墨蘭精油提取工藝優化及成分分析

鄧乾坤，王 斌，史學偉，朱根發，楊鳳璽，高 潔

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000；2.廣東省農業科學院環境園藝研究所/廣東省園林花卉種質創新綜合利用實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】蘭花為蘭科蘭屬植物，是中國十大名花之一，素有“國香”“君子之花”的美譽，在我國已有近2 000 年的栽培歷史，并形成了極具中國特色的蘭花文化［1］。因具有獨特的文化和觀賞價值，蘭花歷來是文人墨客喜愛的對象，在市場上具有良好的經濟價值?？鬃臃Q國蘭為“王者之香”，其香氣為國蘭的精髓和靈魂，是體現國蘭觀賞、文化及經濟價值的重要性狀，歷來是人們用來評估和鑒定蘭花品種優劣的重要條件之一。墨蘭（Cymbidium sinense）又名報歲蘭，適宜生長在半陰、溫暖、濕潤的環境中，主要分布于東南沿海地區的廣東、廣西、福建，以及西南地區的云貴川等地，品種豐富［2-3］，在廣東國蘭交易市場中最常見也最受歡迎。墨蘭葉形優美，花香清新幽遠，解郁提神，沁人心脾［4］，為優質香料物質，可在化妝品等領域進行良好應用。但有關蘭花精油的應用及相關產品的開發相對較少，針對墨蘭精油的開發和研究更為少見。因此，本研究開展墨蘭精油提取工藝的研究并對提取的精油進行成分測定，以期為墨蘭精油的開發應用提供技術及理論基礎，進而提升墨蘭的產業價值，促使墨蘭產業鏈的延伸?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，植物精油是一類從植物中提取的含芳香氣味［5］的物質，具有消炎、抗菌、抗病毒、抗氧化以及保護心血管等作用［6］，可以作為天然抗氧化劑有效延緩食品變質、提升食用油和肉類的貨架期。植物精油主要由萜類化合物、脂肪族化合物、芳香族化合物以及其他含氮硫類化合物等組成［7］，其中萜類化合物被認為是植物精油的主要成分［8］。李杰同時采用蒸餾法和萃取法提取了‘企黑’［9］和‘小香’［10］墨蘭精油，并對精油組分進行了初步分析，發現墨蘭精油主要含有棕櫚酸、二十五烷、二十三烷、二十七烷、二十四烷醇等。近年來，越來越多方法被應用于提取植物精油，包括溶劑浸提法、水蒸氣蒸餾法、超聲波輔助萃取法、超臨界CO2萃取法等［11-14］。其中，微波輔助萃取法所需設備簡單，操作方便，萃取范圍寬泛，出油率高，適合常規工業的工藝提取，因而廣泛應用于天然植物有效成分的提取。【本研究切入點】墨蘭香氣清新優雅，但目前關于墨蘭精油的產業應用幾乎為空白。本研究采用新育成的‘迎春素’墨蘭作為研究對象，采取超聲輔助萃取法提取墨蘭精油，通過單因素和正交試驗優化墨蘭精油提取工藝，并采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術（HS-SPME-GC-MS）對墨蘭精油的香氣成分進行測定。【擬解決的關鍵問題】通過優化超聲輔助萃取法提取墨蘭精油的工藝，篩選墨蘭精油提取的最適條件。結合墨蘭精油成分的分析，為墨蘭精油在食品、化妝品、醫藥以及農業環保領域中的應用提供科學依據，為墨蘭資源產業的發展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試墨蘭品種為‘迎春素’，采于廣東省農業科學院環境園藝研究所國蘭種質資源圃內。將采摘后的‘迎春素’墨蘭花朵用液氮冷凍，收集包裝在不透氣性聚乙烯袋中，帶回實驗室保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

試驗有機溶劑有正己烷、石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇等，均為國產分析純；試驗主要儀器包括RE212-B 旋轉蒸發器（日本Yamato 公司）、BS 2000S 型電子天平（德國賽多利斯公司）、7980A-5975C 氣相質譜聯用儀（美國安捷倫公司）、SPME 進樣器（瑞士CTC Analytics 公司）、MC202231DF-Ⅱ數顯集熱式磁力攪拌器（常州愛華儀器制造有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 超聲輔助萃取 將墨蘭花朵在60 ℃下烘干處理 24 h，烘干后用粉碎機粉碎，過孔徑380 μm的篩。稱取 20 g 粉末樣品，裝入錐形瓶中，加入有機溶劑，待其混合均勻后，將墨蘭料液置于超聲波處理器中處理，設置超聲波的頻率、時間和溫度進行超聲波浸提［15］。超聲作用后靜置，將料液進行分離，再進行抽濾，將提取液與濾渣分離。對抽濾得到的提取液在旋轉蒸發儀上進行濃縮（轉速100 r/min，溫度調至20 ℃，待溫度穩定后再調至 60 ℃），將濾渣重復萃取 3 次，收集3 次萃取液，用旋轉蒸發器分離有機溶劑，提取液中加入適量無水Na2SO4脫水干燥，稱重，計算墨蘭精油的提取率，平行試驗3 次。

1.2.2 墨蘭精油提取工藝優化 （1）單因素試驗：以墨蘭粉末為材料，選取不同的提取溶劑（95 %乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚）、料液比（1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10，g/mL）、提取時間（35、40、45、50、55 min）、提取溫度（45、50、55、60、65 ℃）進行墨蘭精油提取單因素試驗，計算墨蘭精油的得率。

（2）正交試驗：以墨蘭精油得率為指標，選取提取溫度、提取時間、料液比作為影響因素，通過正交試驗法 L9（33）確定有機溶劑提取墨蘭精油的最佳工藝條件（表 1）。

表1 L9（33）正交試驗因素表Table 1 L9（33）Orthogonal test factors

1.2.3 精油得率計算

式中，M1為瓶子和墨蘭精油的質量（g），M2為瓶子質量（g），M 為墨蘭質量（g），W 為墨蘭精油的提取率（%）。

1.2.4 頂空固相微萃取 取5 mL 提取的墨蘭精油于 20 mL 隔墊密封樣品瓶中，加入轉子置于磁力攪拌器上加熱。將50/30 μm DVB/CAR/PDMS 型號萃取頭在 GC/MS 進樣口250 ℃下老化 5 min 后，插入頂空樣品瓶進行懸空富集一定時間后取出萃取頭，于 GC/MS 中解析、檢測。

1.2.5 GC-MS 定性定量分析 墨蘭精油的GC-MS 測定條件：選用HP-INNOWAX 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，流速：1.0 mL/min；進樣口溫度 250 ℃，進樣量 1 mL，分流比50∶1；程序升溫條件：初始柱溫度40 ℃，以2 ℃/min 升至90 ℃，再以4 ℃/min升至140 ℃，最后以7 ℃/min升至250 ℃。

質譜條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，溶劑延遲3 min，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150℃，掃描質量范圍為 30～550 amu［16］。利用Wiley275.L 和NIST98.L 兩個譜庫對采集到質譜圖中的香氣成分串聯檢索，確定墨蘭精油的香氣成分。總離子流圖用峰面積歸一法計算各組分的相對百分含量，確定墨蘭精油的組成成分。

試驗數據使用SPSS 20.0 軟件進行統計和方差分析。利用軟件Origin 8.5 進行結果處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 不同有機溶劑對墨蘭精油得率的影響 稱取 10 g 墨蘭樣品，選擇石油醚、正己烷、95% 乙醇、乙酸乙酯 4 種有機溶劑為萃取劑，按料液比1∶9，在 45 ℃條件下提取 45 min，墨蘭精油得率見表 2。

由表2 可知，4 種有機溶劑中，使用95%乙醇提取得到的墨蘭精油產率最高、為1.92%。不同的有機溶劑對墨蘭精油的得率、顏色和香味都會產生不同程度的影響。95%乙醇作為萃取劑，精油色澤比較理想，墨蘭的特征香味濃郁，風味佳；石油醚作為萃取劑，精油得率雖然較高，但顏色呈墨綠色較混濁，而且香味淡薄，風味一般；正己烷作為萃取劑，精油得率不高，顏色為深墨綠色，香味淡薄，風味較好；乙酸乙酯作為萃取劑，精油得率較低，顏色為渾濁的墨綠色，香味淡薄，風味差。因此，95%乙醇是較好的有機溶劑提取劑，從價格、產率以及安全性等方面來考慮，選擇 95%乙醇為提取劑較為適宜。而石油醚、正己烷、乙酸乙酯提取得到的精油無論顏色還是香氣都不太理想，不適宜作為墨蘭精油的提取劑。

表2 不同有機溶劑對墨蘭精油得率的影響Table 2 Effects of different organic solvents on the yield of essential oil from Cymbidium sinense

2.1.2 不同料液比對墨蘭精油得率的影響 稱取20 g 墨蘭樣品，以95%乙醇作為萃取劑，選擇不同料液比（1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10）45 ℃萃取45 min，墨蘭精油得率變化見圖1。由圖1 可知，在不同的液料比下萃取墨蘭精油的精油得率不同。在料液比為1∶6～9 范圍內，隨著液料比的增加，墨蘭精油得率呈現增加趨勢，液料比為1∶9 時精油得率最高；料液比再增加時呈現下降趨勢。在料液比較少的情況下，物料墨蘭與有機溶劑接觸的表面積比越大［17］，固液濃度差就會相應增加，溶解度和滲透壓也會變大，加快了95%乙醇與墨蘭油脂分子的擴散速率，有利于油脂從墨蘭細胞組織中脫離出來，墨蘭油脂分子擴散速率的增加［18］，同時提高了墨蘭精油的得率。但當有機溶劑的量過高，液料比超過1∶9 時，不僅會增加試驗成本，還會使墨蘭精油得率降低。因此，從節約能源、降低成本、便于溶劑回收等綜合因素考慮，最佳的液料比為1∶9。

圖1 料液比對墨蘭精油得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on yield of essential oil from Cymbidium sinense

2.1.3 不同提取時間對墨蘭精油得率的影響 稱取20 g 墨蘭樣品，以95%乙醇作為萃取劑，料液比為1∶8，45 ℃下分別提取35、40、45、50、55 min，墨蘭精油得率變化見圖2。由圖2 可知，超聲波提取時間由35 min 增加到40 min 時，墨蘭精油得率大幅度增加；但是提取時間由40 min 延長到55 min 的過程中，墨蘭精油得率反而呈現下降趨勢。這是由于提取的初始階段，物料中精油含量較高，固液間濃度差較大，溶解度和滲透壓也變大，墨蘭精油擴散速率較大，墨蘭精油的油脂分子會不斷擴散到95%乙醇的有機溶劑中，精油萃取率就不斷增加；這可能是由于隨著超聲時間的延長，超聲能轉化成熱能，同時溶質中的小分子相互碰撞導致精油溶液溫度升高，使墨蘭精油揮發嚴重，精油的得率反而下降，因此進一步延長超聲作用時間對墨蘭精油得率的提高無促進作用，有機溶劑中的油脂量趨于飽和，溶液體系滲透壓趨于平衡［19］，得率不再增加，同時提取精油時間過長還會造成能耗的增加以及工序時間的延長，因此墨蘭精油提取工藝最佳提取時間為40 min。

圖2 超聲提取時間比對墨蘭精油得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extraction time on yield of essential oil from Cymbidium sinense

2.1.4 不同提取溫度對墨蘭精油得率的影響 稱取20 g 墨蘭樣品，以95%乙醇作為萃取劑，料液比為1∶8，分別于45、50、55、60、65℃下萃取45min，墨蘭精油得率變化見圖3。由圖3 可知，提取溫度在45～50 ℃之間，隨著溫度的升高，墨蘭精油得率呈現上升趨勢，當溫度增加到50 ℃時，墨蘭精油得率為2.81%，顯著高于其他提取溫度下的精油得率；隨著超聲提取溫度的進一步升高，墨蘭精油得率呈現下降趨勢。這是因為溫度的升高增加了分子之間的擴散作用，促進溶劑分子滲透到物料細胞內部，增加了溶劑分子和油脂分子的活動動能，加劇溶劑分子的揮發和擴散，從而萃取率增加［20］。此外，溫度升高以及隨著提取時間的延長沸騰劇烈，導致95%乙醇的揮發加劇，減少了95%乙醇與墨蘭的有效作用，不利于墨蘭精油的萃取，因此當溫度高于50 ℃時，墨蘭精油得率出現下降現象。

圖3 超聲提取溫度比對墨蘭精油得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction temperature on yield of essential oil from Cymbidium sinense

2.2 正交試驗結果與分析

選取料液比、超聲提取時間、超聲提取溫度作為影響因素，以墨蘭精油得率為指標，采用L9（33）正交試驗進一步優化墨蘭精油提取工藝。由表3 的R值可知，超聲提取溫度、超聲提取時間、料液比3 個因素對墨蘭精油得率的影響次序為：A 液料比＞B 超聲提取時間＞C 超聲提取溫度，根據3 個k 值的最大值組合，確定最優工藝條件為A2B1C1，即料液比1∶9、超聲提取時間35 min、超聲提取溫度45 ℃。在此條件下進行3次驗證試驗，墨蘭精油平均得率為2.96%，精油香味較濃郁，風味佳。

表3 正交試驗結果分析Table 3 Analysis of orthogonal test results

2.3 墨蘭精油香氣成分分析

墨蘭‘迎春素’的精油成分總離子流如圖4所示。經GC-MS 分析，測得該精油的78 種組分（表4），含量占精油成分總量的94.36%，相對含量在1%以上的組分有20 種，分別為異戊醛、2-己烯醛、己酸乙酯、羅勒烯、1,2,3,4-四氫萘、壬醛、辛酸乙酯、紫羅蘭酮、（E,E）-2,4-庚二烯醛、茶螺烷、L-芳樟醇、苯乙醛、乙二醇油酸酯、正十五烷酸、二氫紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、棕櫚酸、十八碳二烯酸甲酯、二十四烷、二十五烷。這20種精油組分的相對含量達到了80.37%，其中，棕櫚酸相對含量最高、為17.37%，其次為壬醛、正十五烷酸、二十四烷、合金歡醇，相對含量分別為10.57%、8.69、4.65%和4.03%。

圖4 墨蘭精油GC/MS 分析總離子流Fig.4 GC/MS analysis of total ion flow of essential oil from Cymbidium sinense

表4 墨蘭精油成分及其相對含量Table 4 Compositions and relative contents of essential oils from Cymbidium sinense

（續表4）

將鑒定出的墨蘭精油成分劃分為醛類、醇類、芳香族類、酮類、烷烴類、烯烴類、羧酸類、酯類、其他類呋喃和酰胺共9 類化合物。從圖5 可以看出，‘迎春素’精油中羥酸類、醛類、烷烴類、醇類最多，分別占化合物總數的26.21%、26.01%、11.59%和10.58%，這4 類化合物已達化合物總數的74.39%；酯類、酮類化合物相對少些，兩者所占比重相近，分別為9.64%和9.25%；而芳香族類和烯烴類最少，占比3.77%和2.62%。

圖5 墨蘭精油不同化合物的相對含量Fig.5 Relative contents of different compounds in essential oil of Cymbidium sinense

3 討論

3.1 超聲輔助萃取對墨蘭精油提取的影響

與采用水蒸餾法提取墨蘭精油的方法相比［9-10］，本研究采用超聲輔助萃取法的加熱溫度低，所需時間較短，可以防止墨蘭精油中的熱敏成分和易水解成分分解，最大限度地保留了精油中的特征香氣成分。傳統方法提取的精油得率僅為1%左右，而本研究采用超聲輔助萃取法經優化后可獲得較高的精油得率（2.9%左右），精油得率得到了大大提高。

不同溶劑會影響精油得率，選擇有效的有機溶劑對精油提取有重要影響。王海波等［21］研究表明，利用不同有機溶劑提取的桂花精油，在形態、氣味和顏色上有所區別，其中獲得精油效果較好的為石油醚。而從價格、產率以及安全性等方面考慮，本研究選擇乙醇作為提取劑較為適宜，所得到精油品質較好。

在影響超聲波輔助提取精油的因素中，料液比通過影響固液濃度差、溶解度和滲透壓等，改變有機溶劑與精油分子從植物細胞組織脫離的擴散速率；超聲波提取時間和提取溫度影響精油分子與有機溶劑的結合程度，從而影響精油得率。本研究認為料液比是影響精油得率的主要因素，與吳曉菊等［22］研究神香草精油工藝的結論相一致，而且從節約能源、降低成本、便于溶劑回收等方面綜合考慮，通過優化料液比、提取時間和提取溫度的工藝條件可獲得較高的精油得率。

3.2 墨蘭精油的香氣成分分析

本研對墨蘭‘迎春素’精油的香氣成分進行測定，檢測到78 種成分，香氣成分較多且大部分以羥酸類、醛類、烷烴類、醇類為主。通過分析對比得出墨蘭精油中的特征香氣成分主要為棕櫚酸、壬醛、正十五烷酸、二十四烷和合金歡醇等，其中棕櫚酸成分含量最高（17.37%），可以作為食品用的香料，也可添加到化妝品中滋潤皮膚。而在文殊蘭精油中檢測到棕櫚酸的相對含量為15.77%［23］，墨蘭‘迎春素’精油的棕櫚酸相對含量更多，而且這類芳香精油大多具有抑菌功能，推測墨蘭‘迎春素’精油也可能具有抑菌活性。墨蘭‘迎春素’精油的壬醛含量也較高，具有強烈的油脂氣味和甜橙氣息，其稀乙醇溶液有香草醛的香調，可用作食品添加劑，也可用于調制玫瑰、橙花、香紫羅蘭、香味等香精。此外，墨蘭中的合金歡醇物質具有青香韻的鈴蘭花香氣，并有青香和木香香韻，這些特征香氣可在今后應用于食品、化工和化妝品領域等。

4 結論

本研究以墨蘭‘迎春素’為原料，采用超聲波輔助萃取法提取墨蘭精油，通過單因素試驗和正交試驗得到最佳的工藝參數如下：以95%乙醇作為萃取劑，料液比1∶9（g/mL），超聲提取溫度45 ℃，超聲提取時間35 min，在此條件下墨蘭精油得率為2.96%，精油墨綠色透亮，香味較濃郁，風味佳。料液比、超聲提取時間、超聲提取溫度對墨蘭精油得率的影響順序為：液料比＞超聲提取時間＞超聲提取溫度。通過頂空固相微萃取-GC-MS 聯用技術分析鑒定了墨蘭‘迎春素’精油的化學成分，共鑒定出78 種化合物，其中主要成分為棕櫚酸、壬醛、正十五烷酸、二十四烷和合金歡醇等物質。