綠盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆、抗體制備及在蛻皮激素誘導下的應答

譚永安，趙旭東，姜義平，趙靜，肖留斌?，郝德君?

1江蘇省農業科學院植物保護研究所，南京 210014；2南京林業大學南方現代林業協同創新中心/林學院，南京 210037

0 引言

【研究意義】綠盲蝽（Apolyguslucorum）屬半翅目（Hemiptera）盲蝽科（Miridae），寄主范圍廣泛，可危害棉花等多種經濟作物[1-2]。20世紀90年代末以來，由于Bt棉的大面積推廣種植和農業產業結構的調整，綠盲蝽種群數量急劇上升，已成為棉田主要害蟲，并迅速波及棗樹、葡萄、櫻桃、桃等多種果樹，嚴重影響其產量及品質。生產上對化學農藥的長期依賴勢必會導致綠盲蝽的抗藥性日漸增強，從而造成防治效果下降[3-4]。因此，目前綠盲蝽防控面臨嚴峻挑戰，亟需開拓基于新靶標的有效防控技術?！厩叭搜芯窟M展】雷帕霉素靶蛋白 （target of rapamycin，TOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細胞代謝、生長及增殖方面至關重要[5-6]。TOR可分為TOR復合物1（TOR complex 1，TORC1）和 TOR 復合物 2（TOR complex 2，TORC2）。TORC1是 TOR與 RapTOR（regulatory associated protein of mTOR）及mLST8（mammalian lethal with Sec13 protein 8）形成的一個對雷帕霉素敏感的復合物，可調控細胞內蛋白質翻譯、細胞凋亡及細胞周期等關鍵生理過程[7-8]。TORC2是由 RicTOR（rapamycin insensitive cornpanion of mTOR）、Sinl（也稱為 Mip1）與 mLST8、mTOR共同形成的對雷帕霉素不敏感的復合物，通過調控蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）和蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）的活化，主要參與細胞極性、空間及骨架結構的形成[9]。在昆蟲中，TOR可通過直接耦合前胸腺中的營養感應，從而在蛻皮激素（20E）生成及蛻皮過程中發揮重要作用[10-11]。研究表明，抑制 TOR的表達可造成幼蟲發育歷期延長，同時與蛻皮激素合成相關基因的表達量下調，表明昆蟲在生長發育以及蛻皮變態時需要TOR的參與；此外，在幼蟲營養缺乏的條件下，TOR信號的激活會誘導蛻皮激素的生成，使幼蟲完成正常蛻皮及變態行為[12]。TOR信號也可受蛻皮激素的調控[13-14]。對黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster）的研究發現，當幼蟲攝入營養時，蛻皮激素抑制TOR信號介導調控胰島素樣肽（ILP）生成胰島素分泌細胞來調控果蠅的生長發育[15-16]?！颈狙芯壳腥朦c】目前對于TOR的研究多集中在植物、哺乳動物及一些模式昆蟲上[17-19]，對綠盲蝽AlTOR的相關研究尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】采用RACE技術從綠盲蝽中擴增AlTOR全長，運用生物信息學方法對該基因進行結構分析和同源進化分析，并利用qRT-PCR闡明其時空表達動態及20E對其表達的影響，同時將其在原核細胞中進行高效表達，篩選最佳表達條件，以獲得純化蛋白，最后制備特異性的抗體，為在蛋白水平進一步研究該基因的功能打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2018年9月至2019年12月在江蘇省農業科學院植物保護研究所完成。

1.1 供試昆蟲

綠盲蝽于 2018年采自江蘇沿海棉區的大豐市蠶豆田（33.11°N，120.25°E），室內用新鮮四季豆（Phaseolusvulgaris）續代飼養，飼養條件為溫度（27±0.5）℃，相對濕度（70±5）%，光周期 14L∶10D。

1.2 主要試劑及儀器

RNA提取試劑盒（Promega），M-MLV反轉錄試劑盒（Promega），BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（寶生物工程（大連）有限公司），pCzn1表達載體、PFU DNA聚合酶（南京鐘鼎生物技術有限公司），TOP10菌株（天根生化科技有限公司），大腸桿菌（Escherichiacoli）Arctic Express（DE3）（Agilent）；卡那霉素、咪唑、尿素（上海生工生物工程有限公司）；限制性內切酶（TaKaRa），Protein Marker（Thermo），IPTG、Acr、Bis、Tris（Sigma），SDS（Amresco），TEMED（BIO-RAD），高糖、Tyrptone、Yeast Extract（OXOID），Agarose（上海賽百盛基因技術有限公司）；其他試劑均為國產分析純。Ni2+IDA親和層析膠（Novagen），HexIOS分光光度計、Allegra 21R臺式高速冷凍離心機（Beckman），臺式高速離心機（Sorval），Biologic LP層析系統、Mini Protean II垂直平板電泳系統、水平電泳系統（BIO-RAD），PTC-200基因擴增儀（MJ Research），20E、U73211（Sigma）。

1.3 AlTOR全長基因的克隆

基于實驗室構建的綠盲蝽轉錄組數據及已報道昆蟲TOR進行BLAST搜索，篩選綠盲蝽轉錄組中可能的TOR基因片段序列，從而進行克隆驗證。根據獲得的序列設計特異性引物（表1），進行AlTOR5′和3′端序列的克隆。取綠盲蝽3齡若蟲20頭，Trizol法提取總RNA后合成cDNA第1鏈，根據設計的特異性上游引物和下游引物，進行AlTOR5′和3′端序列的克隆。5′端序列的克隆采用巢式PCR，第一輪反應體系：10×PCR 緩沖液 5.0 μL、25 mmol·L-1MgCl23.0 μL、10 mmol·L-1dNTP Mix 1.0 μL、10 μmol·L-15′-AlTOR-1 2.0 μL、10 μmol·L-1通用引物 Abridged Anchor Primer 2.0 μL、cDNA 5.0 μL、Taq DNA 聚合酶 0.5 U，超純水補足至50.0 μL；第二輪反應體系：10×PCR緩沖液 5.0 μL、25 mmol·L-1MgCl23.0 μL、10 mmol·L-1dNTP Mix 1.0 μL、10 μmol·L-15′-AlTOR-2 1.0 μL、10 μmol·L-1通用引物 Abridged Universal Amplification Primer 1.0 μL、第一輪 PCR 產物 5.0 μL、Taq DNA聚合酶0.5 U，超純水補足至50.0 μL；PCR反應條件：預變性 94℃ 2 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循環35次，72℃延伸7 min。3′端序列的克隆也采用巢式PCR，第一輪反應體系：PCR-Grade Water 34.5 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 5.0 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 1.0 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL，cDNA 2.5 μL，10 μmol·L-13′-AlTOR-1 1.0 μL，10×UPM 5.0 μL，超純水補足至50.0 μL；第二輪反應體系：PCR-Grade Water 34.5 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 5.0 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 1.0 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL，第一輪 PCR 產物 2.5 μL，10 μmol·L-13′-AlTOR-2 1.0 μL，10×UPM 5.0 μL，超純水補足至50.0 μL；PCR 反應條件：預變性 94℃ 2 min，94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 1 min，循環30次，72℃延伸7 min。將獲得的5′和3′端及保守區域進行拼接和測序（上海生工生物工程有限公司），最終獲得AlTOR全長。最后根據測序結果，設計全長基因克隆引物（AlTOR-F和AlTOR-R），進行AlTOR全長基因的克隆。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 AlTOR時空表達定量檢測

收集綠盲蝽不同日齡若蟲及羽化7 d后雌成蟲的不同組織（頭、胸、翅、足、中腸、卵巢和脂肪體）。其中不同日齡樣本每個處理15頭，不同組織樣本每個處理10頭雌成蟲，并設計3個生物學重復，每個生物學重復設置3個技術重復。液氮處理樣品后-80℃冰箱保存備用。Trizol法提取總RNA，Prime ScriptTMRT Master Mix反轉錄合成cDNA，-20℃保存。qRT-PCR試驗步驟按照SYBR Premix Ex Taq Kit說明書上進行。所用的AlTOR引物參見表1，并以綠盲蝽持家基因β-actin為內標對照基因[20]（GenBank登錄號：JN616391）。擴增體系：UltraSYBR Mix 12.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 2 μL，ddH2O 9.5 μL；擴增條件：95℃預變性5 min，然后95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，循環40次。

1.5 20E處理綠盲蝽若蟲

分別用 20E（2 μmol·L-1）、U73122（20E 抑制劑[21]，50 μmol·L-1）、20E+U73122 處理、乙醇（CK）浸泡切除兩端的四季豆1 min，晾干后飼喂初孵1齡若蟲。每處理綠盲蝽400頭，重復4次。按1.4方法收集綠盲蝽不同發育階段和不同組織樣本后，分析不同處理AlTOR表達量。

1.6 AlTOR序列分析與進化樹分析

AlTOR核苷酸序列分析使用 Expasy在線程序（http://web.expasy.org/compute_pi/）進行預測分析，蛋白結構域分析運用SMART在線分析（http://smart.embl-heidelberg.de/）；氨基酸序列比對軟件使用ClustalX進行；利用 MEGA 6.0軟件包中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建進化樹，并1 000次重復構建。

1.7 AlTOR在大腸桿菌中的表達

使用 DNASTAR-Protean軟件分析 AlTOR蛋白Antigenic index，選取抗原性較好的區域（72—381，蛋白質理論分子量為35.83 kD）作為免疫原區域，使用原核表達獲得抗原蛋白?；?PAS（PCR-based accurate synthesis）的方法，在引物的兩端各設計保護性堿基合成基因6731-2S，將其連入pCzn1重組質粒用限制性內切酶EcoR I及XhoI雙酶切后進行連接。酶切體系：兩種限制性內切酶各0.25 μL，10×Buffer緩沖液1.0 μL，帶有合適酶切位點的基因片段3 μL，用ddH2O補足至10 μL，37℃水浴3 h。連接體系：酶切回收后的載體5.0 μL，基因片段10.0 μL，T4 DNA連接酶 1.0 μL，10×Buffer緩沖液 2.0 μL，用 ddH2O補足至20 μL，16℃反應12—16 h。

連接產物轉化大腸桿菌TOP10后采用PCR篩選陽性克隆。將鑒定正確的重組質粒pCzn1-AlTOR轉化到大腸桿菌Arctic Express感受態細胞，具體方法：將質粒1 μL加入100 μL感受態細菌中，置冰上20 min；42℃熱激90 s，迅速置冰中5 min，加入600 μL LB培養液；37℃，220 r/min振搖1 h，離心后全部涂布于含50 μg·mL-1Amp的LB平板，37℃倒置培養過夜。挑取轉化平板上的多克隆接種于含50 μg·mL-1Amp的3 mL LB培養液的試管中，37℃ 220 r/min振搖過夜。次日按1∶100接種于50 μg·mL-1Amp的30 mL LB培養液中，37℃ 220 r/min 振搖至菌體 OD600為 0.6—0.8。取出1 mL培養物，10 000 r/min室溫離心2 min，棄上清，用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀。向剩余的培養物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1，20℃ 220 r/min振搖過夜，誘導融合蛋白表達。取出1 mL培養物，10 000 r/min室溫離心2 min，棄上清，用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀。剩余培養物4 000 r/min，離心10 min，棄上清，用PBS重懸菌體沉淀；重懸液進行超聲波破碎后，分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸。12% SDS-PAGE檢測分析，考馬斯亮藍染色顯帶。

1.8 包涵體蛋白的變性和復性

先將菌體沉淀重懸于20 mL裂解液（20 mmol·L-1Tris-HCl containing 1 mmol·L-1PMSF，pH 8.0）中，超聲破碎（功率400 W，工作4 s，間歇8 s，共20 min），收集沉淀。使用包涵體洗滌液（20 mmol·L-1Tris，1 mmol·L-1EDTA，2 mol·L-1尿素，1 mol·L-1NaCl，1%Triton X-100，pH 8.0）洗滌包涵體3次。再使用溶解緩沖液（20 mmol·L-1Tris，5 mmol·L-1DTT，8 mol·L-1尿素，pH 8.0），溶解包涵體，4℃過夜。室溫，10 000 r/min離心 15 min，將上述溶液滴加緩沖液（20 mmol·L-1Tris-HCl，0.15 mol·L-1NaCl，pH 8.0），逐步成倍梯度稀釋緩慢攪拌，將蛋白溶液裝入透析袋于上述緩沖液中透析過夜。

1.9 融合蛋白的Ni柱親和純化

利用低壓層析系統，包涵體溶液以 0.5 mL·min-1流速上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱，Ni-IDA Binding-Buffer以 0.5 mL·min-1流速沖洗，至流出液 OD280值到達基線，再用Ni-IDA Washing-Buffer（ 20 mmol·L-1Tris-HCl，20 mmol·L-1咪唑，0.15 mol·L-1NaCl，pH 8.0）以1 mL·min-1流速沖洗，至流出液OD280值到達基線；用 Ni-IDA Elution-Buffer（20 mmol·L-1Tris-HCl，250 mmol·L-1咪唑，0.15 mol·L-1NaCl，pH 8.0）以1 mL·min-1流速洗脫目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用Ni-IDA Elution-Buffer進行透析過夜；12% SDS-PAGE分析后利用BSA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.10 AlTOR多克隆抗體的制備

取純化的AlTOR重組蛋白免疫新西蘭白兔 （江蘇省農業科學院獸醫研究所提供）。皮下注射，每次免疫量為400 μg，2—3周免疫一次，共免疫4次。第4次免疫后在大白兔頸動脈采血，8 000 r/min離心8 min所得上清制備抗血清并準備純化抗體。TOR蛋白與瓊脂糖介質偶聯制備成抗原親和純化層析柱，將PBS與所得抗血清等量混合后緩慢上樣，待抗體抗原結合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫得到所需純化抗體，并在PBS緩沖液 （pH 7.4）中進行透析過夜（4℃），隔日進行效價測定，BCA濃度測定試劑盒對所得抗體進行濃度測定。

1.11 效價測定

間接 ELISA法對抗體進行效價測定。以純化的AlTOR重組蛋白（5 g·mL-1）包被ELISA板，每孔加入 100 mL，4℃過夜。用 PBST（0.2 g KCl，0.2 g KH2PO4，2.9 g NaHPO4·12H2O，8 g NaC1，0.05%Tween-20，pH 7.4）洗滌3次，加入PBST封閉液（含5%牛血清白蛋白）于37℃封閉2 h。取出酶標板，棄去內液，用PBST洗板3次，加入用PBST連續倍比稀釋的AlTOR多克隆抗體和陰性血清每孔100 μL，37℃恒溫箱1 h。同上洗滌后，加入100 μL的用PBST以1∶5 000稀釋的二抗HRP-IgG，37℃放置1 h。用PBST洗板3次，每次5 min，最后加100 μL TMB底物液顯色，37℃顯色15 min，待終止反應后，酶標儀測定A450值。

1.12 AlTOR多克隆抗體的鑒定

檢測多克隆抗體的特異性Western blot測定按照SONG等[22]的方法進行并稍作修改。將原核表達的AlTOR重組蛋白及 3齡綠盲蝽若蟲總蛋白進行SDS-PAGE分析。轉印PVDF膜后封閉，一抗為上述制備的蛋白抗體，二抗為辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠HRP。

1.13 數據分析

不同處理的AlTOR相對表達量變化以 2-ΔΔCt[23]計算。差異顯著性采用統計軟件 SAS 8.0中的 Duncan氏新復極差法進行分析。

2 結果

2.1 AlTOR的克隆及序列分析

利用綠盲蝽轉錄組篩選AlTOR基因序列，再利用 RACE方法，分別進行 5′和 3′末端的擴增，獲得了AlTOR的全長序列（圖1）。序列分析結果表明，AlTOR全長1 652 bp，包括一個208 bp的5′非翻譯區以及136 bp的3′端非翻譯區。AlTOR開放閱讀框含有1 308 bp的核苷酸，編碼435個氨基酸，理論等電點預測為7.16。結構域分析表明，AlTOR基因翻譯后的氨基酸序列具有典型的 TOR特征，含有 N-末端的SIN1結構域（288 bp）、高度保守的CRIM結構域（390 bp）及脂質與膜結合相關C-末端的PH域（363 bp）（圖2）。

2.2 多重聯比及進化樹分析

多重聯比結果如圖3所示，TOR在半翅目昆蟲中較為保守，尤其是CRIM結構域，AlTOR的氨基酸序列與半翅目臭蟲科溫帶臭蟲（Cimexlectularius）以及蝽科茶翅蝽（Halyomorphahalys）的TOR氨基酸序列一致性相對較高，分別為 55.78%和 54.38%，與其他昆蟲的TOR基因序列一致性較低，如膜翅目的造紙胡蜂（Polistesdominula）（38.70%）及蕪菁葉蜂（Athalia rosae）（39.33%）。

利用MEGA 6.0軟件NJ法構建了包括綠盲蝽在內的5個目20種昆蟲TOR的系統進化樹（圖4）。結果顯示，TOR作為高度保守的蛋白，在種間同源性較高；外聚群中，膜翅目、鱗翅目、蜚蠊目、纓翅目中聚類更為接近，屬于同一類分支。半翅目中，綠盲蝽與溫帶臭蟲、茶翅蝽同源性較高，親緣關系較為接近；與蚜蟲位于不同分支，同源性遠低于同為半翅目的溫帶臭蟲和茶翅蝽。

2.3 AlTOR在綠盲蝽不同發育階段及組織中的表達

AlTOR在綠盲蝽1—16日齡蟲體中均有表達，表達量呈現波動式下降趨勢，其中在初孵若蟲（1日齡）表達量最高，8日齡若蟲表達量最低，此外，AlTOR在綠盲蝽各齡期蛻皮時表達量顯著升高（圖5）。AlTOR在綠盲蝽雌成蟲各組織中均有表達，其中在卵巢、中腸和脂肪體中高表達，而在頭、胸、足中表達量較低，AlTOR的表達具有組織特異性（圖6）。

2.4 不同處理對AlTOR相對表達量的影響

與CK（乙醇）相比，當綠盲蝽分別發育至1齡蛻皮及2齡蛻皮時（4 d和6 d），20E顯著上調AlTOR的表達；U73122處理后，AlTOR的表達呈現先上升后下降的趨勢；此外，20E+U73122混合處理后，AlTOR的表達總體變化不大（圖7）。與CK（乙醇）相比，20E處理綠盲蝽雌成蟲后，各組織中AlTOR表達均顯著上調，其中頭、翅、卵巢和脂肪體中基因表達量分別顯著提高了200.00%、118.89%、20.53%和60.82%；而當 U73122處理后，綠盲蝽雌成蟲的頭、翅和足中AlTOR顯著上調，中腸、卵巢和脂肪體中AlTOR表達量則下調（圖8）。

2.5 重組蛋白AlTOR的表達、復性及純化

重組質粒命名為pCzn1-AlTOR。隨后將其轉化至大腸桿菌Arctic Express(DE3)表達菌株中，經0.5 mmol·L-1IPTG 20℃誘導 12 h 后，12% SDS-PAGE檢測分析發現，pCzn1-AlTOR重組質粒表達一個約36 kD的蛋白（圖9-A）。而不經IPTG誘導的重組質粒無此蛋白表達，說明AlTOR可在大腸桿菌細胞中誘導表達。但誘導表達的pCzn1-AlTOR表達蛋白均分布在沉淀體中，上清液中幾乎沒有，說明pCzn1-AlTOR表達蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體經體外溶解、復性后，利用SDS-PAGE電泳分析pCzn1-AlTOR表達蛋白的純化情況。用含 20 mmol·L-1咪唑的緩沖液洗脫包涵體，進一步復性和純化后在36 kD附近僅出現一條明顯的特異性條帶未見其他條帶，說明已得到純化的靶蛋白（圖 9-B）。采用蛋白定量試劑盒測定該蛋白的濃度為 0.2 mg·mL-1，SDS-PAGE電泳檢測該抗體的純度達到85%以上，并最終獲得了5.46 mg抗體，可以進行后續多克隆抗體制備工作。

2.6 AlTOR蛋白多克隆抗體的特異性鑒定

新西蘭白兔經3次免疫后，用間接ELISA法檢測多克隆抗體的效價。AlTOR多克隆抗體和陰性血清（免疫前健康兔血清）按500×20—500×210連續倍比稀釋。結果表明當AlTOR抗體稀釋5 120倍時，OD陽性/OD陰性＞2.0，其終效價可達1∶512 000。用制備的多克隆抗體分別檢測原核表達的 AlTOR重組蛋白及剛蛻皮的綠盲蝽3齡若蟲，Western blot分析表明，所制備的多克隆抗體不僅能與綠盲蝽總蛋白結合，還可特異性與AlTOR重組蛋白反應（圖10），且條帶大小與預測的蛋白質大小一致，說明制備的AlTOR多克隆抗體準確、有效。

3 討論

TOR是一類進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶，是真核細胞響應環境信號調控生長和代謝的關鍵因子[6]。自TOR蛋白在酵母細胞發現后，在其他真菌、昆蟲、植物以及哺乳動物中也相繼被發現。TOR信號通路高度保守，對有機體自身生長和發展至關重要[24]。研究發現，植物、蠕蟲、果蠅以及哺乳動物細胞中有一個TOR編碼基因，而釀酒酵母中存在兩個TOR編碼基因[25]。TOR在細胞生長的營養調控中能通過激活下游信號通路，介導4E-BP1、S6K、eEF2等一系列翻譯調節因子的磷酸化作用傳遞外界營養狀況、生長因子等生長刺激信號，從而調節細胞內核糖體的發生及蛋白質的合成，進而綜合調控細胞的生長與增殖[24]。另外，TOR還可參與調節真核細胞中mRNA和蛋白質的穩定性、細胞大小等與細胞生長密切相關的生理過程[26-28]。

本研究通過篩選綠盲蝽轉錄組數據，RACE法獲得了AlTOR的全長基因序列。序列分析結果表明，AlTOR的開放閱讀框含有1 308 bp的核苷酸，編碼435個氨基酸。多序列比對結果顯示與其他半翅目昆蟲TOR的氨基酸序列一致性在 40%—60%，含有 TOR作用靶標相關的SIN1結構域、CRIM結構域以及PH結構域。SIN1結構域是哺乳動物mSIN1的同源物，也是TOR作用的靶標之一，在信號轉導過程中起著重要的作用。CRIM結構域位于TOR蛋白的中間位置，對TOR識別底物有著重要作用；另外CRIM結構域不論是在酵母細胞還是哺乳動物體內都高度保守。PH結構域同樣也十分保守，其主要與脂質與膜結合相關[28]。進化樹結果顯示半翅目、膜翅目、鱗翅目等昆蟲的TOR較為分化，位于不同的分支上。分化的原因可能這些目昆蟲種類繁多、變態類型及由于不同的自然選擇壓造成的，如膜翅目、鱗翅目類昆蟲是完全變態類昆蟲，而半翅目昆蟲屬于不完全變態類昆蟲。

TOR是昆蟲體內營養信號的中心，通過氨基酸（AA）作為其調節因子，對外界攝入營養進行感知。AA/TOR途徑廣泛存在于真核細胞中，如酵母細胞。研究表明，除了調控葡萄糖的合成，TOR還可以通過氨基酸控制類胰島素樣肽的合成以及分泌。在果蠅成蟲中，胰島素樣肽的分泌是由脂肪體產生的未配對細胞因子2（cytokine unpaired 2）遠程調控從而響應營養信號[15,29]。由此可見，由TOR發出的氨基酸信號代表著營養信號的第一階段，特別是對于需要蛋白質來啟動產卵的昆蟲而言[30]。此外，TOR信號還參與雌性昆蟲生殖產卵，其作為營養信號的中心為雌蟲生殖以及產卵提供充足的能量供給[12]。本研究發現，AlTOR在1—16日齡綠盲蝽中均有表達，表達量呈現波動式下降趨勢，以初孵若蟲（1日齡）中表達量最高；此外AlTOR在綠盲蝽雌成蟲各組織中均有表達，其中卵巢、中腸及脂肪體中高表達，表明AlTOR的表達存在組織和時空特異性。研究表明，雌性昆蟲的生殖需營養及能量資源的投入，在大多數昆蟲中，營養的攝取是啟動卵發育的關鍵觸發因素。而AA/TOR途徑和胰島素途徑作為營養傳感器，在昆蟲繁殖中起著至關重要的作用，影響生殖組織形成并調控JH和20E的生物合成[31-33]。TOR可刺激卵黃原蛋白在脂肪體的合成并激活卵發育；相反地，TOR途徑的失活會導致繁殖受到抑制。在埃及伊蚊（Aedesaegypti）以及褐飛虱（Nilaparvatalugens）中，通過雷帕霉素抑制TOR蛋白質的合成以及RNAi介導的TOR基因沉默都會抑制卵黃原蛋白的表達，從而導致生殖力的降低[34-35]。在本研究中，AlTOR在若蟲蛻皮期以及成蟲羽化期表達水平顯著提高，暗示TOR可能參與綠盲蝽若蟲蛻皮以及羽化的變態行為；且AlTOR在卵巢、中腸及脂肪體中高表達暗示TOR可能參與綠盲蝽的生殖活動，這也是后續需要進行的研究工作。TOR可在蛻皮激素生成以及昆蟲蛻皮過程中發揮重要作用。同時，蛻皮激素也會抑制 TOR信號，在果蠅中，蛻皮激素會抑制幼蟲進食時脂肪體內的TOR信號，進而產生未知信號，調節胰島素生成細胞中胰島素樣肽的產生，從而控制果蠅全身性生長[32]。對家蠶的研究發現，蛻皮激素會在成蟲的不同發育階段在同一組織促進或抑制 TOR信號從而調控成蟲的生長發育[36]。在本研究中，綠盲蝽若蟲隨著齡期的增加，20E會顯著上調AlTOR的表達，卵巢和脂肪體中AlTOR的表達也會由于20E的刺激而顯著提高，表明AlTOR可能受20E調控，尤其是在“能量中心”脂肪體以及“生殖中心”卵巢中。細胞膜上的磷脂酶C是參與20E信號轉導的關鍵酶，磷脂酶C可水解磷酯酰肌醇二磷酸成為第二信使IP3和DAG傳遞激素，神經遞質和生長因子等信號行使其功能[37]。GU等研究表明，TOR信號參與家蠶前胸腺中促前胸腺激素誘導的20E合成，且磷脂酶C參與這個過程，當使用U73122抑制磷脂酶C時，會導致20E的合成受阻[38-39]。在本研究中，20E抑制劑U73211處理后，AlTOR在中腸和脂肪體中表達量顯著下降，而 20E處理后，AlTOR在中腸和脂肪體中表達量顯著上調，暗示磷脂酶C可能參與20E對AlTOR的調控。

可溶性蛋白質的異源表達已經有較多的表達系統可用，目前很多可溶性蛋白以融合蛋白的形式得到成功表達[40-41]。本研究成功構建了pCzn1-AlTOR原核表達載體，并發現在20℃ 0.5 mmol·L-1IPTG誘導12 h的條件下可大量表達AlTOR蛋白，之后通過變性、復性、蛋白純化獲得了純化的靶蛋白。通過免疫新西蘭白兔4次之后，采血檢測，ELISA方法確定抗血清針對TOR蛋白的效價，通過ELISA檢測效價得出，TOR抗體效價在512 000左右，純度在85%以上，獲得純化的抗體為5.46 mg。Western blot分析結果也表明該多克隆抗體可同時與綠盲蝽總蛋白及 AlTOR重組蛋白特異性結合，為進一步在蛋白層面研究TOR的功能打下了良好基礎。

4 結論

AlTOR在綠盲蝽體內的表達譜顯示出發育階段特異性和組織特異性；20E及其抑制劑誘導后，AlTOR呈現出相反的應答反應；本研究獲得的AlTOR重組蛋白的多克隆抗體具有高特異性。