病毒誘導基因沉默在蔬菜作物上應用的研究進展

李杰，羅江宏，楊萍

紅河學院生命科學與技術學院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點實驗室，云南蒙自 661100

我國蔬菜產業經過幾十年的發展，在產值、出口量等方面均位居農作物首位，已成為中國農民增收、加快農村發展的支柱產業，但仍然存在蔬菜品質弱、產量低等問題。目前急需挖掘與蔬菜作物重要農藝性狀相關的基因以培育優異、抗病和具有特色的品種[1-2]。隨著高通量測序技術的發展，越來越多的蔬菜作物全基因組測序已完成，但對于單個基因的功能研究，還需要更有效和可靠的技術體系。基于植物病毒與其宿主在長期進化過程中形成的共生關系，將外源基因通過病毒載體導入植物體內，可為基因挖掘和基因功能研究提供技術支持[3]。病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是利用RNA介導的植物天然抗病毒機制的一種技術，主要利用遺傳免疫方式系統性沉默某一特定基因，再經過表型鑒定和基因表達來確定靶基因在植物生長發育中的作用及對環境變化產生的應激響應。用攜帶靶基因片段的病毒來侵染植物，植物的遺傳免疫系統被激活后，植物體內與靶基因同源的RNA被特異性降解，從而發生基因沉默[4]。與傳統的轉基因、基因敲除、反義抑制等基因功能研究方法相比，VIGS技術試驗周期短，不依賴轉基因操作，具有低成本、高通量等優點[5]。近年來，VIGS技術的建立為蔬菜作物功能基因組學的研究提供了優越的條件，在基因功能的研究中得到了越來越廣泛的應用，從而促進了我國蔬菜產業的可持續發展。

本文根據國內外相關研究的最新報道，重點對VIGS技術在蔬菜作物生長發育、次生代謝、生物與非生物脅迫等幾個方面進行綜述，分析VIGS技術存在的問題及解決方法，以期為VIGS技術的進一步應用提供依據。

1 VIGS技術介紹

1.1 VIGS技術機制

VIGS是一種利用植物防御病毒入侵的自然機制來研究植物基因功能的基因轉錄抑制技術，屬于RNA干擾的一種。利用攜帶植物目的基因片段的病毒載體，通過有效的病毒侵染方式侵染植物，病毒載體在寄主體內復制和表達時，在RNA聚合酶的作用下，產生雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA），dsRNA在細胞中被特異性核酸內切酶切割產生21—25 nt的小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），siRNA能誘導與其具有同源性的植物內源基因mRNA降解，可結合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。一方面，RISC可以特異性地與細胞質中的同源RNA相互作用，使同源RNA降解，從而導致轉錄后基因沉默（PTGS）[6]；另一方面，RISC特異性地與細胞核內的同源DNA相互作用，使其被甲基化等修飾，從而產生轉錄水平的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS）[7]。

1.2 VIGS的病毒載體及應用

VIGS是目前應用最廣泛的研究植物功能基因的工具之一[8]。根據已有的研究報道，有多種病毒載體（RNA病毒、DNA病毒、衛星病毒）在VIGS上成功應用，其中 RNA病毒包括煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）、煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）、番茄金色花葉病毒（tomato golden mosaic virus，TGMV）、甘藍縮葉病毒（cabbage leaf curl virus，CbLCV）等[9]。但每種病毒載體誘導的沉默效率與宿主的選擇有關。如 PVX病毒載體在番茄上的研究發現，需要先進行體外轉錄才能進行RNA注射侵染[10]。TRV病毒載體的沉默效率高，沉默持續性長且病毒癥狀輕，因而被廣泛用于VIGS載體的構建[11]。蘋果潛隱球形病毒（apple latent spherical virus，ALSV）因病癥溫和，且在番茄上不產生病毒癥狀，而經常用于番茄基因的沉默研究[12]。DNA病毒載體構建簡單，試驗操作難度低且無需體外轉錄。其中的甜菜曲頂頭病毒（beet curly top virus，BCTV）和番茄卷曲葉病毒（tomato leaf curl virus，ToLCV）已成功用于番茄基因功能的研究[13-14]。衛星病毒基因組小，在宿主中復制速度快且易于遺傳。其中的中國番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl China virus，TYLCV）和煙草曲莖病毒（tobacco curly shoot virus，TbCSV）可高效用于番茄基因的沉默[15-16]。研究者通過傳統的“酶切-連接”方法成功構建了甜菜 WRKY轉錄因子家族成員BvWRKY23的RNA干擾（RNA interference，RNAi）表達載體[17]。

1.3 VIGS技術進展

KUMAGAI等[18]首次以八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）cDNA片段完成 TMVVIGS載體構建。經過 3年的發展，RUIZ等[19]利用PDS構建了 PVX-VIGS載體。VALENTINE等[20]以TRV病毒為載體完成了 TRV-VIGS體系的構建，TRV-VIGS體系后來常用于蔬菜作物基因沉默載體的構建。近幾年，WANG等[21]首次利用大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus，BSMV）建立了BSMVVIGS體系用于大麥基因功能的研究。張怡等[22]成功構建了大豆線蟲肌鈣蛋白（troponin C，tnc）和酰胺樣多肽（FMRFamide-like peptides，flp）基因的 TRV-VIGS體系。隨著不同病毒載體 VIGS體系研究的深入，PANDEY等[23]研究出復合病毒體系，將其他植物病毒的miRNA導入到另外一種病毒中，形成外源mirRNAs來侵染植株，開發了MIR-VIGS方法，標志著雙病毒載體應用VIGS體系的產生。趙禎等[24]運用Gateway技術成功構建了茄子（Solanumaculeatissimum）TRV-VIGS表達載體，沉默了葉片和果實的SmMsrA，表明基因克隆技術與VIGS技術的結合使用，減少了酶切環節，提高了載體構建的效率。最近，宋恬等[25]首次在扁桃花器官上建立了以TRV為載體的VIGS沉默體系，成功用攜帶pTRV2-AcCBF1的農桿菌侵染扁桃花器官且出現沉默效果。邱潤霜等[26]以番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV）N構建到pTRV-PTV00載體上，完成了TSWV介導的NVIGS載體的構建，開闊了構建病毒內源基因沉默體系的新思路。

2 VIGS技術的優點

VIGS研究基因功能的優點在于它構建簡易、周期性短、成本較低。一般構建重組載體到侵染植物進行功能鑒定只需幾周時間，因此可以大規模進行基因組序列和 EST序列的功能鑒定[27]。VIGS對于難獲突變體作物的研究優勢突出。當植物基因組較大時，利用靶基因家族的保守DNA區域，VIGS通過沉默一個基因家族的多個成員來避免功能冗余的問題，當涉及到大的蛋白質家族或基因重復時，各種點突變和插入不能產生適當的表型[28]，而 VIGS可使序列差異為10%—20%的同源基因沉默[29]。利用VIGS沉默目標基因無需靶基因的完整編碼序列，只需其中的一段 cDNA片段即可實現靶基因沉默[30]。而RNAi技術在應用時，dsRNA的合成成本過高，不利于產品的推廣[31]。CRISPR/Cas9技術實現基因編輯有賴于PAM序列，在附近無PAM序列的區域時無法進行編輯[32]。VIGS具備將 cDNA文庫整合到病毒載體上進行高通量基因篩選分析的優勢[33]。VIGS技術可用于不同蔬菜物種間比較基因組學的研究[34]。

3 VIGS在茄果類蔬菜作物中的應用

蔬菜作物分子學研究領域已進入后基因組時代[35]。應用 VIGS技術鑒定茄果類蔬菜的基因功能涉及物質合成調控、生物和非生物應激反應等方面。根據國內外近3年的最新文獻，重點介紹在茄果類蔬菜果實發育、激素調節和植物與病原微生物相互作用及非生物脅迫應答等方面利用 VIGS技術的研究進展（表1）。

表1 利用VIGS研究的茄果類蔬菜基因及其表型Table 1 List of genes silenced by VIGS and the phenotype observed in solanaceous vegetable

3.1 VIGS在茄果類蔬菜物質合成調控中的研究應用

糖類的合成與轉運在植物新陳代謝與物質循環中起著關鍵作用，同時也受到多方面的調控。利用VIGS技術，目前已經系統研究了茄果類蔬菜中糖類合成途徑中的一些關鍵調控因子的功能。通過基因編輯技術，研究基因表達的激活（activation）和抑制（repressor）[57]。例如在番茄酰基糖代謝中間產物直鏈脂肪酸（straight-chain fatty acid，SCFA）合成途徑KASII和KASIII功能的研究中，沉默該基因后，SCFA含量減少了 40%，同時沉默植株中KASII和KASIII表達量顯著降低[36]。那么糖類是如何由新葉向老葉轉運呢？最新的一項研究通過 VIGS技術沉默SWEET家族基因SISWEET1a發現，沉默番茄植株的幼葉中己糖積累量減少了50%，在成熟葉片中增加了2倍多，證明SISWEET1a在番茄葉片合成的糖分向幼葉轉運的過程中起著關鍵作用，挖掘出了SISWEET1a一個新的功能[37]，說明基因編輯技術能對家族基因中單個基因準確定位，并進行穩定改造，挖掘其基因功能[58]。

辣椒素是辣椒果實風味品質的重要指標，并且在其生長中起著防蟲防病的自我防御作用。茉莉酸（jasmonic acids，JAs）在調控辣椒素的代謝信號轉導中起著非常重要的作用，其調控因子R2R3-MYB的轉錄因子CaMYB108主要在辣椒的果實和花中表達，但是CaMYB108的下游信號尚未確定。利用VIGS技術沉默CaMYB108后發現辣椒素生物合成基因CBGs表達量降低，辣椒素含量減少，花藥開裂延遲，同時花粉活力降低。通過雙熒光素酶報告基因檢測發現，CaMYB108靶向啟動CBG。另外，茉莉酸甲酯誘導了CaMYB108和CBGs的表達，從而證實了CaMYB108參與辣椒植株雄蕊的發育以及辣椒素的合成[38]。以上研究都是基于TRV載體誘導的VIGS方法，而另外一種ALSV載體侵染植株后雖然沒有明顯的外觀特征，但其部分基因序列經過改造后也常用于VIGS體系的構建。有研究者發現，利用ALSV病毒侵染的藜麥葉片摩擦接種到辣椒上的方式并不能實現侵染，但使用ALSV病毒濃縮液則侵染成功，且沉默效率達到90%。在ALSV介導的VIGS體系中，將氨基酸轉移酶基因（pAMT）導入 ALSV病毒載體的方式成功侵染了辣椒植株，且侵染率在 80%—90%，pAMT沉默植株的辣椒素含量和辣椒素酯的積累減少。以上研究結果表明，ALSV病毒能夠用于構建VIGS體系來研究辣椒素積累的調控機制，從而可以在辣椒育種上通過基因改造來提高辣椒素的含量[39]。

番茄果實中類胡蘿卜素的積累受環境和激素的影響較大，在調控番茄果實類胡蘿卜素代謝中，螺旋-環-螺旋轉錄因子（Helix-Loop-Helix，SLAR）影響類胡蘿卜素的合成。為了挖掘SLAR的功能，研究者利用VIGS技術沉默普通番茄‘M82’和櫻桃番茄‘Micro Tom’的SLAR，發現兩個品種具有相同的表型，而且沉默后番茄紅素、總類胡蘿卜素和葉綠素含量明顯減少，驗證了SLAR直接參與番茄類胡蘿卜素的生物合成過程[40]。有研究者利用CRISPR/Cas9技術分別以八氫番茄紅素合成酶1（phytoene synthase 1，PSY1）、MYB12和花色苷2（Anthocyanin 2，ANT2）為靶位點，成功培育出黃色、粉紅色和紫色番茄[59]，但構建載體時需要準確的靶基因序列，且容易脫靶。糖苷生物堿屬于有毒物質，存在于許多茄科植物中，其合成受遺傳和環境的影響，尤其是光環境。葉綠素和類胡蘿卜素的生物合成也依賴光信號轉導途徑，同時在糖苷生物堿合成過程中具有相同的中間物質。研究者通過VIGS沉默PDS和鎂螯合酶基因CHLI與CHLH，發現沉默茄子葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量明顯降低，通過高效液相色譜和代謝物全譜分析，發現沉默植株糖苷生物堿含量顯著降低，參與糖苷生物堿合成和其他代謝物合成的基因下調表達，而且發現光合色素的積累會影響甾族類糖苷生物堿在茄子葉片中的合成[41]。在茄子果實成熟過程中，查爾酮、花青素等類黃酮物質在其角質層和表皮細胞中有所積累，類黃酮在茄子果實成熟過程中的調控機制和影響因素也利用 VIGS技術得到了解答。研究者利用VIGS技術沉默茄子查爾酮合成酶基因（SmCHS），發現沉默植株茄子果實顏色變淺，花青素含量降低，表皮細胞的大小和形狀都發生了變化，且沉默植株茄子果實的向重力性反應減輕，茄子果實彎曲，這一表型不僅說明CHS調控茄子果實中類黃酮的積累，還證明了表皮細胞的延展性依賴CHS進行表達，從而揭示了CHS的新功能[42]。許志茹等[60]利用GATEWAY技術構建了蕪菁（Brassicarapa）二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）基因過表達的RNAi載體，為鑒定DFR在依光型和非依光型花青素合成過程中的功能研究奠定了基礎。同樣是色素相關基因功能的研究，VIGS體系不需要構建植物遺傳轉化體系，大大縮短了研究進程。生長素作為植物適應環境變化和植物組織代謝的關鍵激素，其在植物離層區域如何調控植物組織離層尚不清楚。相關研究者對此展開了研究，在對番茄生長素共軛水解酶相關的5個基因功能的研究中發現，IAA-Ile參與生長素共軛水解過程，并作為候選基因存在于離層區。利用環己酰亞胺（cycloheximide，CHX）處理發現從頭合成生長素共軛水解酶抑制組織離層。利用 VIGS技術沉默番茄SlILL1、SlILL3、SlILL5、SlILL6和SlILL7，發現沉默目標基因不會影響其他SlILL的表達。同時發現離層區生長素能夠在花藥離層中發揮作用，是因為受到其濃度的影響，且SlILR1、SlILL5和SlILL6存在協同作用，而外源使用生長素后植株沉默表型明顯減弱[43]。

3.2 VIGS在茄果類蔬菜生物脅迫應答機制中的研究應用

番茄卷葉病毒（tomato leaf curl virus，TolCV）侵染番茄后誘導了乙烯反向調控途徑信號基因LeCTR1的表達。利用VIGS技術構建番茄LeCTR1沉默植株，發現沉默植株對TolCV病毒的抗性增加，卷葉癥狀減輕，活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累顯著減少，主要抗病相關基因（NPR1、PR1、PR5、AOS2、EIN2、EIN3和ERF5）表達增加，說明沉默LeCTR1可以增強番茄對卷葉病的抗性[44]。DEKs參與植物細胞的增殖、分化、衰老和死亡。利用VIGS技術沉默番茄DEK后，番茄對葡萄孢菌（Botrytiscinerea）和丁香假單胞菌（Pseudomonassyringaepv.TomatoDC3000，Pst DC3000）的抗病性降低，沉默番茄植株中ROS積累增加，而且下調了抗病基因的表達，從而證明了DEKs參與番茄抗病的基因功能[45]。細菌性枯萎病是由青枯病菌（Ralstoniasolanacearum）引起的，而其在茄子上的致病機理一直不清楚。研究者利用VIGS技術來探究亞精胺合成酶（spermidine synthase，SPDS）在茄子青枯病中的作用機理，發現接種青枯病菌后茄子SPDS被誘導表達，亞精胺（Spd）含量增加，尤其是在耐性系植株中更加明顯，推斷 Spd在茄子抗青枯病中有著重要的作用。之后又通過酵母單雜和熒光素酶報告基因試驗來驗證這一推論，發現R2R3-MYB轉錄因子SmMYB44確實可以和SPDS啟動子直接結合而誘導基因表達，進一步通過超表達SmMYB44茄子植株證明了抗青枯病的SmMYB44-SmSPDS-Spd機制[46]。在辣椒上也利用 VIGS技術證明了青枯病的防御機制，研究發現 MYB轉錄因子CaPHL8參與辣椒青枯病的防御，通過氨基酸序列分析表明PHL8為 MYB轉錄因子，接種病菌植株的CaPHL8上調表達，而且GUS活性檢測也證明了這一結論。通過VIGS技術證明了CaPHL8在辣椒抗青枯病中的作用，而且這個基因在高溫高濕條件下也不會誘導表達[47]。在番茄青枯病的研究中，利用VIGS技術沉默MTC關聯基因SAMS2、SAHH1和MS1以及GABA生物合成相關基因GAD2和SSADH1，發現高濃度和中濃度侵染的SAHH1、MS1和GAD2沉默番茄對青枯病的抗性減弱，從而驗證了MTC和GABA生物合成在番茄青枯病中的致病作用[48]。在探索粉孢菌（Oidiumneolycopersici）引起番茄白粉病的研究中，利用VIGS技術構建了ShORR-1（solanum habrochaites oidium resistance required-1）沉默株系，證明ShORR-1在番茄抗白粉病中的基因功能[49]。辣椒CaWRKY45參與抗病的功能也利用VIGS技術得以驗證[50]。

植物根系分泌物和根結線蟲均會引起土壤性狀的改變，根結線蟲也會侵染植物根系。在最新的一項關于植物、土壤和根結線蟲的報道中，研究者利用VIGS技術沉默番茄根系 ABC轉運蛋白基因ABC-C6和ABC-G33，其中ABC-C6沉默植株抑制結瘤線蟲（Meloidogynespp.）和黃金線蟲（Globoderaspp.）產卵，ABC-G33沉默株系只抑制黃金線蟲產卵。ABC-C6沉默植株對土壤農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）和枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）沒有抑制作用，但ABC-G33沉默植株對枯草芽孢桿菌具有抑制作用，發現ABC-C6在生物防治根結線蟲上的重要作用，從而證明了 ABC轉運蛋白基因在土壤根系分泌物和線蟲之間的關系，為保護植物免受線蟲侵染提供了依據[51]。在茄子上的研究發現，核苷酸結合位點富含亮氨酸的重復序列nucleotide-binding site leucine-rich repeat（NBS-LRR）抗逆基因SacMi，在接種線蟲的植株中該基因表達量上調，沉默SacMi植株表現出對線蟲的敏感性[52]。

3.3 VIGS在茄果類蔬菜非生物脅迫應答機制中的研究應用

CaWRKY27能夠正調控辣椒植株對細菌性青枯病的抗性，同時負調控植株的耐熱性。研究者利用VIGS技術沉默CaWRKY27，發現沉默的辣椒植株對鹽脅迫和滲透脅迫抗性顯著增強，還發現CaWRKY27不僅在辣椒逆境脅迫中是轉錄激活因子，而且還能編碼抗逆境阻遏蛋白[53]。谷胱甘肽轉移酶基因（GSTU43）參與了5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）誘導的抗氧化脅迫，并調節低溫脅迫下葉綠素的合成。利用VIGS技術沉默GSTU43后，發現沉默植株中谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、抗壞血酸氧化酶和谷胱甘肽還原酶活性降低，膜脂過氧化物含量增加，而外源ALA處理后這些指標均恢復，說明ALA可引起由GSTU43編碼的GST增加，從而增強番茄對低溫引起的氧化脅迫抗性[54]。研究人員在番茄中利用CRISPR/Cas9系統構建 CRISPR-BZR1突變體，證實BZR1還通過調節細胞膜受體蛋白激酶FERONIA基因（FER）參與番茄的耐熱性[61]，但整個番茄植株材料均在bzr1突變體的基礎上才能完成。

F-box蛋白、CaDIF1（辣椒干旱誘導F-box protein1基因）可以由ABA、干旱脅迫、H2O2和NaCl脅迫誘導表達，CaDIF1沉默株系展現出干旱敏感性，而超表達株系展現出 ABA敏感性和干旱耐性。利用酵母雙雜交試驗確定了CaDIS1（辣椒 DIF1-Interacting SKP1）在細胞質和細胞核中與CaDIF1存在互作現象。CaDIF1和CaDIS1沉默株系表現出對ABA不敏感以及干旱耐性降低，且兩種植株葉片氣孔變大和蒸騰速率增加，進一步說明CaDIF1和CaDIS1可互作，并且參與依賴 ABA信號轉導的干旱脅迫抗性過程[55]。研究者也利用VIGS技術揭示了MYB80參與調控辣椒低溫脅迫的機制，發現低溫處理下MYB80沉默植株抗冷性減弱[56]。

4 VIGS在瓜類、葉菜類和豆類蔬菜作物中的應用

表2列舉了利用VIGS技術沉默瓜類、葉菜類和豆類蔬菜相關功能基因及沉默后的表型。瓜類蔬菜有黃瓜、西葫蘆、絲瓜、香瓜和西瓜等，VIGS試驗一般使用ALSV病毒作為載體侵染葫蘆科作物[69]。克隆黃瓜葉片PDS和SU（300 bp），分別構建ALSV-PDS和 ALSV-SU兩個載體侵染葫蘆科植物的子葉，沉默植株分別表現出光漂白和黃葉表型，說明導入ALSV-PDS和ALSV-SU載體的植物內源PDS和SU被沉默，表明ALSV介導的VIGS體系成功構建[28]。研究者還利用 TRV介導的 VIGS技術構建黃瓜glycerol-3-phosphate 2-O-acyltransferase 6（GPAT6）基因沉默體系，探究GPAT6在黃瓜自毒脅迫中的功能，沉默植株表現出對自毒物質肉桂酸的抗性增強[62]。在甜瓜（Cucumismelovar.makuwaMakino）CmLOX10功能驗證中，沉默植株CmLOX10表達量下調，pTRV-CmPDS沉默植株葉片出現白化現象，綠色熒光蛋白（GFP）檢測的結果進一步確認了沉默現象，證明 TRV病毒誘導的基因沉默體系在甜瓜上構建成功[63]。

表2 利用VIGS研究的瓜類、葉菜類和豆類蔬菜基因及其表型Table 2 List of genes silenced by VIGS and the phenotype observed in melon, leaf and legume vegetable

蕪菁黃化花葉病毒（turnip yellow mosaic virus，TYMV）具有正義 RNA鏈，可以侵染許多十字花科植物。例如以白菜（B.rapassp.pekinensiscv.Bre）BcPDS和BcNRT1為靶基因，從BcPDS和BcNRT1中選取合適的40 bp序列，反向互補處理后用T4連接酶進行連接，分別構建pTY-BcPDS和pTY-BcNRT1載體。白菜植株被 pTY-BcPDS侵染可導致白菜中該基因的表達顯著降低，沉默效果比較明顯；pTY-BcNRT1侵染白菜植株，顯著抑制了BcNRT1在轉錄水平的表達[29]。最近的一項關于白菜包心緊實度受轉錄輔激活因子 ANGUSTIFOLIA3（AN3）的研究中，也利用TYMV-VIGS技術，發現基因沉默的白菜在蓮座期和團棵期AN3都下調表達，證明基因沉默刺激了白菜葉片包心的形成[66]。

在菠菜雌花發育機制的研究中，通過甜菜曲頂病毒（beet curly top virus，BCTV）誘導的VIGS體系，對DELLA家族轉錄因子SpGAI在GA參與雌花形成中的基因功能得到了驗證。沉默SpGAI后雌花表現出雄花器官的表型特征，中度表型是發育一個雄蕊代替雌蕊，但仍產生兩個萼片；重度表型是發育4個萼片、1個雌蕊和1個雄蕊，同時花有4個萼片，類似于藜科植物中的完全花。沉默SpGAI后雄花發育成野生型雄花，但對外觀表型沒有影響[64]。MA 等[70]以甘藍BoPDS為靶基因，利用CRISPR/Cas9系統實現甘藍基因組的精準編輯，主要是依賴單鏈向導 RNA表達基因來完成突變體的構建，與VIGS技術相比，構建程序復雜，且目標基因在核苷酸預期位置容易缺失。在研究葉用萵苣熱脅迫下Hsp70表達量和形態變化時，研究者構建pTRV-LsHsp702711沉默體系，發現未進行脅迫處理的沉默植株LsHsp70-2711表達量下降，莖明顯伸長，熱脅迫和干旱處理后的沉默植株LsHsp70-2711表達量顯著低于對照植株，且高溫脅迫對sHsp70-2711的影響大于干旱脅迫[65]。

CONSTANTIN等[71]利用豌豆早枯病毒（pea early browning virus，PEBV）研發了一套有效的VIGS體系，使得在豌豆中利用反向遺傳學方法研究基因功能成為可能。在研究ROS、Ca2+參與豌豆葉綠素合成的研究中，利用VIGS技術構建了葉綠素合成關鍵基因CHLI沉默體系，采用組織化學和熒光染色試驗發現沉默豌豆植株中ROS和胞間游離Ca2+增多，且豌豆發黃葉片中產生超氧陰離子和過氧化氫[67]。研究者還利用VIGS技術沉默了豌豆質膜水通道蛋白基因PsPIP2;1，發現沉默植株的葉片和根系中PsPIP2;1下調表達，從而證明豌豆葉片和根系水分運輸中PsPIP2;1對水通道蛋白具有調節作用[68]。ZHANG等[72]利用菜豆莢斑駁病毒（bean pod mottle virus，BPMV）在大豆上成功建立了VIGS體系，且該病毒載體能夠應用于大豆、菜豆等豆類蔬菜上，改造后拓展了BPMV病毒的宿主范圍。

5 VIGS技術的不足之處和研究展望

盡管VIGS技術自被開發以來，已在許多蔬菜作物的基因功能鑒定研究中發揮了重要作用，同時建立了多種有效的VIGS載體，但是還存在一定的局限性。首先，沉默茄果類蔬菜后植株的沉默表型不均一、表型難以辨識，如在沉默番茄、辣椒等果實顏色相關基因時，表現出沉默植株表型不均一；再比如，利用ALSV病毒侵染的藜麥葉片摩擦接種到辣椒上并不能成功侵染，沉默植株表型不均一，但使用ALSV病毒濃縮液則侵染成功，且沉默效率達到90%。其次，VIGS技術存在靶基因沉默不完全、功能敲除不徹底、脫靶沉默和干擾癥狀等現象，如同時沉默番茄的兩個基因SlEBF和SlEBF2后發現植株表現出敗育和生長緩慢等一系列表型，影響了2個基因功能的研究；再者，這種瞬時沉默技術的穩定性和持續時間較差，且無法穩定遺傳。另外，基因家族功能冗余情況也會因缺乏某一特定家族成員基因完整序列而導致干擾；此外，環境因素如溫度、濕度和光照等可影響病毒在宿主植物中的擴散速度，其中溫度對病毒粒子的擴散起主要作用。如 TRV病毒侵染番茄時，較好的沉默表型在22℃或者更低的溫度下才能發生。應用VIGS技術的困擾因素還有農桿菌的保存期短、農桿菌活性以及擴繁效率低，因此，建立并優化農桿菌擴繁發酵技術與工藝也是今后努力的方向[73]。VIGS載體種類仍然有限，因此限制了VIGS技術的廣泛應用[74]。

VIGS自被開發以來，已經開始應用于蔬菜作物病毒病的預防和控制、雜草的防控和蔬菜作物重要生長階段的調控等領域，改變了傳統的化學農藥防治方法。例如，NEENA等[75]使用一種納米材料 BioClay裝載dsRNA并沉默同源RNA，以控制煙草病毒病的傳播。目前，一些農業化工企業已經開始研發相關技術和產品[76]。未來會有相關產品取代傳統的化學農藥[77]。在優化VIGS技術方面，為避免脫靶現象，可利用不同種類的核酸數據庫和在線軟件精確設計靶基因序列，以提高靶基因沉默的準確度。此外，病毒載體可從RNA病毒、DNA病毒載體、衛星病毒等多種載體中選擇適用于不同種類蔬菜作物的沉默載體。今后隨著VIGS技術的不斷發展，主要研究的方向可從以下幾個方面進行研究：一是開發特異性與穩定性更高的病毒載體；二是優化病毒侵染后植株的培養條件，如光照、溫度等方面進行系統研究，提高基因沉默的穩定性；三是果菜類蔬菜果實離體VIGS技術的研發，以便用于果實采后保鮮；四是提高VIGS誘導基因沉默的持續時間，從而實現在蔬菜長季節栽培過程中生長發育調控基因功能的研究；五是選擇高效的基因片段進行沉默，以提高基因沉默的準確性。最后是病毒載體的安全性問題，病毒是作物的重要病原物，且大多數植物病毒都能以昆蟲為媒介進行傳播。所以，在構建VIGS病毒載體時應對病毒載體進行修飾，使其不引起嚴重癥狀或被介體傳播，試驗結束后對試驗材料進行合理規范處理以免造成病毒傳播。

RNAi能夠特異性地降低或關閉靶基因表達，是基因功能研究的重要手段，但很難控制靶基因的沉默效率，且需要很長一段時間來建立遺傳轉化體系，大大增加了科研工作者的時間成本，降低了研究效率[78]。CRISPR/Cas9技術雖然具有一次編輯多個基因的功能優勢，但存在脫靶效應，且對于多倍體植物而言，基因組改造的難度很大[79-80]。VIGS技術在選擇目的基因靶位序列時，對插入片段的方向并無要求，且不易脫靶[81-82]。因此，隨著高通量測序等新技術的不斷研發和VIGS技術的優化，基于非編碼的單鏈小分子RNA構建的VIGS技術，可以用于農作物新品種目標基因的高通量快速篩選，促進了蔬菜基因工程和蔬菜作物改良以及分子育種的發展，推進生產不攜帶外源基因的蔬菜品種育成的進程[83]。相信VIGS作為高效的研究基因功能的技術在蔬菜作物上的應用必將被逐步完善，在蔬菜功能基因組學研究的應用前景會更加廣泛。