豬腸道細菌培養組學研究進展

周夢情，陳從英

(江西農業大學 豬遺傳改良與養殖技術國家重點實驗室，南昌 330045)

養豬業在我國國民經濟中占有非常重要的地位，為人們提供了主要的肉食種類。同時，豬也是研究人類生理功能和疾病的重要模型動物[1]，與人體健康聯系較緊密。豬的重要經濟性狀受到其腸道微生物組成、結構和功能的影響。因此，豬腸道菌群是近年來的研究熱點領域之一。豬腸道細菌培養組學的研究也越來越重要，主要原因是：1)細菌16S rRNA基因測序技術能以極低的成本對豬腸道菌群進行分析，但只能精確到細菌屬及屬以上分類水平，對于種或種以下水平的分類難以確認[2]。對于微生物群落的研究，只分類到屬是遠不夠的。2)1998年 開始的宏基因組分析包含了可培養與未培養的微生物。宏基因組研究揭示了腸道菌群的多樣性，但其難以區分豐度較低的菌株[3]。通過宏基因組可發現人體腸道中大量未培養菌株信息(約70%)[4]。宏基因組物種鑒定依賴已知數據庫信息，但還有大量物種無法鑒定；許多樣品中的優勢物種目前并不存在已培養的參考菌株，再加上技術方面的問題，這些都在影響著宏基因組的發展。3)通過分離培養出優勢物種的代表菌株，可通過測序得到其基因組信息，研究該菌株的功能以及用無菌小鼠進行功能驗證，可擴大對人類或其他哺乳動物腸道微生物組成和多樣性的認識，證實腸道菌群與宿主表型性狀的因果關系，研究其作用機制等[5]。

使用培養組學對豬腸道菌群進行研究，將對豬腸道菌群組成及功能有更全面的了解，可為研究菌群與宿主基因互作提供生物材料。本文主要從豬腸道菌群組成結構、培養組學發展、豬腸道細菌培養組學的研究現狀等方面進行綜述。

1 豬腸道菌群的組成和結構

豬腸道菌群是指所有定殖在豬腸道里的大量細菌、病毒、真菌和古菌等構成的集合。而細菌占絕大部分比例，是目前研究重點之一。仔豬是否在出生前就存在腸道菌群有一定爭議，對于出生前母豬子宮中是否有菌也還不確定[6]，一般認為仔豬是出生后通過與外界環境、母體產道和乳汁以及糞便的接觸從而獲得菌群并開始在腸道定殖[7]。豬腸道菌群從需氧菌、兼性厭氧菌再到厭氧菌進行定殖[8]。豬腸道菌群組成受多種因素影響，如宿主遺傳[9]、性別[10]、年齡以及日糧[8]等。成年豬腸道總表面積約在1 000 m2，腸道內大約有30個屬的400～600種細菌，數量達1014個，是體細胞數的10倍[11]，分布于腸道的各個部位。健康哺乳動物體內存在著500～1 000 余種細菌和其他微生物種類[12]，與營養物質代謝[13]、宿主免疫[14]和代謝綜合征[15]等都緊密相關。其能消化分解碳水化合物[16]、合成B族維生素[17-19]、產生短鏈脂肪酸[20]等物質。在健康狀態下，小腸(十二指腸、空腸和回腸)內只含有少量細菌，盲腸和結腸中細菌數量最多[11]。

豬腸道菌群主要由厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌組成，其中，以厭氧菌為主，約占99%；少部分為兼性厭氧菌或需氧菌[21]。從分類水平上看，豬腸道菌群的組成和結構可通過門、綱、目、科、屬、種分類水平上菌群的種類和豐度反映。總體來看，豬腸道菌群主要是由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和螺旋菌門(Spirochaetes)五個門的細菌組成[22]。其中，厚壁菌門和擬桿菌門是最具優勢的兩大門。與之前報道的人類腸道菌群組成類似[12]。Patil等[23]研究發現，不同腸道部位的菌群組成有很大差異,十二指腸主要由厚壁菌門(90%)主導；空腸和回腸主要是厚壁菌門和變形菌門主導；盲腸中厚壁菌門(>75%)占主導地位；結腸中的菌群多樣性最高，包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和螺旋菌門。Han等[24]分析了不同日齡豬腸道菌群組成情況，發現其組成差異顯著。綜合以上研究結果可知，豬腸道菌群組成在水平結構和垂直結構上都存在顯著差異。

Ramayo-Caldas等[25]研究發現，豬腸道菌群組成的腸型分類與其體重和平均日增重顯著相關。Hu等[5]采用FMT(糞菌移植)發現，仔豬斷奶后腹瀉與腸道菌群相關。豬的腸道菌群是高度復雜但相對穩定的，在某些情況下，這種穩定被打破，可引起菌群紊亂，導致疾病發生和豬生產性狀等的改變。

2 培養組學發展

微生物學發展已進入第三個黃金時期。第一個黃金時期主要是傳統微生物分離培養，揭示了大量微生物以及發現了益生菌；第二個黃金時期主要是揭示細菌遺傳基礎；第三個黃金時期主要是揭示人體微生物組與健康的密切聯系。組學技術的出現，如16S rRNA 基因測序、宏基因組、宏轉錄組和宏蛋白質組等組學分析技術提供了間接了解微生物組的手段。微生物學研究中，培養技術顯得十分重要。傳統分離培養，受技術和條件限制，大多數的微生物仍未培養成功。但研究微生物與疾病或者與宿主表型的關系時，還需微生物活體，于是培養組學技術得到了快速發展。

近年來，腸道菌群研究大都圍繞細菌展開。相對于細菌，真菌、病毒和古菌等微生物研究略少。培養法是分離細菌所用的最古老的技術。2012年，培養組學由Lagier等[26]提出，是一種通過改善培養條件培養細菌的方法。該方法除了通過改善培養條件盡可能模擬細菌原始生存環境外，還通過結合基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜 (MALDI-TOF MS)和16S rRNA基因測序等技術對分離得到的菌株進行鑒定。培養組學技術是了解特定菌或菌群在宿主中作用的關鍵，獲得的菌株可從機制上深入研究腸道菌群塑造、功能、新陳代謝和炎癥等。

2.1 培養組學中的細菌分離、鑒定和培養技術

2.1.1 細菌分離技術 目前，改良培養基組分、培養條件優化、共培養和微流控液滴培養等是腸道菌群的主要分離技術。相對于傳統分離技術，這些技術可擴大腸道可培養細菌的范圍。

改良培養基組分和培養條件優化可以大幅度改善腸道菌群的培養情況，改良培養基組分即添加短肽類物質、微量元素和信號分子等，培養條件優化則是改變培養溫度、pH及時間等，均可提高未培養細菌的可培養性。研究表明，YCFA培養基能提供70%人類腸道微生物生長所需的營養物質，因此，將YCFA培養基與選擇性培養技術結合起來可以進行靶向細菌分離[27]。Li等[28]通過在厭氧培養基中添加十八碳烯酸(TVA)發現，培養的菌群大部分屬于未培養的瘤胃菌群。Zou等[29]基于腸道細菌的特性篩選出11種培養基，并涂布0.1%半胱氨酸，增加了腸道細菌的可培養性。在腸道菌群中，微生物間的互作對于菌群生存相當重要。共培養是一種培養兼性和互養微生物的有效方法[30]。來自同一腸道環境的微生物往往具有協同作用，Nichols等[31]發現，輔助菌株MSC105可對未培養細菌MSC33的生長起誘導作用。微流控液滴培養是在微觀條件下對流體進行精確控制，利用微流控可以模擬腸道中存在的微結構，充分挖掘菌群的功能。Jalili-Firoozinezhad等[32]通過構建雙通道微流控裝置，制備出一種厭氧腸道芯片，將從人類糞便中分離出的復雜腸道微生物樣本培養數天，可培養出200多種不同的細菌，其豐度和比例與在人類糞便中觀察到的相似。

改良培養基組分、培養條件優化、共培養和微流控液滴培養等具有代表性的細菌分離技術在近幾年得到了快速發展。每種技術都有其優勢，必要時可進行多種分離技術聯用，多角度對未培養細菌進行分離。

2.1.2 鑒定技術 傳統的菌株鑒定方法操作繁瑣且較為耗時，準確性較差。目前，基于基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)和16S rRNA基因測序是培養組學菌株鑒定中最常用的技術。MALDI-TOF MS是一種基于細菌表面蛋白分子量的快速菌株鑒定技術。通過測定細菌特異性的蛋白質組成，采用質譜技術將測定得到的蛋白質和多肽按分子量大小排列，形成蛋白質組指紋圖，通過特征模式峰進行菌株鑒定[33]。與傳統菌株鑒定方法相比，MALDI-TOF MS檢測速度快，靈敏度高，準確率較高。Seng等[34]分析其11年臨床微生物鑒定經驗發現，MALDI-TOF MS同時具備時效性高與成本低的特點。得益于現有菌株數據庫的相對完善，現階段，MALDI-TOF MS已經能夠鑒定出大部分菌株[35]，包括臨床常見厭氧菌，即使一些生化反應相似、不易區分的厭氧菌也可進行區分。MALDI-TOF MS 技術操作簡單，鑒定準確、快速且可高通量進行菌株鑒定,可作為豬腸道菌株鑒定及篩選的重要輔助工具。

16S rRNA基因測序是一種通用的利用細菌16S rRNA序列測序進行細菌物種鑒定方法。16S rRNA是核糖體RNA的一個亞基，16S rRNA基因為編碼該亞基的基因，長度約1 542 bp。16S rRNA基因序列包括9個可變區和10個保守區，保守區序列是所有細菌共有，可反映物種間的親緣關系，而可變區序列則能體現物種間的差異。不同細菌之間16S rRNA基因的可變區顯著不同，對菌株進行全長16S rRNA基因測序可對所有可變區進行比較。由于Illumina測序(二代測序)所產生的單條read長度在75～300 bp間，目前，16S rRNA基因全長序列是通過sanger測序(一代測序)獲得。Johnson等[36]對16S rRNA基因進行PacBio CCS測序(三代測序)發現，三代測序16S rRNA基因全長在種屬鑒定上的多樣性比二代測序更豐富，提高了種屬鑒定的分辨率和準確度。

目前，MALDI-TOF MS和16S rRNA基因測序這兩種鑒定技術已獲得普遍認可。但由于16S rRNA基因測序成本高和耗時長等原因，大部分研究都會優先選擇MALDI-TOF MS這種經濟有效且快速的菌株鑒定方法。

2.1.3 培養技術 微生物培養技術包括需氧培養、二氧化碳培養、微需氧培養和厭氧培養。根據不同的樣品及不同的培養目的，可選用不同的培養技術。

需氧培養是將分離出的少量細菌轉移到培養基中，置于適宜溫度的培養箱中，無特殊要求的細菌均可生長。Sangwan等[37]從環境中分離出一種細菌ChthoniobacterflavusEllin428，該菌株為好氧異養，在多種生物培養基上都生長良好。二氧化碳培養是某些細菌嗜二氧化碳，只在高濃度的二氧化碳環境中生長或生長得更好。James-Holmquest等[38]研究表明，Neisseriagonorrhoeae菌株需在二氧化碳環境中生長，且濃度越高越適宜。微需氧培養是在含有5%～6%氧氣、5%～10%二氧化碳和85%氮氣的氣體環境中，將微需氧菌接種到培養基上，35 ℃進行培養。微需氧菌如彎曲菌屬等在大氣和絕對無氧環境中不能存活。Hansen等[39]對100名兒童的結腸活檢組織進行微需氧培養，得到129株革蘭陰性微需氧菌，大多為彎曲菌屬和螺桿菌屬。厭氧培養是厭氧菌對氧敏感，培養過程中需無氧環境的一種培養技術，適用于專性厭氧菌與兼性厭氧菌。Browne等[40]使用厭氧培養從健康人腸道中分離出137種菌，這些菌都屬于新的菌種，該研究表明，相當大比例的腸道細菌是可培養的。

哺乳動物腸道中蘊藏著巨量的微生物。腸道菌群細胞總量約1014個，其中99%是厭氧細菌，絕大部分需進行厭氧培養。目前,在公共數據庫中具有完整基因組序列信息的細菌和古菌已超過20萬個，相當高比例的細菌還未被分離培養[41]。KOMODO數據庫的出現為解決該問題提供了重要工具，這個數據庫有來自18 049種不同微生物和3 335個培養基配方的信息，能基于細菌或古菌16S rRNA基因序列來預測其菌生長所需的合適培養基配方[42]，該數據庫對豬腸道細菌培養組學具有十分重要的意義。對于培養組學，除了分離和培養條件的多樣化，還使用各種高通量測序技術鑒定(圖1)，即培養組學是一種高通量的培養方法。

圖1 培養組學工作流程Fig.1 The workflow of culturomics

2.2 細菌培養組學技術進展

目前，培養組學已獲得廣泛關注并取得顯著成就，但其研究主要集中于人體腸道菌群的培養。在培養組學之前，已培養的14 300種原核生物中有2 172種 (15%)是從人體中分離，另外12 128種(85%)則是從環境中分離得到[43]。自培養組學發展至今，與人體相關且已分離培養的微生物數量增加到了2 671種[44]。

已有研究表明，使用培養組學得到的人體腸道微生物的多樣性高于根據基因組分析預測的多樣性[43,45]。Lagier等[46]對糞便樣本開展培養組學研究時，將212種培養條件總結優化為18種最佳培養條件，可把腸道中70%的微生物分離培養，共鑒定出1 057種微生物種類，其中，531種屬于人體腸道菌群，豐富了人類腸道菌群中可培養細菌的種類。Pfleiderer等[47]首次在神經性厭食癥患者糞便樣本中開展培養組學研究，共使用88種培養條件，得到12 700個 不同菌落，鑒定到4個門中133種細菌。并且存在之前從未從人類腸道中分離出的19種細菌，有11種經基因組測序鑒定為新的細菌種類。腸道中厭氧微生物占比極高，由于需要創建、維持厭氧環境以及厭氧菌生長較緩慢等諸多原因，厭氧微生物培養非常耗時[48]。在培養基中添加抗氧化劑可使嚴格厭氧微生物在有氧環境下成功培養[49]。Park和Yu[50]將半胱氨酸、谷胱甘肽、抗壞血酸、尿酸和α-酮戊二酸一起添加到培養基中時，可使620種(共測試623個菌株)菌株生長，包括兼性厭氧細菌(154種)、嚴格厭氧菌(82種)以及真菌和產甲烷菌。培養組學為細菌的分離鑒定提供了較全面的培養條件，Lagier等[51]通過對培養條件分析表明，在血培養瓶中進行預培養，分離得到的菌株中56%為新物種；在培養液中添加經過過濾滅菌的瘤胃液，可以得到40%的新物種；添加5%的綿羊血，分離得到的菌株中25%為新物種。

16S rRNA基因測序或宏基因組測序，都極大豐富了腸道微生物組數據庫。測序技術與培養組學之間是互補的，Hamad等[52]利用培養組學方法，從14份糞便樣本中分離出17 800個真菌菌落，經ITS1與ITS2擴增子測序得到的腸道真菌群落信息與培養組學存在較大差異，兩者對糞便真菌多樣性的分析形成了互補。此互補不僅存在于腸道真菌研究中，也存在于腸道細菌研究中。Zou等[29]利用11種培養基大規模分離培養155個健康人糞便樣本，共獲得6 487個 菌落，經測序得到1 520個高質量的人體微生物細菌基因組，定義為可培養參考基因組(culturable genome reference，CGR)。與之前報道的1 000種人體胃腸道細菌的測序結果相比，超過80種細菌是新發現的。1 520個基因組覆蓋人體內所有主要細菌門和屬，其中，264個基因組在現有的參考基因組中未發現。細菌參考基因組數量的增加可提高宏基因組測序數據的利用率(從50%提高到70%)，使人類微生物群的分辨率更高。

Gouba等[53]從健康人糞便樣品中分離出腸球菌科的一個新種Enterococcus burkinafasonensis sp.nov.中的菌株Marseille-Q0835T，并對其表型特征進行描述，更新了人類菌株庫。Amadou等[54]從一名肥胖患者糞便樣品中分離出新的細菌Lachnoclostridiumbouchesdurhonense，該菌可在含有5%綿羊血的哥倫比亞瓊脂上進行培養。隨著培養組學技術的不斷優化，越來越多的細菌可從腸道中分離出，將此前在腸道中從未分離的菌種成功培養。雖存在工作量大、菌株測序步驟較為繁瑣和培養條件苛刻等不足，但技術與方法的不斷創新有助于培養組學的發展。實體菌株的獲得為人體微生物組相關研究如株水平的研究，細菌、病毒和真菌的培養，生物信息分析技術優化等奠定了基礎。也是微生物產物轉化如活菌藥物庫、精準醫療的物質基礎。

3 培養組學在豬腸道菌群研究中的利用現狀

豬腸道細菌的培養是豬腸道菌群研究的重要內容之一，利用培養組學分離鑒定豬腸道菌群中未分離的菌株，通過MALDI-TOF MS或16S rRNA基因測序分析、全基因組測序和注釋以及主要表型特征描述等方法，可鑒定新物種及其基因組，并對其在豬腸道菌群中的作用進行深入研究[55]。但目前，由于豬培養組學數據相對不足，了解相關微生物物種間的相互作用局限性較大[56]。為充分了解豬腸道微生態系統是如何工作的，以及研究腸道菌群與宿主相互作用關系，腸道中未分離菌株的分離培養十分重要，培養組學也已成為豬腸道微生態研究中的重要支撐技術之一。

目前，培養組學研究大多集中在人體腸道細菌培養[46]，而對豬腸道培養組學的研究較少。腸道培養組學可將此前從未在豬腸道中被分離培養的菌株成功培養。豬腸道中的某些菌(如產甲烷菌)使用傳統方法難以分離和培養；使用培養組學方法可從豬糞便樣本中分離出甲型甲烷弧菌[57]。Stanley等[58]應用分離培養的方法，從豬結腸黏膜中分離出一種梭狀芽胞桿菌和兩種擬桿菌菌株，并表明，這3株細菌顯著水解黏蛋白。Li等[59]應用培養組學方法從野豬腸道中分離培養得到156株乳酸菌，且其中5株乳酸菌菌株具有益生菌性質，可作為候選益生菌或是飼料添加劑。同樣，Betancur 等[60]從哥倫比亞克里奧爾豬糞便中分離出3株植物乳桿菌菌株，并確定其具有抗菌活性，可抑制潛在的致病微生物。張錦華等[61]從豬腸道各個區段中共分離出2 317株腸道細菌，通過鑒定其中兩株菌為枯草芽孢桿菌，為產蛋白或是多肽類抗生素的活性菌株。Xu等[62]從健康母豬的新鮮糞便分離出LactobacillusreuteriYSJL-12，對其進行了全基因組測序，飼料中添加LactobacillusreuteriYSJL-12喂養斷奶仔豬和育肥豬，可預防豬的腹瀉，提高飼料轉化率，增強仔豬抗病能力，促進仔豬生長。也有研究報道，使用培養組學從豬糞便樣本中獲得的寇氏普氏菌(Prevotellacopri)，可影響豬肌肉生長及脂肪沉積等性狀，這為進一步研究豬腸道菌群與重要經濟性狀關系提供了參考[63]。

隨著培養組學的繼續發展，豬腸道中的微生物會被逐漸分離，直接引起宿主表型變化和疾病發生的因果菌株也會被鑒別。

4 展 望

4.1 腸道部位多樣性有助于培養組學發展

目前為止，豬腸道菌群的復雜性和多樣性尚未得到深入探索，培養組學的出現可為菌群研究提供新思路。在人體腸道菌群培養組學研究中,僅糞便樣本中就可發現較多新菌種。但采用糞便菌群代表腸道菌群是存在一定偏離的，理想情況應是進行全腸道菌群檢測。對于豬腸道菌群，不同腸道部位(如盲腸、結腸)樣本可分離培養出更多新菌種。豬作為大動物的一種，相對于人來說，易進行單一因素研究。因此，豬腸道菌群培養組學研究潛力巨大。

4.2 細菌基因組信息有助于培養組學發展

微生物組學研究中，已有參考基因組的微生物數量遠低于自然界存在的微生物數量。可用三代測序結合二代測序對樣品進行單菌基因組組裝，二代測序數據可對三代測序數據結果進行校正；同時，三代測序數據可以進行參考基因組優化，獲得完整的細菌基因組信息。現階段已分離的細菌約為15 000種，絕大多數微生物還未進行分離培養，原因之一是不了解不同微生物培養條件(尤其是培養基配方)。KOMODO數據庫可利用菌株的基因組信息來提示培養基的選擇或培養基中營養物質的添加，實現目標菌株的分離培養。

4.3 培養組學不足與應用前景

目前，培養組學為新型菌群研究技術，但限制因素依然存在。

4.3.1 菌株鑒定效率低 培養組學技術可以得到大量不可能培養或難于培養的菌株，但存在某些高通量測序技術難以鑒定的菌株。菌株鑒定效率低且成本高是限制因素之一。但隨著MALDI-TOF MS 技術和高通量測序技術的不斷發展，該限制因素正在不斷解決中。

4.3.2 培養基成分和生長條件不全面 大多數腸道中的細菌不會在標準培養基中生長，且任何細菌的生長都需要營養和適宜的大氣環境。不同培養條件下，細菌生長會有明顯差異。目前，已出現可控制pH、培養溫度和氧氣濃度的培養箱，但某些細菌需要的特殊營養物質需要不斷進行摸索。簡化培養步驟，發展新的培養技術是改善培養組學的一個新方向。

4.3.3 培養組學應用前景 培養組學研究獲得的實體菌株，在機制研究和精準醫療方面應用前景廣闊。但培養組學相對來說是一個較新的研究技術，培養基的設計以及培養條件的多樣化都需要重視。目前，對于豬腸道菌群的認識還處于初級階段，宏基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學和免疫組學等單個組學可獲得腸道菌群的局部信息。但隨著培養組學技術、高通量測序技術及多組學的發展，豬腸道菌群領域的神秘將逐漸被揭示，對于腸道菌群結構和功能的理解也將更加深入。

致謝

感謝黃路生院士對本論文的精心指導！