四川省理塘縣牦牛感染泰勒蟲的分子流行病學調查及蟲種鑒定

李友英，藍嵐，潘瑤，3，楊丹嬌，吳建平，李松明，程川，王德云*

(1. 南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；2. 甘孜藏族自治州畜牧業科學研究所，四川 甘孜 626000；3. 西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041；4. 理塘縣動物疫病預防控制中心，四川 理塘 624300)

梨形蟲病是由梨形蟲寄生于牛羊等動物紅細胞及網狀內皮細胞內引起的一種蜱傳寄生蟲病[1-2]，臨床癥狀主要以發熱、黃疸、貧血、血紅蛋白尿等為主，發病率和死亡率高，給養殖戶造成巨大損失[3-5]。迄今為止，發布的牛梨形蟲病病原主要有牛巴貝斯蟲(BabesiaBovis)、雙芽巴貝斯蟲(Babesiabigemina)、分歧巴貝斯蟲(Babesiadivergens)、卵形巴貝斯蟲(Babesiaovalis)、大巴貝斯蟲(Babesiamacrocephala)、東方泰勒蟲(Theileriaorientalis)、環形泰勒蟲(Theileriaannulata)、小泰勒蟲(Theileriaparva)、中華泰勒蟲(Theileriasinensis)和瑟氏泰勒蟲(Theileriasergenti)等[6-8]。青藏高原地區，感染牦牛與藏綿羊的泰勒蟲主要有中華泰勒蟲(Theileriasinensis)、環形泰勒蟲(Theileriaannulata)、東方泰勒蟲(Theileriaorientalis)、綿羊泰勒蟲(Theileriaovis)、呂氏泰勒蟲(Theilerialowenshuni)等[8-9]。本病需通過蜱吸食牛羊的血液進行傳播，該病的流行與當地蜱的消長、活動密切相關，具有明顯的季節性[10-11]。了解其流行規律可制定相應的防治措施預防控制該病。

牦牛是甘孜州畜牧業的主要養殖品種，是高原地區牧民的主要經濟動物，甘孜州轄18 個縣，其中理塘為五大牧區縣之一，牦牛為其優勢畜種[12-15]。牦牛梨形蟲病是危害牦牛養殖業的主要寄生蟲病之一[12]。擁崩扎[16]調查發現牛梨形蟲病不受年齡限制，以2 歲內的牛發病最多，但癥狀輕，死亡率較低；成年牛發病率較低，但病情嚴重，死亡率達70%～80%。2018年我們對甘孜藏族自治州(甘孜州)全部18個縣(市)牦牛梨形蟲的感染情況進行調查，采集牦牛全血1 381 份，梨形蟲平均陽性率高達31.72%，泰勒蟲占比86.29%；其中理塘縣達30.68%，泰勒蟲占比90%，說明理塘縣牦牛感染泰勒蟲情況較為嚴重。該病是造成全州牦牛夏秋季死亡的主要疫病之一[17]，但一直未有對甘孜州牦牛泰勒蟲流行規律的確切報道。本試驗通過分析理塘縣牦牛泰勒蟲感染的季節規律、年齡段、性別特點、體重變化及優勢蟲種鑒定，對理塘縣牦牛感染泰勒蟲的流行規律進行調查，對指導牦牛梨形蟲病防治，提高畜牧業經濟效益，促進農牧民增收具有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 牦牛血樣采集

2019年5—11月和2020年4—10月定點從理塘縣多個牧場采集臨床健康且未驅蟲牦牛全血345 份，標記時間、年齡、體重及性別，裝于一次性真空抗凝管中，置冰盒帶回實驗室檢測。所有的血樣均放在-20 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 全血總DNA提取

吸取150 μL全血加入離心管中，然后采用酚-氯仿法提取DNA，置于抗凝管中2～8 ℃保存。

1.2.2 18S rRNA引物的設計

采用文獻[18]報道的以18S rRNA為靶基因的梨形蟲巢式PCR方法進行檢測。引物信息見表1。

表1 引物信息

1.2.3 梨形蟲18S rRNA序列的PCR擴增

第一輪反應：PremixTaq酶(購自 TaKaRa 公司)12.5 μL，外引物F/R各1 μL(10 μmol/μL)，樣本DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸7 min；16 ℃反應結束。第二輪反應：PremixTaq酶12.5 μL，內引物 F/R 各1 μL(10 μmol/μL)，第一輪PCR產物1 μL，ddH2O 9.5 μL。95 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環；72 ℃延伸10 min；16 ℃反應結束。將第二輪PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 蟲種鑒定

將全部牦牛梨形蟲核酸陽性樣本共計65 份的PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。通過NCBI上的BLAST對序列進行比對。采用MEGA 7軟件以Neighbor-Joining法(Bootstrap值為1 000)基于梨形蟲序列構建系統進化樹，運用Lasergene 7.0軟件對所測得的序列進行同源性比對分析，根據構建的進化樹及同源性分析結果鑒定泰勒蟲蟲種。

1.3 數據統計與分析

采用 IBM SPSS Statistics 20 軟件進行方差分析和多重比較。試驗數據以“平均值±標準誤” 表示。

2 結果與分析

2.1 理塘縣牦牛泰勒蟲檢測

理塘縣采集血樣345 份，經巢式PCR擴增其18S rRNA部分基因序列，其中有65份樣本擴增出目的條帶，泰勒蟲陽性率為18.84%。部分樣本PCR電泳結果見圖1。

M.D2000 DNA Marker；P.陽性對照；N.陰性對照(去離子水)；1～12.牦牛全血樣本

2.2 牦牛感染泰勒蟲的季節規律

5、6月牦牛泰勒蟲陽性率較高，高于其他月份，分別為30.00%(12/40)、29.03%(18/62)。最低為11 月，陽性率為8.7%(65/345)。見表2。

表2 牦牛感染泰勒蟲的季節規律

2.3 不同年齡段牦牛泰勒蟲的感染情況

0～2歲組牦牛泰勒蟲陽性率為 19.70%(13/66)，2～5歲組為24.67%(37/150)，5歲以上組為11.63%(15/129)。0～2歲與2～5歲組牦牛泰勒蟲陽性率顯著高于5歲以上組(P<0.05)。見圖2。

字母不同表示差異顯著 (P<0.05)，字母相同表示差異不顯著 (P>0.05)

對同一年齡組的泰勒蟲陽性牦牛與陰性牦牛的平均體重進行分析，0～2 歲組，泰勒蟲陽性牦牛平均體重低于陰性牦牛，差異不顯著(P>0.05)；而2～5 歲組、5 歲以上組泰勒蟲陽性牦牛平均體重顯著低于對應的陰性牦牛(P<0.05)。說明感染泰勒蟲的牦牛體重普遍較低。

同一年齡組進行性比較，字母不同表示差異顯著 (P<0.05)，字母相同表示差異不顯著 (P>0.05)

2.4 不同性別牦牛泰勒蟲的感染情況

由表3可知雄性牦牛泰勒蟲陽性率為19.34%(41/212)，雌性牦牛為18.05%(24/133)，雄性牦牛泰勒蟲陽性率稍高于雌性牦牛，但差異不明顯。

表3 不同性別牦牛泰勒蟲的感染情況

2.5 牦牛泰勒蟲種鑒定

2.5.1 牦牛泰勒蟲蟲種檢測

將全部牦牛梨形蟲陽性樣本PCR產物測序鑒定，成功測序58 份，鑒定得到2 個蟲種。其中中華泰勒蟲占比為98.28%(57/58)，呂氏泰勒蟲占比為1.72%(1/58)。各月泰勒蟲蟲種情況詳見表4。

2.5.2 分子種系發育分析

基于梨形蟲18S rRNA基因序列建立進化樹進行牦牛泰勒蟲蟲種鑒定。由圖4可見，理塘縣檢測出的57 株序列(Yak1～55、Litang-5-4、Litang-5-5)與GenBank中已發表的中華泰勒蟲甘肅、河南分離株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1)之間的同源性為94.60%～100.00%，聚為一大枝，57株序列間同源性為92.9%～100.00%，鑒定為中華泰勒蟲。理塘檢測出的1 株序列(Litang-5-7)與已發表的呂氏泰勒蟲甘肅分離株(JX469521.1、JX469527.1、JF719833.1)之間的同源性為99.70%～100.00%，聚為一大枝，鑒定為呂氏泰勒蟲。

表4 牦牛泰勒蟲蟲種檢測結果

Yak1～55代表中華泰勒蟲55個樣本序列，▲代表其他樣本序列

3 討論

巢式PCR較常規PCR方法特異性更高，可用于診斷亞臨床感染[19-22]。Mahmoud等[23]使用間接熒光抗體試驗方法 (IFAT)及巢式PCR方法對驢和馬的血液寄生蟲感染情況進行檢測，IFAT的檢出率低于巢式PCR。18S rRNA具有保守性和高變性，不僅能檢測出是否有梨形蟲感染，還可通過梨形蟲核酸陽性樣本進行PCR產物測序，基因序列構建系統進化樹進行蟲種鑒定。沈雪鷹等[24]采用18S rRNA為靶基因的套氏PCR檢測云南省騰沖市牛羊梨形蟲的感染情況，采集758頭牛、羊的血樣，總陽性率27.31%，檢出蟲種包括巴貝斯蟲和泰勒蟲兩屬13種，牛感染6種泰勒蟲和4種巴貝斯蟲，羊感染3種泰勒蟲和2種巴貝斯蟲。藍嵐等[17]采用18S rRNA為靶基因的梨形蟲巢式PCR方法，對1 381份牦牛全血進行梨形蟲檢測，梨形蟲平均陽性率為31.72%，包括巴貝斯蟲和泰勒蟲兩屬，鑒定蟲種6個。18S rRNA基因作為分子標記以及其測序方法具有較高的檢出率和準確率，在牦牛和藏綿羊的梨形蟲檢測中應用廣泛且效果良好[25-27]。本試驗采用以18S rRNA為靶基因的梨形蟲巢式PCR方法，對四川省理塘縣牦牛泰勒蟲病原進行檢測，并通過構建系統進化樹及同源性分析進行蟲種鑒定。

擁崩扎[16]對甘孜州鄉城縣牛雙芽巴貝斯焦蟲病的流行病學進行調查，發現該病在鄉城縣12個鄉(鎮)時有發生，主要發生在夏秋季節，以7—10月份為發病高峰期，12月份有極少數牛發病。Li等[6]于2015年4—7月，對甘肅天祝白牦牛350份血樣進行檢測，梨形蟲陽性率為38.3%，鑒定蟲種4個，中華泰勒蟲、東方泰勒蟲、雙芽巴貝斯蟲、牛環形泰勒蟲、陽性率分別為26.0%、9.7%、8.3%、7.7%。鐘維等[27]于2016年9—10月，對采自四川阿壩州5個縣牦牛梨形蟲進行檢測，牦牛梨形蟲感染率為8.3%～100%，感染蟲種單一，均為中華泰勒蟲。劉道鑫[28]調查發現青海天峻地區牦牛泰勒蟲感染率為24.18%，2～3歲組感染率最高，為29.86%。甘孜州牦牛泰勒蟲感染情況較為嚴重，然而，到目前為止，一直未見對甘孜州牦牛感染泰勒蟲的季節、年齡、體重、性別等規律的確切報道。本試驗基于這一現狀，采集不同月份牦牛血樣，對理塘縣牦牛泰勒蟲感染季節規律、年齡段、性別特點、蟲種進行調查。結果發現泰勒蟲平均陽性率為18.84%，5、6月牦牛泰勒蟲陽性率明顯高于其他月份，2～5歲組牦牛泰勒蟲陽性率最高，顯著高于5歲以上組牦牛，與0～2歲組牦牛差異不顯著；公牦牛感染率略高，差異不顯著。鑒定牦牛泰勒蟲蟲種2個，其中中華泰勒蟲占比為98.28%，呂氏泰勒蟲占比1.72%，結果表明中華泰勒蟲為理塘縣牦牛感染的優勢蟲種。該調查為理塘縣梨形蟲病流行的預防及控制提供依據，在提高牦牛的生產性能方面，需要考慮梨形蟲感染造成的影響。

本次調查僅在5月份檢測出了呂氏泰勒蟲，檢出率較低。蜱是梨形蟲病原傳播的關鍵環節。呂氏泰勒蟲主要以青海血蜱為宿主。唐天才[29]自甘孜州石渠縣采集蜱蟲1 352只，鑒定為青海血蜱和西藏革蜱，其中青海血蜱占29.13%；西藏革蜱占70.87%，優勢種。該調查發現，青海血蜱僅分布于海拔相對較低的半農牧區的3個鄉。理塘縣屬于純牧業區，采樣地海拔均高達4 000 m，而青海血蜱主要分布于海拔相對較低的半農牧區，推測其為呂氏泰勒蟲檢出率較低的原因。但有關理塘縣蜱的種類及攜帶病原情況的資料幾乎為零，且青藏高原地區牦牛感染呂氏泰勒蟲的報道相對較少。除此之外，本次調查僅對理塘縣部分地區進行調查，所以其流行規律及機制尚待進一步深入研究。

梨形蟲病臨床特征以高熱、黃疸、貧血、消瘦和血紅蛋白尿為主，嚴重者可導致宿主死亡，亞臨床感染可出現牦牛產肉量下降、生長發育遲緩、繁殖性能下降等[5,27]。本次檢測牦牛均未發現有明顯的臨床癥狀，但是體重普遍偏輕，大大降低了牧民的經濟收入，應該引起高度重視，做好各項預防工作，將農牧民的財產損失降到最低。

本次調查發現理塘縣牦牛泰勒蟲5、6月感染情況較為嚴重，可能與其所在地理位置有關。理塘縣境內地表平均海拔4 300 m左右，5—10月降水量集中，氣溫相對較高；11月至次年4月，氣候干燥寒冷，多大風天氣，11月至次年3月平均氣溫多在0 ℃以下。每年5—6月份氣溫開始升高，植被增多，蜱蟲開始活躍，增加了蜱侵襲牦牛和傳播梨形蟲的機會，所以應在每年多發季節前進行預防性給藥和滅蜱工作。此次調查表明，不同年齡的牦牛感染陽性率不同，且2～5歲組的牦牛感染陽性率較高，為23.46%。因此，不同年齡的牦牛防治措施應該不同，應加強對2～5歲齡牦牛梨形蟲病的防治，這樣才能有效減少該病的感染率。

本研究首次對理塘縣牦牛感染泰勒蟲的流行規律進行調查，該縣牦牛泰勒蟲感染率較高，平均陽性率為18.84%，5、6月明顯高于其他調查月份；2～5歲組牦牛顯著高于0～2歲組牦牛，公牦牛感染率較高，優勢蟲種為中華泰勒蟲，為理塘縣牦牛梨形蟲病防控提供了重要參考。梨形蟲病的主要傳播媒介為蜱，但本試驗未對蜱的種類和分布進行調查，還需進一步調查研究。