中華鱉睪丸界膜的組織學特性

丁佰韜，王琦，崇金星，陳暢，楊平

(南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095)

中華鱉，又名甲魚，是一種古老的爬行類動物，也是我國養殖規模最大的爬行動物之一，鱉肉肥美鮮嫩，具有極高的營養價值，鱉甲常用作中藥材，具有極高的醫用和藥用價值[1]。本實驗室前期對中華鱉生殖特性的研究發現，中華鱉精子發生的季節性變化具有階段性和過程特異性[2]。中華鱉是一種季節性繁殖動物，4～5年齡性成熟，精子發生開始于春季5月初，持續到秋季末，在冬季11月初精子一次性地被釋放到附睪后，進入冬眠期，此時動物機體的體溫、代謝等生理活動下降[3]，精子發生也進入停滯期；到春季，中華鱉各項生理活動緩慢復蘇，生殖活動也進入精子發生初期，并在夏季達到精子發生的高峰期[4]。

界膜也被稱為固有層、管周層、管周組織或邊界組織[5]。它由最外層的成纖維細胞、中間的肌樣成纖維細胞和最內層的細胞外基質組成。成纖維細胞可分泌一定的基質和纖維，以修復睪丸界膜。中層的肌樣成纖維細胞有平滑肌細胞收縮的特性，以調節生精小管的壓力，促進精子向附睪方向移動[6]，因此，肌樣成纖維細胞可以表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)；肌樣成纖維細胞還具有成纖維細胞的特性，分泌細胞外基質，影響支持細胞代謝，在睪丸間質細胞之間形成微循環；在病理狀態下，肌樣成纖維細胞還能夠向成纖維細胞轉化，以分泌基質和纖維。最內層的基質部分位于基膜和細胞之間，支持細胞和肌樣成纖維細胞分泌的多種蛋白都在其中發揮生理學作用[7]。

目前關于睪丸的研究多聚焦于哺乳動物，如小鼠、人類等[2, 5-13]。對于爬行動物睪丸的研究較少，尤其是中華鱉睪丸界膜的季節性變化。本試驗選用不同繁殖階段的中華鱉睪丸，采用HE染色、馬松染色、甲苯胺藍染色、免疫組化染色方法研究中華鱉睪丸界膜的季節性變化，為中華鱉睪丸界膜的深入研究，促進中華鱉常年繁殖的潛在應用提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別于2019年4月、12月，于南京水產市場采購5只成熟健康中華鱉，750～950 g/只。

1.2 光鏡樣品制備

將睪丸切割為小塊組織，置于4%多聚甲醛固定48 h，上行梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，用萊卡切片機RM2455(Leica公司)制作石蠟切片(厚度5 μm)。

1.3 HE染色

蘇木精染色1 min，伊紅染色10 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。使用光學顯微鏡DP73(Olympus公司)觀察中華鱉睪丸形態變化并拍照。

1.4 馬松染色

用Weigert鐵蘇木素染色液染色5～10 min，酸性乙醇分化液分化5～15 s，水洗后馬松藍化液返藍3～5 min，水洗后麗春紅品紅染色液染色5～10 min，磷鉬酸溶液洗1～2 min，再用配置好的弱酸工作液洗1 min，放入苯胺藍染液中染色1～2 min，弱酸工作液洗1 min，95%乙醇快速脫水，無水乙醇脫水3次，每次5～10 s，二甲苯透明3次，每次1～2 min，中性樹膠封片。使用光學顯微鏡DP73(Olympus公司)觀察中華鱉睪丸結締組織變化并拍照。

1.5 甲苯胺藍染色

睪丸切片入甲苯胺藍染液5 min，水洗，1%的冰醋酸分化，自來水洗終止反應，顯微鏡下控制分化程度，自來水洗后，將切片置于烤箱烤干。二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。使用光學顯微鏡DP73(Olympus公司)觀察中華鱉睪丸界膜內肥大細胞變化并拍照。

1.6 免疫組化染色觀察

3% H2O2室溫孵育10 min除去內源性過氧化物酶。0.02 mol/L PBS清洗5 min×3次，切片上滴加5% BSA室溫孵育30 min。擦拭切片周圍，用0.01 mol/L PBS溶液以1∶50的濃度稀釋一抗并滴加α-SMA抗體(BM00022，武漢博士德生物公司)，4 ℃孵育過夜。次日，切片用0.02 mol/L PBS漂洗5 min×3次，滴加生物素標記的二抗(即用型快捷免疫組化試劑盒Kit-5001，福州邁新生物公司)，將切片放入濕盒中37 ℃孵育60 min，用0.02 mol/L PBS漂洗5 min×3次，滴加SABC復合物，37 ℃孵育30 min，0.02 mol/L的PBS漂洗5 min×3次，DAB顯色8 min，蒸餾水洗5 min×3次，蘇木精復染10 s，中性樹膠封片。使用光學顯微鏡DP73(Olympus公司)觀察中華鱉睪丸界膜內肌樣成纖維細胞變化并拍照。

1.7 數據統計與分析

隨機選取相同倍鏡下的HE圖片，使用ImageJ Pro測量圖片積分光密度值(IOD值)，分析得到不同繁殖階段中華鱉睪丸生精小管面積、生精上皮厚度、界膜面積、界膜厚度數據。使用SPSS 16.0進行統計學分析，采用t檢驗比較不同繁殖階段中華鱉睪丸生精小管面積、生精上皮厚度、界膜面積、界膜厚度的差異，用GraphPad Prism 5.0作圖，所得數據采用“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 中華鱉睪丸形態學比較

通過HE染色觀察到，冬眠期中華鱉睪丸生精小管管腔內的生精上皮由2～3層生精細胞構成，但生精細胞數量較少，初級精母細胞和精子細胞甚至消失，偶爾能看見生精小管管腔內有殘存的上個生精周期的精子細胞(圖1A)。生精小管管腔在冬眠期出現明顯皺縮(圖1A、圖1B)，生精小管界膜內廣泛分布血管、淋巴管及各種形態的細胞(圖1A)，血管多圍繞在生精小管周圍(圖1B)。界膜內不僅可見各種形態的細胞，還有緊貼在生精小管界膜的梭形細胞，以及存在于生精小管之間的睪丸間質細胞，睪丸間質細胞呈圓形或多邊形，細胞質呈嗜酸性，常圍繞血管周圍(圖1B)。

繁殖期中華鱉睪丸生精小管擁有明顯擴張的管腔，管壁內襯5～8層生殖細胞的生精上皮，并形成從基底部開始向管腔部發出的放射狀排列的精子柱。精子柱上排列著各級生精細胞(圖1C、圖1D)。繁殖期中華鱉睪丸生精小管周圍血管變少，界膜厚度變薄(圖1C)，在結締組織內可見精子細胞(圖1D)。

A.冬眠期鱉睪丸生精小管出現皺縮；B.冬眠期鱉睪丸生精小管周圍血管、淋巴管較多；C.繁殖期鱉睪丸生精小管管腔擴張；D.繁殖期鱉睪丸界膜存在游離精子。ST.生精小管；BV.血管；LC.睪丸間質細胞；→.精子細胞

通過馬松染色觀察到，冬眠期生精小管之間以界膜隔開，界膜外存在大量膠原纖維，包圍生精小管，并將生精小管與外部分隔開，膠原纖維內存在深染的細胞成分(圖2A、2B)。繁殖期中華鱉睪丸間質內多是膠原纖維，且膠原纖維稀疏，細胞成分較冬眠期少(圖2C、2D)，生精小管之間通過血管、結締組織等連接。

通過甲苯胺藍染色可清晰觀察中華鱉睪丸界膜內的細胞形態。冬眠期時，膠原纖維淡染，可見大量的細胞成分，此時睪丸生精小管周圍包繞多層肌樣成纖維細胞細胞，通過甲苯胺藍染色難見肥大細胞存在(圖3A、3B)，但界膜分布有細長梭形狀核的肌樣成纖維細胞。繁殖期時，細胞成分減少，但生精小管基底部可見形態不同于冬眠期睪丸界膜的肌樣成纖維細胞，此時肌樣成纖維細胞的細胞核細長，胞體較大，有突起，分布于睪丸間質細胞周圍，且光鏡下分層不明顯，此時肥大細胞仍難以見到(圖3C、3D)。

A.冬眠期鱉睪丸疏松結締組織包繞生精小管；B.冬眠期鱉睪丸界膜膠原纖維豐富；C.繁殖期鱉睪丸疏松結締組織分布稀疏；D.繁殖期鱉睪丸膠原纖維內分布血管。ST.生精小管；BV.血管；CF.膠原纖維

A.冬眠期鱉睪丸膠原纖維淡染；B.冬眠期鱉睪丸生精小管外側有多層肌樣成纖維細胞；C.繁殖期鱉睪丸細胞成分較少；D.繁殖期鱉睪丸僅可見單層肌樣成纖維細胞。→.肌樣成纖維細胞

2.2 中華睪丸生精小管及界膜的面積及厚度比較

繁殖期中華鱉睪丸生精小管面積顯著大于冬眠期(P<0.05，圖4A)，生精上皮厚度極顯著大于冬眠期(P<0.01，圖4B)；冬眠期中華鱉睪丸界膜面積顯著大于繁殖期(P<0.05，圖4C)，界膜厚度極顯著大于冬眠期(P<0.01，圖4D)。從冬眠期到繁殖期，中華鱉睪丸生精小管面積增加，生精上皮厚度同樣增加；界膜面積減少，界膜厚度同樣減小。

A.不同繁殖階段生精小管面積比較；B. 不同繁殖階段生精上皮厚度比較；C.不同繁殖階段界膜面積比較；D.不同繁殖階段界膜厚度比較。*P<0.05表示差異顯著；** P<0.01表示差異極顯著

2.3 中華鱉睪丸肌樣成纖維細胞變化比較

為進一步探究生精小管周圍梭形細胞的分布與表達，使用α-SMA定位肌樣成纖維細胞，其在不同月份的中華鱉睪丸表達定位也不相同。在冬眠期的中華鱉睪丸組里，α-SMA表達的肌樣成纖維細胞在生精小管周圍廣泛呈彌散狀，其細胞核細長，形成3～4層的網狀結構包繞生精小管(圖5A、5B)。在繁殖期中華鱉睪丸中，生精上皮管腔內仍排列著大量的游離精子，管腔基底部排列著發育中的生殖細胞和永久性的支持細胞(圖5C)。α-SMA仍然在生精小管周圍的界膜表達，呈網狀結構包繞生精小管，也在睪丸間質細胞中少量表達，此時的睪丸間質細胞發育充分，環繞在肌樣成纖維細胞周圍。肌樣成纖維細胞緊貼生精上皮表達，胞核細長，胞質呈長突起狀(圖5D)。

3 討論

本試驗采用HE染色、馬松染色、甲苯胺藍染色以及免疫組化試驗對中華鱉睪丸界膜進行了分析。界膜是構成睪丸微環境的結構，能夠調節精子的正常發生，也被人稱為固有層、管周組織等[5]。界膜對于睪丸實質的物質交換起著重要作用，營養物質和代謝物都需要先通過界膜才能出入生精上皮。有研究認為界膜的內外層細胞皆具有物質運輸功能，其中肌樣成纖維細胞含有大量的吞飲小泡[8]。生精小管界膜能夠有選擇性地選擇物質通過。促卵泡激素(FSH)、促黃體生成素(LH)、類固醇激素、水和葡萄糖較易通過，肌醇、氨基酸、蔗糖等則需要較長的通過時間，還有些物質則完全不可以通過。因此，有研究認為界膜是血-睪屏障的一部分[12]。

A.冬眠期鱉睪丸肌樣成纖維細胞呈彌散狀；B.冬眠期鱉睪丸肌樣成纖維細胞的胞核及突起；C.繁殖期鱉睪丸成纖維細胞環繞生精小管；D.繁殖期鱉睪丸成纖維細胞連接生精小管和睪丸間質細胞。ST.生精小管；BV.血管；LC.睪丸間質細胞；→.肌樣成纖維細胞細胞核；.肌樣成纖維細胞突起；.多層的肌樣成纖維細胞彌散分布；.血管平滑肌細胞

界膜的基膜和細胞之間的成分被稱為細胞外基質(ECM)，ECM能夠調控支持細胞的分化、代謝活動，維持支持細胞的正常結構和功能[9]。肌樣成纖維細胞的分泌物是構成ECM的重要組分，如纖維連接蛋白、膠原纖維和生長因子等[14]，其中一些物質會影響支持細胞的功能[10]。如肌樣成纖維細胞可參與維生素A的加工[15]。因此，肌樣成纖維細胞能通過改變ECM的成分以調節支持細胞的結構和功能。因此，肌樣成纖維細胞不僅為生精小管提供結構完整性，還參與精子發生和調節睪丸功能。

人們首先在哺乳動物物種中發現了圍繞睪丸生精小管的肌樣成纖維細胞，它們組成曲細精管的外細胞層，并與Sertoli細胞的基底面直接接觸[6]。但它們在生精小管間質組織中的形態因物種而異。在嚙齒動物中，包括大鼠、倉鼠和小鼠，在睪丸中僅見到一層肌樣成纖維細胞，細胞之間由不同的結構連接。在人和一些其他動物的生精小管界膜中存在多層的肌樣成纖維細胞[11]。這種由肌樣成纖維細胞形成的邊界組織有助于將生精小管與間質分開。

本研究在中華鱉的睪丸中觀察研究肌樣成纖維細胞的季節性變化。在冬眠期睪丸中，生精小管外存在類似人類睪丸的多層肌樣成纖維細胞結構，這些細胞表達SMA。而在繁殖期的睪丸中，肌樣成纖維細胞分層不明顯，且不呈冬眠期狀態的彌散式分布。這可能與肌樣成纖維細胞影響睪丸精子的運輸有關[16]。一方面，肌樣成纖維細胞可以與其他細胞協同精子發生[17]；另一方面，ECM的沉積和肌樣成纖維細胞的形態變化可能會導致雄性動物的不育癥[18]。因此，深入了解肌樣成纖維細胞在精子發生中的作用和調控機制，對于研究雄性不育癥具有重要意義。

同時，在睪丸疏松結締組織中，肥大細胞是一種常見的細胞類型，常沿淋巴管和小血管分布，在身體易于接觸外界抗原的地方，肥大細胞分布廣泛。在不同物種中，肥大細胞的數量也不一樣，在馬、豬和人睪丸中常發現肥大細胞；相反，兔睪丸內缺乏肥大細胞。另外，還有一些物種如大鼠、犬、貓、牛和鹿的睪丸實質中沒有肥大細胞[10]。

在人睪丸中，肥大細胞的數量隨著年齡改變而改變。嬰兒期睪丸間質中的肥大細胞略有增加，但在兒童期減少，到了青春期增加明顯，成年后睪丸結締組織中肥大細胞的數量逐漸減少，這種數量的變化可能與睪丸結締組織發育的變化有關[19]。在中華鱉睪丸中，巨噬細胞的分布與人類或大鼠睪丸區別明顯。肥大細胞在不同物種的分布差異還有待進一步研究。

冬眠期鱉睪丸界膜厚度和繁殖期界膜厚度存在顯著性差異，冬眠期中華鱉睪丸界膜厚度要極顯著大于繁殖期中華鱉睪丸，這種界膜厚度的變化在哺乳動物不育癥和正常生殖組中也有同樣的表現。有文獻報道，患生精障礙的人群中，精子發生的嚴重降低常伴隨生精小管界膜增厚，在人類生精小管界膜中，結締組織基質成分的異常擴張是導致生精小管增厚的主要原因[13]。有研究顯示，生精功能嚴重減退的證據是減退患者睪丸結蛋白樣免疫反應細胞的數量和強度明顯減少，這是肌樣成纖維細胞向成纖維細胞轉化的表現[5]。而人和中華鱉睪丸具有相同結構的肌樣成纖維細胞結構，這種結構基礎以及季節性變化可能為研究生精障礙提供了潛在病理模型。

綜上，本研究通過組織學觀察和形態計量學分析，對不同繁殖階段的中華鱉肌樣成纖維細胞和界膜形態進行了研究，并觀察到一定的變化，這種變化可能與其不同的生理繁殖期有關，為深入研究中華鱉繁殖機理奠定了基礎。