利用CRISPR/Cas9技術編輯BADH2-1/BADH2-2創制香米味道玉米新種質

張翔，史亞興，盧柏山，武瑩，劉亞，王元東，楊進孝，趙久然

北京市農林科學院玉米研究中心/玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室，北京 100097

0 引言

【研究意義】隨著消費水平的提高，香味這一品質性狀深受消費者的青睞。例如香米，由于其所具有的獨特香味，表現出更高的商品價值。玉米是中國第一大作物，但具有獨特香味的香型玉米品種或種質卻鮮有報道。因此，香型玉米品種的培育還有待進一步加強，發掘和創制新型優質香型玉米種質資源是其重要途徑。【前人研究進展】2-AP是重要的香味物質。已有研究表明，水稻香味基因位于第8染色體上，由1個隱性基因控制。BRADBURY等[1]研究最先發現，水稻香味是由編碼甜菜堿脫氫酶（betaine aldehyde dehydrogenase，BADH）的OsBADH2突變引起的。OsBADH2由15個外顯子和14個內含子組成，其蛋白包含503個氨基酸。在香米中，該基因在第7個外顯子產生了8 bp的缺失和3個SNP（此基因型被命名為badh2.1）。badh2.1的蛋白發生提前終止，OsBADH2原有功能喪失[1]。BADH2影響2-AP合成的機制雖然還沒有得到非常明確的解析，但一般認為，OsBADH2正常情況下會抑制2-AP的合成。這種抑制作用是通過消耗2-AP合成前體γ-氨基丁醛（γ-amino butyraldehyde，GABald）實現的。OsBADH2可以將 GABald轉化為 γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）。當OsBADH2無法發揮正常功能時，2-AP合成前體GABald發生積累，從而引起水稻體內2-AP的含量增加，使稻米具有香味[2-3]。除了水稻外，在大豆、高粱和黃瓜中，均發現了BADH2同源基因突變能夠產生的香型品種。香型大豆和黃瓜的BADH2由于SNP導致氨基酸變化[4-6]；香型高粱的BADH2發生1 444 bp的片段缺失[7]。在明確香味基因的基礎上，科研人員開始利用RNAi方法或基因組編輯技術抑制水稻BADH2的表達，進而實現香型種質的創制，大大提高了育種效率[8-10]。基因組編輯技術主要依賴人工內切核酸酶（sequence-specific nucleases，SSNs）及一系列功能模塊，在目標基因組區域進行堿基或DNA片段的缺失、插入及堿基替換等操作。繼鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）和轉錄激活因子樣效應因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）之后，CRISPR/Cas9核酸酶作為新一代基因編輯技術，具有簡單、高效等優點，迅速被成功應用于動物和植物中。DONG等[11]利用CRISPR/Cas9技術對玉米Sh2和Wx進行同時敲除，證明此方法可快速育成甜糯玉米品種；SHI等[12]利用CRISPR/Cas9對玉米內源基因ARGOS8的啟動子進行了編輯，提高了該基因的表達量，進而增加了玉米的耐旱性；ZHANG等[13]利用基因編輯技術敲除了玉米SD1，成功實現了對玉米株高的調節；SVITASHEV等[14]通過對玉米MS26和MS45的定點編輯，快速育成了玉米雄性不育材料。SHAN等[15]利用TALEN技術定點敲除OsBADH2，使稻米獲得香味性狀，實現了香米的快速精準創制。這些成功的基因編輯育種成果，充分證明了CRISPR/Cas9基因編輯技術在玉米和水稻定向遺傳改良中的高效性。【本研究切入點】目前，在玉米中尚未發現由BADH2突變產生的香型玉米材料。篩選自然變異及傳統的誘變方法存在不可預期性高、效率低及篩選工作量大等不足。【擬解決的關鍵問題】本研究以北京市農林科學院玉米研究中心自主選育而成的優良自交系京 724為研究材料，利用CRISPR/Cas9技術敲除玉米2個BADH2同源基因，進而獲得2-AP含量顯著升高的雙基因敲除突變株系，為香型玉米品種開發提供種質資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米自交系京 724[16]，由北京市農林科學院玉米研究中心自主選育而成，為玉米雜交品種京科968的母本。B104自交系由北京市農林科學院玉米研究中心保存。

1.2 BADH家族成員進化分析

利用Ensembl在線BLAST工具，將水稻OsBADH2（Os08g0424500）蛋白序列與擬南芥、水稻和玉米的蛋白序列庫進行比對。使用Clustal W對獲得的蛋白質序列進行多序列比對。從 UniProt數據庫獲得OsBADH2蛋白的結構域信息（UniProt ID：Q84LK3），結合多序列比對結果，剔除缺失BADH重要結構域的蛋白序列。最后，使用MEGA7進行進化分析。進化樹使用Neighbor-joining方法，檢驗方法選擇 bootstrap method，重復1 000次，置換模型選擇poisson model。

1.3 載體構建

骨架載體見電子附圖 1，在 WU等[17]報道的SpCas9n-pBE基礎骨架之上進行如下改造：（1）使用限制性內切酶KpnⅠ和HindⅢ將該骨架的表達盒1替換成prZmU6-2+tRNA+esgRNA+polyT（此序列由南京金斯瑞公司合成）。序列的兩端分別含有KpnⅠ和HindⅢ酶切位點，可從合成質粒直接酶切獲得該片段；esgRNA前含有2個相鄰的BsaⅠ酶切位點，后期用于連接靶點序列；（2）使用限制性內切酶SnaBⅠ和AscⅠ將表達盒 2中的 Cas9n&PmCDA1&UGI+t35s替換為Cas9+t35s，其中Cas9以Cas9n為模板，引入堿基突變，將氨基酸10A突變為10D；（3）使用限制性內切酶AscⅠ和AvrⅡ將表達盒3的prZmUbi1+hpt+ t35s替換為 prZmUbi1+PMI+tNos（PMI+tNos由南京金斯瑞公司合成）。載體構建所用引物見電子附表1。

利用CRISPR-GE[18]在線工具（http://skl.scau.edu.cn/）進行靶點設計。單靶點序列使用正反向引物退火、互補結合，使用T4連接酶連接到經BsaⅠ酶切的敲除骨架載體上，獲得最終的CRISPR/Cas9敲除載體，通過測序驗證后用于玉米遺傳轉化。

1.4 轉基因陽性植株的獲得

使用構建好的CRISPR/Cas9載體轉化農桿菌菌株EAH105，使用PMI特異引物PMI-F/PMI-R（電子附表 1）鑒定轉化陽性克隆。陽性農桿菌株轉化玉米自交系京724的愈傷組織[19]，用PMI篩選得到的再生組織培養玉米幼苗，即為T0植株。提取 T0植株的基因組DNA，用PMI特異引物PMI-F/PMI-R進行PCR擴增，能擴增出1.2 kb目的片段的植株即為T0轉基因陽性植株。所有T0轉基因陽性植株自交獲得T1種子。

1.5 靶位點突變檢測

為檢測靶位點的突變情況，分別在ZmBADH2-1及ZmBADH2-2的靶點兩側設計引物對，對T0轉基因陽性植株基因組 DNA進行 PCR擴增。ZmBADH2-1靶點擴增引物為BH2-1-F/BH2-1-R；ZmBADH2-2靶點擴增引物為 BH2-2-F/BH2-2-R（電子附表 1）。PCR產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳、割膠回收后進行 Sanger測序。測序峰圖在靶點附近位置出現雙峰的植株即為T0突變植株。使用R語言工具TIDE[20]對測序峰圖ab1文件進行分析，可獲得突變體植株靶點的突變類型（插入/缺失的堿基數量）；進一步使用 CRISPR-GE[18]中的DSDecodeM在線工具和R語言工具sangerseqR[21]可分析獲得突變體植株靶點具體的突變基因型。

1.6 香味物質2-AP含量測定

參照SHAN等[15]研究，分別取野生型對照京724和基因編輯突變體成熟種子各3 g，水稻品種日本晴和稻花香種子各2 g，碾磨成粉后測定香味物質2-AP含量。以 2,4,6-三甲基吡啶作為內標，每個材料 3個生物學重復。測定試驗由中國科學院遺傳與發育研究所代謝組學平臺完成。使用R語言對檢測結果進行分析，使用LSD進行多重比較，Bonferroni法進行P值校正。

2 結果

2.1 玉米基因組中含有2個BADH2同源基因

使用OsBADH2蛋白序列，與擬南芥、水稻和玉米的蛋白質序列庫進行比對，對所獲得的基因進行系統進化分析（圖1），結果顯示，玉米中有2個基因與水稻OsBADH2位于同一進化分支中，它們是Zm00001d050339和Zm00001d032257，在蛋白序列上分別與OsBADH2有90%和89%的同源性。將這兩個基因分別命名為ZmBADH2-1（Zm00001d050339）和ZmBADH2-2（Zm00001d032257）。ZmBADH2-1位于第4染色體，由15個外顯子組成，編碼505個氨基酸；ZmBADH2-2位于第1染色體，同樣具有15個外顯子，翻譯后的蛋白含有506個氨基酸（圖2-A）。通過MaizeGDB（www.maizegdb.org）中的玉米基因表達數據[22-23]，可以查詢到這兩個基因在玉米不同的組織中均有表達，且在種子中表達較高，推測二者可以影響種子中的2-AP含量。由于ZmBADH2-1和 ZmBADH2-2蛋白序列與 OsBADH2高度同源，且 2個基因的表達部位重合，因此，推測這兩個基因可能都具有類似 OsBADH2的生物學功能，存在功能冗余。

2.2 靶點設計

基于水稻中的研究得知，香味是隱性性狀。玉米2個 BADH2同源基因可能存在功能冗余，因此，需要將ZmBADH2-1和ZmBADH2-22個基因同時敲除，才可能夠獲得香型玉米突變體。根據CRISPR/Cas9技術的原理，結合京724中ZmBADH2-1和ZmBADH2-2的編碼區序列，設計一條20 bp特異性較好的sgRNA靶點序列 Target1。Target1同時位于ZmBADH2-1和ZmBADH2-2的第 4個外顯子上（圖 2-A），含有該sgRNA的 CRISPR/Cas9載體可以同時在這兩個基因中引入缺失/插入突變。已有研究表明水稻OsBADH2在第7個外顯子產生了8 bp的缺失，導致蛋白序列提前終止，基因功能喪失，產生香米[1]。因此，推斷京724中ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同時在第4個外顯子上產生突變，導致 ZmBADH2s蛋白提前終止或氨基酸缺失，更有可能使得基因功能喪失，進而產生香味性狀。

2.3 T0陽性植株目標基因靶點序列突變類型分析

將含有目標 CRISPR/Cas9載體的農桿菌轉化京 724的愈傷組織，獲得 28株 T0陽性植株。對ZmBADH2-1和ZmBADH2-2Target1靶點上下游區域進行擴增后測序，結果顯示，有10株T0陽性植株中ZmBADH2-1和ZmBADH2-2均發生突變。在這些突變體中，2個ZmBADH2s的靶點都發生了編輯。進一步對測序結果分析發現，10個突變體的ZmBADH2-1和ZmBADH2-2靶點區域均產生了雙等位或多等位突變，突變類型包括堿基缺失、堿基插入及堿基替換（圖2-B）。所有這些突變導致ZmBADH-1和ZmBADH-2蛋白序列提前終止或氨基酸缺失等變化（電子附圖2）。

2.4 基因編輯株系香味物質2-AP的含量測定

10個ZmBADH2-1/ZmBADH2-2共敲除突變體T1種子均表現出嗅覺可辨的明顯香味，暗示T0靶基因突變穩定遺傳到T1種子中，且基因功能喪失。隨機選擇BH02、BH06、BH11和BH13 4個基因編輯株系的T1種子（電子附圖3），用于進一步檢測種子中2-AP的含量。對這4個編輯株系T1植株的靶點進行PCR擴增后測序，結果顯示，T0產生的基因突變穩定遺傳至T1代，因此，推測這些 T0自交獲得的 T1種子中，2個基因都產生了功能缺失或弱化，籽粒中 2-AP含量升高，產生香味。

為了明確玉米突變體株系 T1種子中是否存在香稻中同樣成分的2-AP，選擇香稻品種稻花香種子作為對照。由圖3-A可見，稻花香種子中的2-AP可以獲得有效分離，保留時間約為8.3 min。2-AP質譜圖顯示，其分子離子峰m/z111，特征碎片峰m/z68和83等與已有研究結果一致[24]（圖3-B）。在BH02株系中，同一時間內獲取的質譜結果與稻花香中 2-AP質譜圖一致（圖 3-B和圖 3-C），說明玉米ZmBADH2雙基因敲除突變體籽粒中存在與香稻同樣成分的2-AP。

含量測定結果顯示，京724對照中未檢測到2-AP，4個基因編輯株系的2-AP含量均高于京724野生型對照品種（P＜0.01，圖4）。其中，BH06中的2-AP含量最高，為438.29 μg·kg-1；BH02和BH11次之，分別為404.63和348.65 μg·kg-1（圖4-B）。因此，利用基因編輯技術使玉米2個BADH2同源基因發生突變，可獲得香味性狀改良的玉米種質材料。

3 討論

香味是提升作物品質的一個重要性狀，是品質改良的重要內容之一，具有香味的作物品種深受消費者青睞。例如香米的種植及選育，不但歷史悠久，而且成果頗豐，各國均有香稻種植。著名的香米品種在國內有東北的稻花香，國外有印度的Basmati、泰國的茉莉香型香米等[25]。這些香稻品種都具有很高的經濟價值。香稻的種質資源極其豐富，極大地方便了香稻選育。玉米是世界上最重要的食糧之一，現今全世界約有三分之一人口以玉米作為主要食糧。隨著玉米育種及配套加工產業的發展，玉米的食用品質不斷改善，鮮食玉米和新的玉米食品如玉米片、玉米面、玉米渣、速食玉米等產品，在國內外市場上很受歡迎。如果能在現有玉米品種中加入香味性狀，在滿足消費者對高品質玉米相關產品需求的基礎上，更可以產生巨大的經濟附加值。然而在玉米中卻一直沒有發現具有獨特香味的玉米種質，也沒有香型玉米品種育成的報道。基因編輯技術在水稻、小麥、玉米和大豆等作物中的應用[12-13,26-30]，顯示出該技術在性狀定向遺傳改良方面更加高效。本研究通過基因編輯技術，創制出了新的玉米香型材料。與編輯前的材料相比，香型玉米材料種子中2-AP含量明顯提高（圖 4），同時具有明顯的香味。此突變體材料為香型玉米育種提供了重要的種質基礎。

水稻、黃瓜和高粱等物種的BADH2突變，都可以產生相應的香型種質。通過敲除玉米BADH同源基因可提高香味物質 2-AP含量（圖 4），說明玉米中BADH2也是控制香味性狀的關鍵基因。基于這些研究結果，進一步推測該基因影響 2-AP合成的機制可能在很多單、雙子葉作物中都是類似的。因此，通過基因編輯技術敲除BADH2同源基因創制香型種質的策略可能是通用的，即其他作物，例如小麥中，也同樣有可能創制、培育出新的香型種質或品種，進而加速香型品種的培育速度。

在水稻等物種中，一個BADH2突變即可產生香味突變體。而玉米中的情況則有所不同。前期工作中，在玉米自交系B104中獲得ZmBADH2-2的單基因敲除突變體。由于第一外顯子上發生堿基的插入和缺失，ZmBADH2-2編碼區序列產生了移碼（電子附圖4-B）。但BH-2-3和BH-2-4這兩個ZmBADH2-2單基因編輯株系的 T2籽粒，并沒有表現出明顯的嗅覺可辨的香味，也沒有檢測到2-AP的存在（電子附圖4-C），單獨敲除ZmBADH2-2未能創制出香味玉米新種質。本研究中發現，在玉米中存在2個玉米BADH2同源基因（圖 1）。考慮到2個ZmBADH2s間蛋白同源性非常高（97%），因此推斷ZmBADH2-1單獨敲除后，能夠產生香味的可能性非常低。但ZmBADH2-1單獨敲除，究竟是與ZmBADH2-2單獨敲除一樣無香味產生，還是有香味產生，亦或是ZmBADH2-1發揮主要作用，需要進一步的試驗證明。由于BADH2控制的香味性狀為隱性，如果獲得香型玉米材料，必須2個玉米BADH2同時發生功能缺失突變，且同時純合，這將大大增加通過常規手段獲得香型玉米種質的難度，這可能也是到目前為止尚未有香味玉米種質材料報道的原因。基于此，通過基因編輯技術對2個基因同時進行定點突變是獲得香型玉米種質的一種高效途徑。

基因突變對農藝性狀的影響對生產實踐來說至關重要。本研究中，從 T1種子來看，目前并未觀察到ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同時突變對玉米種子性狀有不利的影響（電子附圖 3）。為了對玉米這兩個基因同時突變是否影響玉米其他的農藝性狀進行更準確地評價，后續需要進行1—2代的繁種，并開展較大規模的田間試驗。

CRISPR/Cas9引發的突變具有一定的隨機性，對于一個特定靶點的編輯會產生一系列不同的等位突變。同一基因相同靶點的不同突變形式，在性狀表現上可能會出現一定的差異。SHAN等[15]在香米突變體創制時發現，同一靶點的3種等位突變間，2-AP含量變化幅度可達20%—50%。本研究中，2個ZmBADH2同源基因在 10個編輯株系中分別獲得了多種不同的突變類型，其中ZmBADH2-1包含有 21種，ZmBADH2-2有18種（圖2），而這些株系間，種子中2-AP的含量也存在顯著差異。BH13的2-AP含量（161.82 μg·kg-1）最低，可能是由于 BH785的ZmBADH2-2中存在一個缺失3 bp的非移碼突變，部分T1種子ZmBADH2s蛋白功能缺失不完全，或者僅僅是蛋白功能弱化所引起的。后續的育種過程中，可以進一步篩選不同的突變形式，以獲得不同香味梯度、滿足不同需求的基因型組合。此外，未來還可以將香味性狀與甜、糯等性狀進行組合，培育出食用品質更佳的新型玉米品種。

4 結論

利用 CRISPR/Cas9基因編輯技術，可對玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-22個香味同源基因進行同時定點突變，雙突變體籽粒中香味物質 2-AP含量顯著高于對照京 724。基因編輯可創制全新的香型玉米種質，快速實現玉米香味性狀的定向改良。