金黃色葡萄球菌表面蛋白A對奶牛乳腺上皮細胞的黏附作用

張金檸,錢夢櫻,唐永杰,米思遠,師科榮,俞 英*

(1.中國農業大學動物科技學院，北京 100193；2.山東農業大學動物科學技術學院，泰安 271018)

金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)是奶牛乳腺炎常見和主要的致病菌之一，屬于機會性環境致病菌，感染率較其他致病菌更高且存在多種表面致病因子[1-3]，這些表面致病因子通常能夠誘發免疫反應，是疫苗研發的關鍵[4-6]。其中，細胞壁錨定表面蛋白作為黏附素，在金葡菌的黏附過程中發揮重要作用。目前已知金葡菌能表達24種不同的細胞壁錨定表面蛋白[7]。與肽聚糖連接的表面蛋白前體經加工后從細菌生物被膜中釋放出來，擴散到宿主組織中協助金葡菌定植[8-9]，金葡菌能同時產生包括溶細胞毒素在內的多種外毒素，導致宿主體內強烈的炎癥反應，引發奶牛乳腺炎，對奶牛養殖行業造成極大的影響[10]。

不同種的細菌黏附素種類存在差異，其中，絲氨酸富集重復蛋白 (SRRP)是革蘭陽性菌最常見的一種表面黏附素蛋白[11-12]。該家族蛋白前體N端均有1段非典型的信號肽，與信號肽相鄰的片段依次為短絲氨酸重復區域(SRR1)、非重復序列區域 (NRR)、長絲氨酸重復區域(SRR2)和1段相對保守的細胞壁錨定序列(LPXTG)(該序列被分選酶識別并在成熟過程中被剪接)[3,13-16]。其中，NRR結構域對于金葡菌黏附性至關重要[17-18]，而SRR2可能參與將SRR1及NRR延伸到細菌表面的過程[19]。SasA蛋白(又稱為Srap)是金葡菌表面蛋白之一，屬于SRRP家族，相對分子質量較大，由2 271個氨基酸組成。SasA的功能目前尚未完全研究清楚，但有研究結果表明，SasA能夠黏附人血小板[20-21]，且金葡菌表面蛋白A突變菌株與野生菌相比，侵染能力顯著減弱[22]。同時，在家兔模型中觀察到，該蛋白發揮血管感染毒力決定因子的作用[23]。目前，牛源金葡菌中也發現編碼SasA蛋白的基因，這提示SasA蛋白作為表面抗原可成為哺乳動物金葡菌疫苗的新靶點。然而關于牛源金葡菌SasA蛋白與宿主細胞互作及在奶牛乳腺炎中致病作用的研究較少，因此，本試驗重點研究該蛋白對奶牛乳腺上皮細胞的黏附作用。

本研究主要分為兩部分，首先鑒定SasA基因在牛源金葡菌中的攜帶情況及序列相似性，再利用流式細胞儀測定SasA蛋白重組片段對奶牛乳腺上皮細胞的黏附性高低。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株與細胞 試驗采用中國北方5個荷斯坦牛場隨機取樣分離純化的73株牛源金葡菌菌株。目標片段表達載體為pET21a+重組質粒轉化的BL21大腸桿菌菌株，由軍事科學醫學院生物工程研究所疫苗與抗體工程研究室篩選饋贈。NRR的各片段(NRR、NRR1-2、NRR3)及SRR1片段構建如圖1所示。體外培養的Mac-T細胞系由山東農業大學動物科學技術學院提供。

圖1 金黃色葡萄球菌不同區段NRR片段Fig.1 S.aureus NRR of different domains

1.1.2 主要儀器 流式細胞儀(Life Technology 公司),核酸分析儀GE公司(Nano Drop),普通PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)。

1.1.3 主要試劑 純化用的Q柱、Ni柱Buffer以及PBS、NaOH、LB 液體培養基、100 mg·mL-1氨芐青霉素、IPTG貯存液、30%丙烯酰胺、10%過硫酸銨、pH為6.8和8.0的1 mol·L-1Tris-HCl、SDS-PAGE緩沖液、上樣緩沖液、凝膠脫色液等由實驗室配制；DMEM細胞培養基、胰酶消化液和胎牛血清白蛋白(BSA)購自Gibco公司，Cy3熒光染料購自GE Healthcare公司，溶解Cy3的甲基亞砜購自Sigma公司，PCR擴增用的ExTaq、dNTPs、ExTaqBuffer購自TaKaRa大連寶生物有限公司，細菌基因組提取使用Promega細胞基因組DNA樣品提取試劑盒，Western blot采用的抗體來自于小鼠的抗His單抗。

1.2 方法

1.2.1 Mac-T細胞的培養 細胞在37 ℃條件下復蘇，離心后，棄掉上清液，加入完全培養液，置5% CO2、37 ℃條件下恒溫過夜培養。培養至細胞匯合度達90%，進行細胞傳代，連續培養3代后，用于后續目標蛋白的黏附試驗。

1.2.2 細菌基因組提取 取20 μL菌液置于2 mL TSB培養基37 ℃培養，收集1 mL培養液，利用Promega細胞基因組DNA樣品提取試劑盒按照說明進行金葡菌基因組DNA的提取。提取出的DNA置于2～8 ℃暫時保存，用于后續SasA基因鑒定及序列同源性分析。

1.2.3SasA基因鑒定 使用Oligo6.0軟件設計上下游引物，序列：5′-AGTCATAGTTTAGTGAGT- CAAGATAATCAAA-3′ (上游引物)；5′-ATTTCTT-GTTACTTCATATTTAAAAGTTGTCG-3′ (下游引物)。

PCR反應體系：上下游引物各0.25 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL,Taq酶0.125 μL，用雙蒸水將反應體系補充到25 μL。PCR反應條件：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃變性30 s，51.2 ℃退火90 s，72 ℃延伸35 s，35個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴增產物經凝膠電泳鑒定SasA基因，對經鑒定攜帶SasA基因的菌株進行二代測序，并挑選其中測序結果較好的45株菌株利用Geneious軟件進行保守性分析，構建進化樹，具體方法參考文獻[24]。

1.2.4 目標片段表達試驗 37 ℃條件下，將凍存菌株放置在加入100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB液體培養基中過夜復蘇。將比例稀釋至1∶100，移至用平底燒瓶盛裝的含有100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB培養基，37 ℃ 220 r·min-1條件下培養。當測定到細菌懸浮液OD600 nm達0.6～0.8時，加入IPTG，使其濃度達到0.5 mmol·L-1，同樣條件下，培養6 h以充分誘導蛋白表達。將懸濁液在6 000 r·min-1的轉速下離心10 min收集菌體，并用80 mL Ni柱Binding Buffer重懸菌體，然后以超聲波5 s后間隔5 s的頻率破碎菌體，時長為30 min。當觀察到細菌懸濁液清亮時，12 000g離心20 min后，取上清液，利用目標片段構建時帶有的his標簽和蛋白等電點先后用Ni柱和Source 30Q陰離子層析柱純化，每次純化后均用SDS-PAGE分離目標片段。

1.2.5 目標蛋白純化及誘導效果檢測 柱純化出現蛋白峰時，收集峰后蛋白質，用12% SDS-PAGE進行鑒定，濃縮膠80 V分離15 min，分離膠180 V分離45 min，考馬斯亮藍染液染色30 min后脫色，觀察結果。取未誘導表達的菌體破碎后的上清液與純化的NRR片段作對照，Western blot檢驗結果。

1.2.6 目標蛋白Cy3熒光標記 將待熒光染色的蛋白置于0.1 mol·L-1pH = 9.3的Na2CO3透析液中，并調節蛋白質的最終濃度為1 mg·mL-1,所得的蛋白與Cy3染料結合，在避光條件下，孵育30～60 min，反應后的混合物通過凝膠過濾柱，除去未反應的染料，目標蛋白被洗脫。通過全波長掃描測得A280 nm以及A552 nm的值，計算Cy3標記程度。

1.2.7 目標片段黏附性檢測 當奶牛乳腺上皮細胞(Mac-T)的細胞匯合度達到90%時，收集細胞并用PBS清洗，加入胰酶對細胞進行消化，37 ℃放置5 min，加入3倍體積的完全培養液終止消化。將細胞懸浮液置于1 000 r·min-1條件下離心5 min，棄去上清液，并將剩余部分用PBS反復清洗。細胞固定液重懸細胞，37 ℃固定30 min。固定后的細胞用PBS清洗3遍，并調整細胞數至106個·mL-1，將熒光標記的NRR片段、SRR1片段、BSA與細胞置于流式管中共同避光孵育1 h。SasA蛋白黏附性檢測試驗中，加入的BSA與NRR濃度如表1，共設置7個濃度以保證最大濃度時黏附性達到飽和，進入平臺期。NRR黏附性驗證試驗中，選取的NRR以及SRR1濃度為50和250 nmol·L-1。由于NRR濃度為50和100 nmol·L-1時,完整的NRR與細胞結合的比例大約為40%，但100 nmol·L-1條件下略高，為使流式細胞檢測結果更直觀，各片段間黏附性差異更加明顯，主要黏附片段定位試驗中將各目標片段濃度調整至100 nmol·L-1。以上每個濃度各設置3個生物學重復。孵育完成后,用PBS清洗2次后,再另加500 μL PBS重懸細胞。對細胞進行流式細胞儀檢測。各組黏附效果差異顯著分析用Excel 軟件進行t-test檢驗，使用Graphpad Prism軟件繪圖。

表1 BSA與NRR濃度Table 1 The concentration of BSA and NRR

2 結 果

2.1 SasA鑒定和保守性分析

SasA基因鑒定主要采用PCR擴增編碼SRR1-NRR段的基因。結果顯示，73株金葡菌中有63株含SasA基因(部分樣本電泳檢測結果如圖2所示)，占比86.3%。對SasA基因攜帶菌株測序并將選中的45株的序列通過軟件比對構建進化樹(圖3)，得出基因序列一致性為97.1%。

M.DNA相對分子質量標準；1～23.73株金黃色葡萄球菌中的前23株M.DNA marker;1-23.The first 23 strains among 73 strains of S.aureus圖2 SasA基因擴增后電泳檢測結果Fig.2 Electrophoretic result of SasA amplification

圖3中，0.006表示該長度的分支代表的基因變異度為0.006，由此可看出，這些菌株SasA基因普遍變異程度較小，基因序列具有高度同源性。

圖3 SasA基因攜帶菌株的基因進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of SasA gene-carrying strains

攜帶SasA基因的63株金葡菌菌株在采樣的5個牛場中的來源分布如圖4所示。圖4的結果顯示，SasA基因攜帶菌株在5個牛場中所占比例均高于60%，表明攜帶SasA基因的金葡菌存在一定的普遍性。

圖4 攜帶SasA基因的金葡菌菌株在5個牛場的分布Fig.4 Proportion of SasA gene-carrying strains in 5 dairy farms

2.2 目的蛋白的純化效果檢測

最后1次純化所得蛋白，用PBS調整蛋白濃度至 1 mg·mL-1，由ImageJ軟件分析電泳圖(圖5A、B)，得到NRR純化度為98%。最后Western blot檢測誘導表達效果如圖5，圖5結果顯示，經過誘導且純化后獲得的NRR量顯著高于未誘導樣。

M.蛋白相對分子質量標準；1.未純化NRR;2.純化NRR;3～6(或7).收集的蛋白峰M.Protein marker;1.Unpurified NRR;2.Purified NRR;3-6 (or 7).Protein collected at peak圖5 Ni柱純化(A)和Q柱純化(B)的電泳結果及NRR Western blot 檢驗結果(C)Fig.5 SDS-PAGE of NRR purified by Ni column (A),Q column (B) and Western blot of NRR (C)

2.3 SasA蛋白對奶牛乳腺上皮細胞黏附性檢驗

通過流式細胞儀檢測呈陽性的細胞數，結果如圖6所示。結合NRR的Mac-T細胞數量顯著高于結合BSA的細胞數量(圖7)，說明NRR對奶牛乳腺上皮細胞存在較強的黏附性。

以上只展示該濃度下第1個生物學重復的流式檢測結果,下同The above figures only show the flow cytometry test results of the first repeat at different concentrations,the same as below圖6 不同濃度下與Mac-T結合的NRR-Cy3或BSA-Cy3的流式檢測結果Fig.6 Flow cytometry tests of different concentrations of BSA-Cy3 or NRR-Cy3 binding to Mac-T

圖7 黏附于細胞上的NRR-Cy3與BSA-Cy3比率Fig.7 Percent of NRR-Cy3 and BSA-Cy3 binding to Mac-T

2.4 NRR為主要黏附片段的驗證試驗

先后選取濃度為50和250 nmol·L-1的NRR及SRR1片段，熒光Cy3標記，與Mac-T孵育1 h，流式細胞儀檢測。結果顯示，NRR黏附的細胞比率極顯著高于SRR1(P<0.01，圖8、9)，表明NRR是奶牛乳源金葡菌的主要黏附片段。

圖8 不同濃度下與Mac-T結合的NRR-Cy3或SRR1-Cy3的流式檢測結果Fig.8 Flow cytometry tests of different concentrations of NRR-Cy3 or SRR1-Cy3 binding to Mac-T

為進一步確定NRR片段中起主要黏附作用的區段，分別將濃度為100 nmol·L-1的不用熒光標記的NRR1-2、NRR3、NRR(圖1)與100 nmol·L-1NRR-Cy3混合后與細胞孵育。通過流式細胞儀檢測發現，未標記的NRR(P<0.001)、NRR1-2(P<0.001)、NRR3(P<0.01)均對NRR-Cy3黏附Mac-T存在抑制作用。但相較之下，NRR1-2抑制作用更顯著，即發揮主要黏附作用的區域大致定位在NRR1-2區段(圖10)。

3 討 論

金葡菌與宿主細胞受體結合主要依靠一系列黏附素，黏附是金葡菌定植于奶牛乳腺上皮細胞的關鍵步驟，深入研究金葡菌的黏附作用，找到作用的受體，有利于人為干擾或抑制金葡菌黏附宿主細胞從而減少感染細胞數[25-27]。此外，有關表面黏附和免疫逃逸的基因是金葡菌疫苗重要的候選基因，因此，SasA基因分布和功能的研究也極為重要[28-29]。

有關于SasA基因人流行病學調查研究結果顯示，人體分離純化得到的42株金葡菌菌株中84%均含SasA基因。本研究中，針對牛源金葡菌SasA基因的攜帶情況進行調查，采集到的73個樣本中86.3%含該基因，這說明SasA基因廣泛存在于在人和牛源金葡菌中[24]。

Yang等[30]對NRR結構域的晶體結構分析將整個片段劃分為4個部分，包括兩個不同的串聯鈣黏蛋白樣的模塊，1個β-折疊和1個豆科凝集素樣模塊(L-Lectin，245—751 aa)，因此SasA也被歸為類豆科植物凝集素細胞壁錨定表面蛋白。已有的研究發現，SasA蛋白黏附宿主細胞是通過L-Lectin結構的識別實現的，這可能是導致本試驗中NRR與SRR1黏附性存在顯著差異的重要原因。

*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001圖9 黏附于Mac-T細胞上的NRR-Cy3與SRR1-Cy3比率Fig.9 The proportion of NRR-Cy3 and SRR1-Cy3 binding to Mac-T

本研究在參考前人對于L-lectin 及NRR-SRR1 (48—540 aa)[19]黏附性探究的基礎上，單獨挑選NRR與SRR1片段(圖1)進行黏附性差異分析驗證了NRR的黏附性，并通過競爭抑制黏附試驗來定位主要黏附片段，發現NRR1-2 (230—540 aa)競爭抑制完整NRR片段黏附的作用更顯著，在本研究中的所有片段中黏附力最強，這與結構中L-Lectin(245—492 aa)基本相符，也解釋了NRR3的競爭抑制黏附能力較弱的原因。豆科凝集素樣模塊富含堿性氨基酸，可與N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)特異性結合，與調節宿主細胞的唾液酸化受體的黏附過程有關[22,30]，進一步證實了NRR在SasA黏附性調節中的重要作用，也揭示了相關受體的潛在特性。在人唾液中分離出的gp340受體能與SasA通過Neu5Ac結合，故SasA可成為人與奶牛疫苗研究共同的候選靶點[22]。

*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001圖10 不同區段NRR片段抑制NRR-Cy3黏附Fig.10 Inhibition of NRR-Cy3 binding to Mac-T by different NRR domains

為確定NRR1-2片段對奶牛乳腺細胞的具體影響和定位該片段與奶牛乳腺上皮細胞結合的位點，進一步的研究擬尋找奶牛乳腺上皮細胞表面含有Neu5Ac的糖蛋白，制備抗NRR1-2單抗并與NRR1-2共孵育侵染純化后的該糖蛋白，通過對比單抗組與非單抗組感染程度確定NRR1-2的黏附效應和驗證該受體。

4 結 論

SasA基因在奶牛乳源金葡菌菌株中普遍存在，各菌株該基因的序列具有高度的保守性。除此之外，在SasA蛋白中，對奶牛乳腺上皮細胞起主要黏附作用的為NRR片段而非SRR1，大致定位在其結構域的230—540位氨基酸。本研究為確定人與奶牛金葡菌疫苗研究共同的候選靶點提供了重要試驗數據，為定位牛乳腺上皮細胞SasA蛋白受體提供了參考信息。

致謝：本研究得到中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院徐俊杰研究員及團隊成員的大力支持和指導。