利用物種特異性PCR技術快速鑒定南瓜實蠅

黃 振，侯有明 ，郭瓊霞 ，陳韶萍,

（1. 福建農林大學植物保護學院，福建 福州 350002；2. 福州長樂機場海關，福建 福州 350209；3. 福州海關技術中心，福建 福州 350001）

0 引言

【研究意義】南瓜實蠅Bactrocera tau（Walker），屬雙翅目Diptera、實蠅科Tephritidae、果實蠅屬Bactrocera[1]，是我國進境植物檢疫性害蟲。卵、幼蟲、蛹能隨寄主如果蔬、土壤、包裝物等可進行遠距離傳播。南瓜實蠅食性雜、寄主廣，達16個科80余種[2]，主要危害南瓜、角瓜、絲瓜、黃瓜、葫蘆、苦瓜、桑椹、西瓜、菠蘿蜜、楊桃、芒果、番石榴、番茄、扁蒲、菜豆等瓜果植物，對葫蘆科植物危害尤為嚴重[3]。Walker1849年首次在中國報道[4]，目前主要報道分布在越南、緬甸、泰國、老撾、日本、柬埔寨、馬來西亞、菲律賓、新加坡、不丹、斯里蘭卡、印度、印度尼西亞等地[5?6]。國際果蔬貿易給南瓜實蠅的傳入傳播帶來了極大的潛在風險[7]，日常分類鑒定工作通常以成蟲外部形態特征作為分類鑒定依據，而日常檢疫中經常截獲幼蟲、卵或蛹，甚至翅、足等殘體，無法快速、準確鑒定，通常是在實驗室內飼養為成蟲后進行鑒定，耗時較長，嚴重影響果蔬進出口貿易的通關速度。因此，建立快速、特異、有效的PCR技術，對快速鑒定南瓜實蠅具有重要的現實意義。【前人研究進展】采用分子生物學的方法開展昆蟲種類鑒定，可以解決通過傳統形態特征不能進行實蠅種類鑒定的問題。越來越多的分子鑒定技術被運用于昆蟲的鑒定[8]。Mun等[9]應用限制性內切酶Apa I、Nhe I和Sac I，將南瓜實蠅、桔小實蠅和地中海實蠅等4種實蠅區分開來。吳佳教等[10]用PCR-RFLP技術對我國口岸截獲頻率較高的9種檢疫性實蠅開展了研究，用限制性內切酶MSE1和DRAI對PCR擴增產物進行酶切，用得到的酶切位點將供試的9種實蠅區分開來。張亮等[11]通過 RAPD 技術構建了南瓜實蠅、黑膝實蠅B. scutellaris等6種實蠅的指紋圖譜的分種鑒定。林麗莉等[12]應用RFLP技術，對我國部分地區發生分布的蜜柑大實蠅B. tsuneonis（Miyake）和橘大實蠅B. minax（Enderlein）開展鑒別研究。Chua等[13]采用RFLP技術成功地區分了洋桃實蠅和木瓜實蠅，進而使桔小實蠅復合種的有效識別得以實現。Kakouli等[14]用擴增片段長度多態性技術 AFLP進行了實蠅種類的檢測鑒定。然而，上述對實蠅的檢測鑒定技術各有優缺點，如 RFLP和RAPD技術具有需求DNA的量較少、基因的多態性豐富、對基因組的覆蓋范圍比較廣等優點；但RFLP技術由于操作繁瑣，需通過檢測內切酶識別位點上的變異，來進行昆蟲種間親緣關系和昆蟲種屬特異性鑒定，多態性檢出率低，而RAPD 技術的穩定性較差，對試驗環境因子變化較為敏感，擴增的產物可重復性、穩定性較低等，限制了RFLP和RAPD技術的廣泛應用[15]。雖然AFLP技術可以較好地彌補上述兩種技術方法的不足，但AFLP技術對檢測樣本DNA的質量要求較高，且所需設備的費用較為昂貴。因此，上述的檢測方法難以滿足口岸進出境果蔬貿易快速通關、準確鑒定及低成本的檢疫需求。因為mtDNA COⅠ基因相對保守，排列的順序比較穩定緊密，容易被通用引物擴增，又有足夠的特異性能將不同物種區分開，所以mtDNA COⅠ基因作為標記基因，為生物分類學提供了信息化的分類標準和有效的分類手段，成為目前昆蟲分類鑒定及昆蟲分子進化系統研究應用較多的基因之一，并被應用于實蠅近緣種的系統發育研究[16?18]。【本研究切入點】基于RAPD、AFLP、RFLP等技術在實際應用中表現的不足[19]，本試驗在前人利用COI標記鑒定技術的基礎上，利用mt DNA COI基因序列，篩選并設計種特異引物[20]，采用SS-PCR方法快速鑒定南瓜實蠅。【擬解決的關鍵問題】應用種特異性引物快速鑒定南瓜實蠅的方法，實現對口岸進境水果攜帶并截獲的疑似南瓜實蠅的卵、幼蟲、蛹、成蟲及成蟲殘體的快速鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

供試蟲樣：南瓜實蠅B. tau（Walker）、洋桃實蠅B. carambolae Drew & Hancock、瓜實蠅B. cucurbitae（Coquillett）、辣 椒 實 蠅B. latifrons（Hendel）、腿端黑實蠅B. atrifemur Drew & Hancock、番石榴果實蠅 B. correcta（Bezzi）、二 顏 帶 實 蠅 B. cilifera（Hendel）、桔小實蠅B. dorsalis（Hendel）、銹紅果實蠅B. rubigina（Wang & Zhao）、瘤脛實蠅B. tuberculata（Bezzi）、具條實蠅B. scutellata（Hendel）、何氏華實蠅B. hochii（Zia）、近黑顏實蠅B. parater（Zhao &Lin）、黑顏實蠅B. diaphora Coquillett、黑膝實蠅B.scutellaris（Bezzi）、滇寡鬃實蠅B. modica（Hardy）、瑞麗果實蠅B. ruiliensis Wang, Long et Zhang, sp. nov.、五指山實蠅B. wuzhishana Lin et Yang, sp. nov.、棗實蠅Carpomya vesuviana Costa、瓜棍腹實蠅Dacus longicornis Wiedemann等20種實蠅，其中除Bactrocera屬18種外，另有 Carpomya、Dacus2個屬的種類各1種。蟲樣來自口岸進境果蔬檢疫截獲、中國邊境監測、調查和誘捕的檢疫性實蠅種類。用于分子生物學鑒定試驗的實蠅標本，放置于4 ℃冰箱保存。

1.2 DNA提取和質量檢測

將20種實蠅蟲樣放置于2 mL的離心管中，加入適量液氮充分研磨，根據用OMEGA E.Z.N.A.TMInsect DNA Kit試劑盒的操作方法，對蟲樣進行基因組DNA的提取，并放置于?20℃冰箱保存備用。

DNA質量檢測采用上游引物LCO1490（堿基序列為：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′）和下游引物HCO2198（堿基序列為：5′-TAAACTTC AGGGTGACCAAAAAATCA-3′）的1對通用引物對20種實蠅蟲樣提取的基因組DNA進行質量檢測，在定量梯度PCR儀上進行PCR反應，電泳，凝膠成像，拍攝記錄質量檢測結果。

1.3 引物設計

通過數據庫（NCBI）查找已公布的南瓜實蠅的登錄序列，分析比較并選定登錄號為JN542420的線粒體mt DNA COⅠ基因序列，利用數據庫（NCBI）中提供的BLAST程序檢查同源序列，最終選定8種實蠅（表1）。

表 1 設計南瓜實蠅特異性引物所用實蠅種類及登錄號Table 1 Species and accession numbers of fruit flies used for designing B. tau-specific primers

應用數據庫下載FASTA格式，對表1中的8種實蠅序列進行序列比對，再根據SNP位點，利用Primer-Premier 5.0軟件進行人工設計引物，采用Oligo 6.44對設置的引物進行評定，最后應用數據庫（NCBI）中 的Primer-BLAST（BLAST：Basic Local Alignment Search Tool）DNA數據庫進行相似性比較分 析，檢查同源序列。

1.4 引物種特異性測試

測試南瓜實蠅引物的種特異性時，選取南瓜實蠅為陽性對照，其余的20種實蠅蟲樣為陰性對照，檢測驗證設計引物種特異性測試的反應體系和條件，電泳檢測，凝膠成像，查看有否擴增出預期大小 的目標片段，拍攝并記錄結果。

1.5 引物靈敏度測試

將提取南瓜實蠅的基因組DNA模板，按照10?1、10?2、10?3倍3種不同濃度稀釋，測試提取的南瓜實蠅DNA的稀釋濃度后的靈敏度。用設計的種特異性引物NF404和NR610進行PCR擴增，對DNA模板進行最低檢出閾值的測定，驗證本檢測方法的靈 敏度。

1.6 SS-PCR方法的應用與驗證

將福州長樂機場進境旅客攜帶果蔬中截獲的南瓜實蠅并飼養到成蟲，經過專家鑒定復核，收集幼蟲、蛹、成蟲、足、翅等17個蟲樣，按照本研究的SS-PCR方法，將提取的基因組DNA為模板，應用種特異性引物NF404和NR610進行PCR擴增，來驗證 該方法的穩定性與準確性。

2 結果與分析

2.1 DNA 質量檢測結果

采用1對LCO1490和HCO2198通用引物，對提取的20種實蠅蟲樣的基因組DNA模板進行PCR擴增，結果顯示所有的實蠅蟲樣的DNA均能擴增出一條單一整齊且清晰透明的，長度約700 bp的目標條帶（圖1）。

圖 1 利用LCO1490和HC02198 一對通用型引物對提取的實蠅DNA模板進行質量檢測的結果Fig. 1 Utilization of universal primers, LCO1490 and HC02198,for testing extracted DNA templates from fruit flies

2.2 特異性引物選擇

應用Bioedit對已下載的JN542420.1、HM561566.1、JN542417.1、AY530891.1、AF423105.1、JX855917.1、KF998674.1、KF318598.1等8種序列進行ClustalW多重比對，通過篩選最終選擇的種特異性引物NF′404和NR′610（圖2）。

圖 2 8種果實蠅的ClustalW多重比對的部分結果（種特異性引物NF’404和NR’610序列位置用橫線劃出）Fig. 2 Partial result of ClustalW multiple comparisons on 8 fruit flies

NF′404：5′-TGCCTCGACGATATTCTGACT-3′；

NR′610：5′-AACTGTGTTCAGCAGGTGGT-3′。

將NF′404和NR′610利用NCBI數據庫提供的Primer-BLAST程序檢查同源序列，最終將正向引物NF′404第6個堿基C轉換成T，第7個堿基G轉換成A，第8、19個堿基A轉換成G，確定出引物NF404和NR610。

篩選出NF404和NR610種特異性引物，由上海英濰捷基貿易有限公司合成。特異性引物NF404和NR610的序列分別為：

NF404：5′-TGCCTTAGCGATATTCTGGCT-3′；

NR610：5′-AACTGTGTTCAGCAGGTGGT-3′。

2.3 引物種特異性

選用篩選獲得的種特異性引物NF404和NR610進行擴增，結果表明：僅南瓜實蠅擴增出一條清晰透明且單一的約207 bp的條帶，其他20種實蠅種類樣本均未顯現目標條帶（圖3）。表明該試驗設計的NF404和NR610種特異性引物具有較強的特異性和穩定性。

上海英濰捷基貿易有限公司對本試驗將所得到的PCR產物進行測序，將序列提交NCBI數據庫進行相似性分析（BLAST），表明該段序列與數據庫中 的南瓜實蠅序列完全一致。

2.4 引物的靈敏度

應用核酸蛋白分析儀對提取的南瓜實蠅DNA模板的質量濃度進行測試，質量濃度為56.95 ng·μL?1。取3種不同濃度的DNA模版測定最低檢出閾值，結果表明：隨著模版質量濃度的降低，擴增出的條帶逐漸變淡，在質量濃度稀釋100倍后，仍可見較為明 顯條帶（圖4），說明本試驗方法靈敏度較高。

2.5 應用與驗證

采用SS-PCR快速鑒定技術對截獲的南瓜實蠅標

圖 3 引物NF404和NR610的種特異性驗證Fig. 3 Verification on species-specificity of primers, NF404 and NR610

圖 4 引物NF404和NR610的靈敏度驗證Fig. 4 Verification on sensitivity of primers, NF404 and NR610

本進行檢測驗證，取經復核鑒定的幼蟲、蛹、成蟲及成蟲的足、翅或部分殘體等17個樣品經過檢驗，均檢測有目標條帶（圖5），說明分子生物學鑒定結果與形態學鑒定結果一致，即基于mt DNA COⅠ基因建立的種特異性COⅠ引物具有很強的特異性，SS-PCR快速鑒定南瓜實蠅的方法可以應用于實際鑒定。

圖 5 SS-PCR快速鑒定南瓜實蠅的應用與驗證Fig. 5 Application and verification of SS-PCR for rapid identification of B. tau

3 討論

3.1 引物的特異性是快速準確鑒定的決定性因素

被選作分子標記的基因很多，但是COI（cytochrome oxidase I或coxI）基因被選為DNA條形碼的靶標基因，相對保守，種間變異大，容易被通用引物擴增，同時又有足夠的變異能夠將近緣種、近似種等分開。本試驗選用mt DNA COI作為標記基因，在基因庫中篩選查找南瓜實蠅已公布序列進行比對分析，設計引物NF404和NR610，用南瓜實蠅作為陽性對照，用其形態相近的3個果實蠅屬4個亞屬19種實蠅作為陰性對照，目標種能特異性并穩定地擴增出長度207 bp清晰且單一的目標條帶，其他實蠅種類均無條帶出現，表明設計引物的種特異性強，能夠鑒定南瓜實蠅。

3.2 SS-PCR檢測鑒定方法的實用性

采用SS-PCR檢測鑒定方法，不但可快速準確鑒定特異種類南瓜實蠅，而且可檢測到的DNA模板質量濃度的最低檢出閾值為5.695×10?3ng·μL?1。在口岸進境的多批果蔬的檢疫檢測時，對發現的不同蟲態目標實蠅（飼養到成蟲及經過專家形態鑒定復核），采用SS-PCR檢測鑒定方法，可在8 h之內快速準確鑒定特異種類南瓜實蠅。同時，本試驗建立種特異性引物PCR方法檢測南瓜實蠅的不同蟲態用時短、DNA用量少、靈敏度高、儀器設備簡單、鑒定準確率高，能夠滿足口岸檢驗檢疫高通量快速通關和快速準確的要求，而且本研究建立的方法對南瓜實蠅的卵或蟲體部分殘體均可檢測，不受實驗材料存活狀態的影響，檢測靈敏度高。因此，種特異引物 PCR方法在昆蟲的快速鑒定和近緣種區分上有著 廣泛的應用前景。

3.3 對線粒體基因組的研究有待于進一步加強

目前，線粒體基因組在實蠅科害蟲中的應用較少，僅有3屬 14種，在已公開發表的大多文獻中只描述了新測定物種的線粒體基因組序列及其特點。對于利用線粒體基因組在實蠅科害蟲中進行物種鑒定、種群溯源、分子進化等方面的研究尚未見報道。隨著測序技術的發展，獲得具有重要經濟意義的實蠅種類的線粒體基因組序列研究顯得極為迫切，所以對實蠅科昆蟲線粒體基因組的研究和應用需要進一步加強。