山羊地方性鼻內腫瘤病毒SU蛋白的表達及其多克隆抗體的制備和特性分析

江錦秀，張靖鵬，林裕勝，游 偉，胡奇林

（福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建 福州 350013）

【研究意義】山羊地方性鼻內腫瘤（enzootic nasal tumor，ENT）是一種由山羊地方性鼻內腫瘤病毒（enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2）引起的慢性接觸性傳染病，以患病山羊流鼻液，剖檢可見鼻腔內的類似菜花狀腫瘤為特征[1]。ENT在我國內蒙古、陜西、四川、重慶、福建等地均有報道[2?8]。【前人研究進展】多數學者認為由于山羊基因組中整合了內源性逆轉錄病毒使得山羊對ENTV-2病毒產生免疫耐受，導致無法在患病山羊血清內檢測到抗體。ENTV-2是逆轉錄病毒，具有相互重疊的gag、pro、pol、env編碼基因，以及長末端重復序列LTR。gag基因編碼衣殼蛋白，是逆轉錄病毒屬的群抗原。Pro基因編碼蛋白酶，pol基因編碼反轉錄酶和整合酶，env基因編碼囊膜糖蛋白。囊膜蛋白被切割成跨膜蛋白（Transmembrane protein, TM）和位于ENTV囊膜表面的表面蛋白（Surface protein, SU）。【本研究切入點】SU含有眾多的抗原位點，可誘導宿主產生中和抗體[9?10]。SU可以與宿主細胞的Hyal-2 受體結合，在ENTV感染宿主細胞的過程中起到重要作用[11]。表達ENTV-2FJ病毒株的SU蛋白將對了解ENTV-2的感染和致瘤機制以及建立診斷方法提供基礎。【擬解決關鍵問題】本試驗提取ENTV-2FJ病毒株的RNA，通過RT-PCR方法獲得了編碼SU蛋白的基因序列，克隆至原核表達質粒pET-32a（+），獲得原核表達質粒pET-32a（+）-SU，在RosettagamiB中進行SU蛋白表達；將純化的SU蛋白免疫小鼠，制備了小鼠抗SU蛋白的多克隆抗體，為進一步研究SU蛋白在ENTV-2感染中的作用以及建立檢測方法提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ECO RⅠ和Hin d Ⅲ內切酶購自NEB公司；Easypure Viral DNA/RNA Kit購自北京全式金生物技術有限公司；GoScriptTMReverse Transcription Mix, Oligo（dT）購自Promega；pMD-19T載體、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、E. coli DH5α Competent Cells、DL2000 DNA marker、2ⅹprotein loading buffer、Protein MW Marker（Low）均購自寶日醫生物技術有限公司；RosettagamiB（DE3）感 受 態 細 胞、IPTG、X-gal、WB BSA 封閉液體（1X in PBS）、辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；Goat anti-mouse IgG（H+L）, HRP conjugate, ELISA and WB購自Proteintech；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；SPF級Balb/c小鼠購自福州吳氏動物；ENTV-2純化病毒以及ENTV-2多克隆抗體由福建省農業科學院草食動物病研究室保存。

1.2 引物設計與合成

根據 GenBank 中收錄的 ENTV-2FJ株（登錄號：MK559457）的env基因序列，利用 Primer 6.0 軟件設計用于擴增 ENTV-2FJ SU基因的引物，下劃線處為酶切位點，預期擴增長度為 1 161 bp（表1）。引物由上海生工生物有限公司合成。

表 1 引物設計Table 1 Primer design

1.3 SU基因的克隆載體及原核表達載體的構建

利用 Easypure Viral DNA/RNA Kit試劑盒提取ENTV-2總 RNA，以RNA 為模板，用 RT-PCR 擴增 SU基因片段。反轉錄體系和程序參考GoScriptTMReverse Transcription Mix, Oligo（dT）試劑盒說明書。PCR體系參見寶日醫生物技術有限公司的PrimeSTAR Max DNA Polymerase的說明書。PCR程序設置為98 ℃10 S，55 ℃ 5 S，72 ℃ 30 S，共30循環。將PCR膠回收產物加A尾后連接pMD-19T，測序正確的陽性質粒和pET-32a（+）表達載體分別用 EcoRⅠ和 Hind III 進行雙酶切。酶切產物回收純化后，用T4 DNA ligase連接以構建重組質粒。重組質粒經雙酶切和測序分析驗證后命名為 pET-32a（+）-SU。

1.4 重組蛋白ENTV-2FJ SU的誘導表達

pET-32a（+）-SU按 常 規 轉 化 RosettagamiB（DE3）感受態細胞，對其IPTG誘導濃度（終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L?1）及誘導時間（3 、4 、5 、6 h，過夜）和誘導溫度（20 、25 、30 、37 ℃）進行優化。以pET-32a（+）空載轉化RosettagamiB（DE3）感受態細胞作為對照。誘導表 達 蛋 白 樣 品 經 過 處 理（12 000 r·min?1離 心，4 ℃離心10 min，棄上清，沉淀用PBS重懸，菌體沉淀加入PBS，冰浴超聲20 min，破碎菌體。12 000 r·min?1，4 ℃離心10 min，分別收集上清和沉淀），后經SDS-PAGE（10%分離膠）分析。

1.5 重組蛋白 ENTV-2FJ SU的純化

重組蛋白ENTV-2FJ SU大量誘導表達后，10 000 r·min?1，4 ℃離心10 min，棄上清，沉淀用PBS重懸，10 000 r·min?1，4 ℃離心10 min，棄上清，重復3次。菌體沉淀加入PBS，冰浴超聲20 min，破碎菌體。12 000 r·min?1，4 ℃離心10 min，收集沉淀，用含2 mol·L?1尿素的PBS重懸，12 000 r·min?1，4 ℃離心10 min，棄上清，重復此步驟3次，沉淀加入含8 mol·L?1尿素的PBS重懸，冰浴超聲，溶解包涵體。加入4ⅹ protein loading Buffer煮沸5 min，經SDS-PAGE電泳后切膠回收目的條帶，研磨后浸泡于PBS中，4 ℃過夜，離心取上清。

1.6 動物免疫和多克隆抗體的制備

取純化的 SU 蛋白以及ENTV-2FJ 純化病毒分別與等量佐劑混合，超聲乳化，皮下多點注射 Balb/c小鼠，第 1 次用弗氏完全佐劑，蛋白劑量為70 μg·只?1，之后2次免疫間隔時間均為2周，后2次免疫用弗氏不完全佐劑，蛋白劑量為100 μg·只?1；在第 3 次免疫后的第9 d，小鼠斷尾采血，分離血清，檢測抗體水平。待抗體水平達到要求時采血分離血清，保存于?20 ℃。

1.7 Western-blot 分析

對純化的ENTV-2FJ病毒進行SDS-PAGE分析后，采用半干法轉膜。將制備的小鼠抗SU蛋白多克隆抗體、小鼠抗ENTV-2多克隆抗體和正常對照小鼠血清分別作為一抗，Goat anti-mouse IgG（H+L），HRP conjugate，ELISA and WB為二抗（使用濃度1∶2 000），進Western-blot試驗。

1.8 ELISA試驗

分別以純化SU重組蛋白、純化ENTV-2病毒作為包被抗原，以鼠抗SU多克隆抗體以及鼠抗ENTV-2多克隆抗體為一抗（一抗以1∶4開始倍比稀釋至1∶32），HRP標記的山羊抗鼠IgG為二抗（使用濃度1∶12 000），進行ELISA試驗。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR 擴增和重組質粒的鑒定

RT-PCR 擴增得到約1 161 bp 的目的片段，結果見圖1。將目的片段連接pMD-19T，獲得SU-19T質粒，送福州鉑尚生物技術公司測序，測序結果與ENTV-2FJ株的SU基因序列對比，同源性高達100.0%，表明目的基因擴增正確。

圖 1 SU基因RT-PCR擴增結果Fig. 1 RT-PCR amplification result of SU gene

2.2 原核表達載體的構建及鑒定

SU-19T質粒用 EcoRⅠ和 Hind III 進行雙酶切，SU-19T質粒雙酶切后分別獲得約1 161 bp（目的條帶）和2 692 bp（pMD-19T載體）的2條帶（圖2），與預期條帶大小基本一致。pET-32a（+）空載也用EcoRⅠ和 Hind III 進行雙酶切，獲得約5 900 bp的條帶（圖3）。分別切膠回收目的片段和pET-32a（+）載體片段進行連接，連接后的重組質粒送福州鉑尚生物技術公司測序驗證。

圖 2 SU-19T質粒雙酶切結果Fig. 2 Double digestion result of SU-19T plasmid

圖 3 PET32 a（+）質粒雙酶切結果Fig. 3 Double digestion result of PET32 a（+）

2.3 重組蛋白ENTV-2FJ SU誘導表達條件的優化

以不同濃度的 IPTG 對菌體誘導過夜，離心收集菌液，超聲并制備樣品，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳。結果顯示，當IPTG 終濃度為 0.4～1.2 mmol·L?1時，重組蛋白SU表達量大且無明顯差異（圖4）。IPTG的終濃度均為1.0 mmol·L?1時，設置不同的誘導時間， 結果發現誘導3 、4 、5 、6 h以及過夜誘導后重組SU蛋白的表達量相差不大（圖5），使用20、25、30、37 ℃ 4種不同溫度誘導，SU蛋白均以包涵體形式表達，菌液上清中有少量SU蛋白表達，而 pET-32a（+）空載體誘導對照組則沒有重組蛋白的表達。

圖 4 不同IPTG誘導濃度對SU重組蛋白誘導表達的影響Fig. 4 Effect of IPTG at different concentrations on the induced expression of SU recombinant protein

圖 5 不同IPTG誘導時間對SU重組蛋白誘導表達的影響Fig. 5 Effect of different IPTG induction time on the expression of SU recombinant protein

2.4 重組蛋白ENTV-2FJ SU 的純化

pET-32a（+）-SU誘導表達后的樣品經過處理，經SDS-PAGE后顯示目的蛋白大小約64 KD，切膠回收目的條帶（圖6）用于蛋白免疫。

2.5 Western-blot 分析結果

Western-blot分析結果顯示，重組SU蛋白多克隆抗體能與ENTV-2FJ抗原發生特異性反應，出現大

圖 6 SU重組蛋白純化結果Fig. 6 The purification result of SU fusion protein

小為64 KD的條帶（圖7-C），ENTV-2FJ多克隆抗體與ENTV-2FJ抗原發生特異性反應（圖7-B），條帶與ENTV-2FJ病毒SDS-PAGE膠分析結果（另文報道[8]）一致，ENTV-2病毒與正常小鼠的血清無特異性條帶出現（圖7-A）。

圖 7 Western-blot 分析結果Fig. 7 The result of Western-blot analysis

2.6 ELISA結果

以純化SU重組蛋白、純化ENTV-2病毒作為包被抗原（病毒含量20 μg·L?1、100 μL·孔?1），以鼠抗SU多克隆抗體以及鼠抗ENTV-2多克隆抗體為一抗進行ELISA，結果如表2所示，SU蛋白抗原與鼠抗SU多克隆抗體以及鼠抗ENTV-2多克隆抗體均呈陽性反應；ENTV-2抗原與鼠抗ENTV-2多克隆抗體、鼠抗SU多克隆抗體（1∶4）呈陽性反應。

表 2 ELISA試驗結果Table 2 ELISA result

3 討論與結論

SU蛋白可以與宿主細胞的Hyal-2受體結合，并通過結合這一識別過程介導病毒對細胞的轉化[11]。JSRV缺失SU的信號肽到SU與TM的連接區域也使env喪失轉化能力，表明SU蛋白中可能有多個區域參與細胞轉化[12]。而張月梅等[13?14]構建了SU蛋白缺失型真核表達載體, 轉染293T細胞，運用激光共聚焦結合免疫共沉淀方法確定SU蛋白和Hya-2蛋白可能結合區域，結果表明SU基因所缺失區域238～867 bp對于SU蛋白與Hya-2蛋白的結合是必不可少的。研究SU蛋白對了解ENTV的免疫特性及致病機制具有重要意義。本研究成功表達了ENTV-2FJ 的SU蛋白，用純化的重組SU蛋白免疫小鼠，獲得了小鼠抗SU蛋白多克隆抗體；Western-blot分析結果顯示獲得的小鼠抗SU蛋白多克隆抗體可以與ENTV-2病毒抗原特異性結合，另外ELISA試驗也顯示不僅ENTV-2抗原可與抗SU多克隆抗體反應，SU抗原也可以與抗ENTV-2多克隆抗體反應，表明SU重組蛋白具有免疫原性。SU重組蛋白的表達為ENTV-2單克隆抗體的制備以及ELISA方法的建立奠定了基礎。

本研究中，ENTV-2抗原與1:4鼠抗SU多克隆抗體反應呈陽性，而與1:8鼠抗SU多克隆抗體不反應，說明筆者制備的抗SU重組蛋白抗體與ENTV-2反應原性較弱，可能與該蛋白在純化過程中變性后復性和重折疊不好，影響了蛋白的空間結構有關。下一步筆者將優化該SU重組蛋白的復性和重折疊方案，以改善其反應原性。