高于模型組(P＜0.05)。見圖2、表3。

圖2 各組HIF-1α、PFKFB3和GLUT1蛋白表達(Western blotting)

表3 各組HIF-1α、PFKFB3和GLUT1蛋白表達(/β?actin)

2.5 高效液相色譜法

出峰次序依次為AMP、ADP 和ATP，保留時間分別為7.928 min、8.944 min 和13.438 min，與腦組織雜質峰分離良好。見圖3。

圖3 高效液相色譜法分離ATP、ADP和AMP色譜圖

術后1 d，與假手術組相比，模型組、豐富環境組ATP、ADP 和EC 下降，AMP 上升(P ＜0.05)；術后28 d，模型組、豐富環境組ATP 和EC 低于假手術組(P ＜0.05)，但豐富環境組高于模型組(P ＜0.05)。見表4。

表4 各組ATP、ADP、AMP和EC變化

3 討論

CIRI 會加重腦組織損傷和神經功能障礙[14]。腦缺血后神經功能恢復除受到生理、病理因素影響外，還與環境因素密切相關[15]。

豐富環境通過配備各種有康復作用的玩具，提供溫馨的生活環境，給予研究對象感覺、運動、社會交往等方面的綜合刺激，發揮神經保護作用[16?17]。神經功能依賴于腦組織能量代謝，而能量代謝障礙在腦組織器質性病變發生之前就已經出現[18]。長期豐富環境干預可通過增強突觸活動、調節神經炎癥反應等方式，恢復缺血后能量代謝紊亂，發揮神經保護作用[19?20]。

腦的能量代謝狀況可通過ATP 的變化觀察。在腦缺血模型中，ATP 從缺血核心區到缺血半暗帶區呈增加趨勢，細胞也表現出從壞死向凋亡的轉變[21]。本研究顯示，豐富環境干預28 d 后，缺血半暗帶區腦組織ATP 較模型組增高，反映細胞能量狀態的EC 進一步增大；同時，神經功能改善，缺血半暗帶組織病理改變減輕。

Amaral 等[22]發現，腦缺血缺氧后，糖酵解成為腦組織的主要能量來源，缺氧細胞傾向于消耗更多葡萄糖滿足能量需求。葡萄糖轉運的關鍵蛋白GLUT1 表達增高代表這種適應性轉變[23?24]。PFKFB3有很強的凈激酶活性，抑制PFKFB3 導致糖酵解減少，其介導的葡萄糖代謝是神經保護的重要靶點[25]。本研究顯示，豐富環境干預后，GLUT1、PFKFB3 表達上調，提示豐富環境可能增加葡萄糖轉運和糖酵解速度，改善能量供應，從而發揮神經保護作用。

HIF?1α 可改善缺血后神經元存活，促進神經功能恢復[26?27]。本研究顯示，腦缺血后，缺血半暗帶區HIF?1α表達立即增加，豐富環境干預后，HIF?1α表達較模型組增高。與以前的研究相符[7?8]。組織缺氧時，HIF?1α主要通過與其下游低氧反應元件結合，介導相應蛋白產物表達，激活機體應對缺血缺氧引起的病理性損傷[5]。HIF?1α激活后，上調GLUT1表達，為糖酵解途徑補充葡萄糖[28]。在PFKFB3基因增強子區域中含有2 個拷貝的HIF?1α 結合基序(5'?ACGTG?3')[29]，在缺氧條件下通過HIF?1α 介導PFKFB3 表達上調[30]，進而增強糖酵解途徑，提高細胞對缺氧的耐受。本研究顯示，豐富環境干預后，缺血半暗帶區HIF?1α、GLUT1、PFKFB3 的mRNA 與蛋白表達趨勢一致，推測豐富環境可能通過上調HIF?1α 的表達，上調GLUT1 和PFKFB3 的表達，改善缺血區葡萄糖代謝，促進神經元的存活。

綜上所述，豐富環境可促進CIRI大鼠神經功能恢復，其機制之一可能通過上調腦缺血半暗帶區HIF?1α及其下游GLUT1、PFKFB3 的表達，提高葡萄糖轉運和糖酵解速度，調節腦損傷后能量穩態，從而改善其神經功能。進一步可通過敲除或過表達HIF?1α 基因，來檢測GLUT1、PFKFB3 表達水平，明確豐富環境對HIF?1α以及GLUT1、PFKFB3的調控關系。

豐富環境作為一種輔助手段，對腦卒中患者神經功能，特別是認知功能和日常生活能力有促進作用[31]，有良好的應用前景。但臨床豐富環境的設置及干預時間、強度等問題還需要進一步深入研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。